Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Morgridge Istituto per la Ricerca e l&#39;Università del Wisconsin Fondazione. Ringraziamo Krista Eastman per l&#39;assistenza editoriale.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Gli autori rivelare che JAT è uno dei fondatori, stockowner, consulente e membro del consiglio di Cellular Dynamics International (CDI). Si serve anche come consulente scientifico e ha interessi finanziari in joint sulle cellule staminali Tactics II.

Attuali protocolli per rendere le biblioteche fine abbinato richiedono tra 1 mg 9-2,5 mcg 10 importo iniziale di RNA totale. Qui vi presentiamo il nostro lineare di amplificazione basato T7 (T7LA) per preparare sia letto singolo e associato biblioteche Illumina fine di sequenziamento e dimostrare che questo metodo permette la generazione di librerie da un minimo di 10 ng di RNA totale, producendo dati paragonabile a quella di minimamente amplificato (MinAmp) librerie fatte da 1000 volte più materiale di partenza (10 mcg totale RNA). Le 10 librerie ng non solo di identificare simili numero totale di geni, ma anche produrre firme di espressione genica che sono simili (Figure 3a e b). Inoltre, sia le singole biblioteche fine leggere e associato ottenuti con il metodo T7LA sono molto simili tra loro (Figura 3c), che permette ai ricercatori di confrontare i dati generati dalle biblioteche fatto da uno dei due protocolli. Dal momento che queste librerie sono state preparate da RNA di cellule staminali embrionali, abbiamo cercatoper i geni specifici delle cellule staminali 30 tra le librerie e scoprire che quasi tutti questi geni (93-100%) sono identificati con le librerie base di almeno 10 ng di RNA totale di partenza (Figura 4), convalidando così il nostro protocollo. Crediamo che il nostro protocollo sarebbe molto utile per i ricercatori, soprattutto in circostanze come celle di flusso ordinato o laser-micro-tessuto sezionato in cui il materiale di partenza è limitante. In tali circostanze, il nostro protocollo permetterebbe la generazione di dati di espressione genica simile a biblioteche fatto da molto più grande quantità a partire dal nostro protocollo produce profili di espressione comparabili tra almeno 3 ordini di grandezza di RNA di partenza.

<table border="1"><tbody><tr><td> Azienda </td><td> Kit / reagente </td><td> Catalogo </td><td> Commenti speciale </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> La frammentazione del reagente </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrilamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC non trattato nucleasi acqua libera </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP metilato </td><td> R0431 </td><td> Per singola preparazione del campione di sola lettura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Per singola preparazione del campione di sola lettura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cicli </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Per singola preparazione del campione di sola lettura. Può essere sostituito con il campione di DNA ONA Mix di preparazione Master Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Per la preparazione del campione solo fine accoppiato </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Accoppiati End Kit campione Prep </td><td> PE-102-1001 </td><td> Per la preparazione del campione solo fine accoppiato </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb scala più </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Secondo filone di buffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimerasi </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR sicuro il 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Apice III (con 5X FS tampone e 0,1 M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit test kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit test kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligasi </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> DNA polimerasi T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure DNasi RNase acqua </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Apice II a doppio filamento kit di sintesi del DNA </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Primer random (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Per la preparazione del campione solo fine accoppiato </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B Primer </td><td> N / A </td><td> Per le singole Leggi samPLE di preparazione solo </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 digestione kit </td><td> R0189S </td><td> Per singola preparazione del campione di sola lettura </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel kit di purificazione </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNasi set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo ricerca </td><td> DNA pulito e concentratore (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Sequenziamento del trascrittoma intero mRNA-Seq è ormai ampiamente utilizzata per eseguire l&#39;espressione genica globale, la mutazione, allele-specifica espressione e di altri genoma analisi. mRNA-Seq apre anche la porta per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica di non genomi sequenziati. mRNA-Seq offre alta sensibilità, un&#39;ampia gamma dinamica e consente di misurare numero di copie di trascrizione in un campione. Analizzatore del genoma Illumina effettua il sequenziamento di un numero elevato (&gt; 10 7) della sequenza relativamente breve, si legge (&lt;150 bp). Il &quot;abbinato fine&quot; approccio, in cui un letto singolo lungo è sequenziato ad entrambe le sue estremità, consente di seguire giunzioni di splicing alternativo , inserimenti ed eliminazioni, ed è utile per il montaggio de novo trascrittoma. Una delle sfide principali affrontate dai ricercatori è una quantità limitata di materiale di partenza. Per esempio, in esperimenti in cui vengono raccolte le cellule con il laser micro-dissezione, disponibile a partire da RNA totale may misura in nanogrammi. Preparazione di mRNA-Seq librerie da tali campioni sono stati descritti 1, 2 ma prevede un uso intensivo di amplificazione che possono introdurre distorsioni. Altri RNA-Seq procedure di costruzione della libreria con il minimo di amplificazione sono stati pubblicati 3, 4 ma richiedono quantità microgrammo di RNA totale di partenza. Qui descriviamo un protocollo per la piattaforma Illumina Genome Analyzer II per mRNA-Seq sequenziamento per la preparazione della libreria che evita significativi di amplificazione e richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale. Anche se questo protocollo è stato descritto in precedenza e validato per single-end sequenziamento 5, dove è stato dimostrato che per produrre librerie direzionali, senza introdurre distorsioni significative amplificazione, qui lo abbiamo validare ulteriormente per essere utilizzato come protocollo di fine appaiati. Noi amplificare selettivamente RNA messaggeri polyadenylated l&#39;avvio RNA totale utilizzando il metodo basato T7 amplificazione lineare Eberwine, coniato &quot;T7LA &quot;(T7 amplificazione lineare). Amplificato La poly-A mRNA sono frammentati, trascrizione inversa e l&#39;adattatore legatura per produrre la sequenza finale biblioteca. Per entrambe le corse singole in lettura e associato, le sequenze vengono mappati al trascrittoma umano 6 e normalizzata in modo che dati provenienti da più esecuzioni può essere paragonato. Riportiamo la misura dell&#39;espressione genica in unità di trascrizioni per milione (TPM), che è una misura superiore a RPKM quando si confrontano i campioni 7.

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l&#39;analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell&#39;RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.

Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

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39.0K Views.  Morgridge Institute for Research. Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l'analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell'RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.