Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Morgridge Institut für Forschung und der University of Wisconsin-Stiftung unterstützt. Wir danken Krista Eastman für redaktionelle Unterstützung.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Die Autoren offenbaren, dass JAT einer der Gründer, Aktionärskapitalismus abgelöst, Berater und Vorstandsmitglied von Cellular Dynamics International (CDI) ist. Er dient auch als wissenschaftlicher Berater und finanziellen Interessen in Tactics II Stem Cell Ventures.

Aktuelle Protokolle für die Herstellung gepaart Ende Bibliotheken benötigen zwischen 1 pg 9 bis 2,5 pg 10 ab Höhe der Gesamt-RNA. Hier präsentieren wir unsere lineare T7 Amplifikation (T7LA)-Methode, um sowohl ein Lese-und gepaart Ende Illumina Sequenzierung Bibliotheken und Show vorzubereiten, dass diese Methode ermöglicht die Erstellung von Bibliotheken aus so niedrig wie 10 ng Gesamt-RNA, Herstellung Daten, die vergleichbar mit der ist minimal verstärkt (MinAmp) Bibliotheken von 1000 fold Ausgangsmaterial mehr (10 ug Gesamt-RNA) hergestellt. Die 10 ng Bibliotheken nicht nur identifizieren, ähnlich Gesamtzahl der Gene, sondern auch zu produzieren Genexpressionssignaturen, die ähnlich sind (Abb. 3a und b). Darüber hinaus sind sowohl die einzelnen Lese-und gepaart Ende Bibliotheken durch die T7LA Verfahren hergestellte sehr ähnlich zueinander (Abbildung 3c), denen die Forscher die Daten von Bibliotheken aus beiden Protokolle erwirtschaftet vergleichen können. Da diese Bibliotheken aus humanen embryonalen Stammzellen RNA bereit waren, suchten wirfür 30 Stammzell-spezifische Gene unter den Bibliotheken und feststellen, dass fast alle diese Gene (93-100%) durch die Bibliotheken von mindestens 10 ng Gesamt-RNA ab (Abbildung 4) gemacht werden identifiziert, damit die Validierung unseres Protokolls. Wir glauben, dass unser Protokoll wäre sehr nützlich für die Forscher, besonders in Fällen wie flow sortierten Zellen oder Laser-Mikro-seziert Gewebe, in dem Ausgangsmaterial ist begrenzt. In einem solchen Fall würde unser Protokoll erlauben Generation von Genexpressionsdaten vergleichbar mit Bibliotheken aus viel größeren Mengen ab gemacht, da unser Protokoll produziert Expressionsprofile vergleichbar mindestens 3 Größenordnungen der Ausgangs-RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Firma </td><td> Kit / Reagent </td><td> Catalog # </td><td> Besondere </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentation Reagenz </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrylamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Nicht DEPC behandelt Nuclease freies Wasser </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP Set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> methylierte dNTPs </td><td> R0431 </td><td> Für Single Read Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster-Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Für Single Read Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 Zyklen </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Für Single Read Probenvorbereitung nur. Kann mit NEB DNA Probenvorbereitung Master Mix ersetzt Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster-Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Für gepaart Ende Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Gepaart End Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Für gepaart Ende Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb Plus Leiter </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2. Strang-Puffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli-DNA-Polymerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-Gel SYBR Safe 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript III (mit 5-fach FS-Puffer und 0,1 M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit Assay-Kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS Qubit-Assay-Kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli-DNA-Ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA Polymerase </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure Dnase Rnase Wasser </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript II doppelsträngigen cDNA-Synthese-Kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Random Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Für gepaart Ende Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B Primer </td><td> N / A </td><td> Für Single Read samPLE prep nur </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 Verdauung kit </td><td> R0189S </td><td> Für Single Read Probenvorbereitung nur </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel Purification Kit </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase Set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Forschung </td><td> DNA sauber und Konzentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Whole Transkriptom-Sequenzierung von mRNA-Seq ist nun weitgehend auf globale Genexpression, Mutation, Allel-spezifische Expression und anderen genomweiten Analysen durchzuführen verwendet. mRNA-Seq selbst öffnet das Tor zur Genexpressionsanalyse der nicht-sequenzierten Genomen. mRNA-Seq bietet eine hohe Empfindlichkeit, einen großen Dynamikbereich und erlaubt die Messung der Niederschrift Kopienzahl in einer Probe. Illumina Genome Analyzer führt die Sequenzierung einer großen Anzahl (&gt; 10 7) von relativ kurzer Sequenzabschnitte (&lt;150 bp). Der &quot;paired end&quot;-Ansatz, wobei eine einzelne lange lesen an seinen beiden Enden ist sequenziert, erlaubt für die Verfolgung von alternativen Spleißstellen , Insertionen und Deletionen, und ist für de novo Transkriptom Montage nützlich. Eine der wichtigsten Herausforderungen, denen Forscher gegenüberstehen wird eine begrenzte Menge des Ausgangsmaterials. Zum Beispiel in Experimenten, bei denen Zellen durch Laser-Mikrodissektion, zur Verfügung geerntet werden ab Gesamt-RNA may Maßnahme Nanogramm. Vorbereitung der mRNA-Seq-Bibliotheken aus solchen Proben wurden 1, 2 beschrieben, aber mit erheblichen PCR-Amplifikation, dass Bias einführen kann. Andere RNA-Seq Bibliothek Bauverfahren mit minimalen PCR-Amplifikation wurden 3, 4 veröffentlicht, aber benötigen Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA ab. Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Illumina Genome Analyzer II Plattform für mRNA-Seq-Sequenzierung für die Bibliothek Vorbereitung, die erhebliche PCR-Amplifikation vermeidet und benötigt nur 10 Nanogramm Gesamt-RNA. Während dieses Protokoll wurde zuvor auch für Single-End-Sequenzierung 5, wo sie gezeigt, dass direktionale Bibliotheken, ohne dabei signifikante Verstärkung Bias produzieren beschrieben wurde validiert, hier sind wir zu validieren es weiter für die Verwendung als ein gekoppeltes Ende-Protokoll. Wir selektiv zu verstärken polyadenyliert Boten-RNAs aus beginnend Gesamt-RNA mit der T7 basiert Eberwine lineare Verstärkung Methode geprägt &quot;T7LA &quot;(T7 lineare Verstärkung). Die verstärkten Poly-A-mRNAs fragmentiert sind, revers transkribiert und Adapter ligiert, um die endgültige Sequenzierung Bibliothek zu erzeugen. Für beide gelesen und gepaart Ende läuft, Sequenzen des menschlichen Transkriptom 6 sind abgebildet und so normiert, dass Daten aus mehreren Läufen kann verglichen werden. Wir berichten über die Messung der Genexpression in Einheiten von Transkripten pro Million (TPM), die eine überlegene Maßnahme RPKM beim Vergleich Proben 7 ist.

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung der beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Illumina mRNA-Seq-Sequenzierung Bibliotheken zur Genexpressionsanalyse auf T7 lineare RNA-Amplifikation basieren. Dieses Protokoll erfordert nur 10 Nanogramm ab Gesamt-RNA und erzeugt sehr konsistent Bibliotheken für ganze Transkripte.

Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

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39.0K Aufrufe.  Morgridge Institute for Research. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung der beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Illumina mRNA-Seq-Sequenzierung Bibliotheken zur Genexpressionsanalyse auf T7 lineare RNA-Amplifikation basieren. Dieses Protokoll erfordert nur 10 Nanogramm ab Gesamt-RNA und erzeugt sehr konsistent Bibliotheken für ganze Transkripte.