Bu çalışma, Wisconsin Vakfı Araştırma ve Üniversitesi Morgridge Enstitüsü fon tarafından desteklenmiştir. Krista Eastman editoryal yardımlarından dolayı teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Yazarlar JAT Hücresel Dynamics International (CDI) kurucusu, stockowner, danışman ve yönetim kurulu üyesi olduğunu açıkladı. Ayrıca bilimsel danışman olarak hizmet vermekte ve Taktikler II Kök Hücre Ventures mali çıkarları var.

Eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler yapmak için mevcut protokoller, 1 mg 9 - 2,5 mg 10 total RNA başlangıç ​​miktarı arasında gerektirir. Burada bu yöntem sağlar hem de tek bir okuma ve eşli sonuna Illumina sıralama kütüphaneler ve gösteri hazırlamak için doğrusal T7 amplifikasyon temelli (T7LA) yöntemi ile karşılaştırılabilir veri üreten toplam RNA düşük olarak 10 ng kütüphaneler, nesil en az 1000 kat daha başlangıç ​​materyalinin (10 mikrogram total RNA) yapılan amplifiye (MinAmp) kütüphaneleri. 10 ng kütüphaneler, sadece genlerin benzer sayıların toplamı, tespit, ama aynı zamanda (Şekil 3a ve b) benzer gen ekspresyonu imzalar üretmek değil. Ayrıca, T7LA yöntemi ile üretilen tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna kütüphaneler hem de araştırmacılar ya da protokol yapılmış kütüphaneler tarafından üretilen verileri karşılaştırmak sağlar (Şekil 3c) birbirlerine çok benzer. Bu kütüphanelerin, insan embriyonik kök hücre RNA hazırlanan bu yana, biz aramakütüphaneleri arasında 30 kök hücre spesifik genler ve bu genlerin hemen hemen tüm (% 93-100), böylece protokolü doğrularken total RNA (Şekil 4) başlayarak en az 10 ng yapılan kütüphaneler tarafından tespit olduğunu bulmak. Biz bizim protokolü akış sıralanmış hücreleri veya başlangıç ​​materyali sınırlayan lazer-mikro-disseke doku gibi durumlarda, özellikle araştırmacılar için çok faydalı olacağını inanıyorum. Bu gibi durumlarda, protokol gen ekspresyonu verileri nesil bizim protokol başlangıç ​​RNA büyüklüğü en az 3 emirleri arasında karşılaştırılabilir ifade profilleri üreten bu yana çok daha büyük bir başlangıç ​​miktarlarda yapılan kütüphaneler karşılaştırılabilir izin verecek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Şirket </td><td> Seti / reaktif </td><td> Katalog # </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Parçalanma reaktif </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Kalemi Akrilamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kiti </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Sigara DEPC nükleaz ücretsiz su tedavi </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP seti </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> metillenmiş dNTP </td><td> R0431 </td><td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Küme Nesil kiti v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 döngüleri </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Örnek Hazırlık Seti </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece. NEB DNA numune hazırlık Master Mix ile değiştirilebilir Set 1 Kedi # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Küme Nesil kiti v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Sadece eşleştirilmiş sonunda numune hazırlık için </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Eşleştirilmiş Sona örnek Hazırlık Seti </td><td> PE-102-1001 </td><td> Sadece eşleştirilmiş sonunda numune hazırlık için </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB artı merdiven </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Çıkışı </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2. iplikçik tampon 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimeraz </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-jel SYBR güvenli% 2 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Üstsimge III (5X FS tampon ve 0.1M DTT ile) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit tahlil kiti </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit testi kiti </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligaz </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA Polimeraz </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Saf Dnase Rnase su </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Üstsimge II çift zincirli cDNA sentezi kiti </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rastgele Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Sadece eşleştirilmiş sonunda numune hazırlık için </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B astar </td><td> N / A </td><td> Tek kişilik oda için samÖrneğin hazırlık sadece </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 sindirim kiti </td><td> R0189S </td><td> Tek okuyun örnek hazırlık için sadece </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kiti </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Jel saflaştırma kiti </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase seti </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kiti </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Araştırma </td><td> DNA temiz ve konsantratör (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

MRNA Seq ile Tüm transcriptome sıralama artık global gen ekspresyonu, mutasyon, allel spesifik ifadesi ve diğer genom analizleri gerçekleştirmek için yaygın olarak kullanılır. mRNA-Seq bile olmayan sıralı genomların gen ekspresyon analizi için kapı açılır. mRNA-Seq yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık sunar ve bir örnek transkript kopya numaraları ölçümünü sağlar. Illumina Kullanıcı genom analizörü, bir tek uzun okuma neyin &quot;eşleştirilmiş sonuna&quot; bir yaklaşım, hem de kendi biter sıralı.. Bir büyük nispeten kısa dizisi sayısı (&gt; 10 7) (&lt;150 bp) okur sıralama yapar alternatif ek kavşakları izleme sağlar , eklemeler ve silmeler, ve de novo transcriptome montaj için yararlıdır. Araştırmacılar tarafından karşılaştığı en önemli sorunlardan biri de sınırlı bir miktarda malzeme başlangıç. Örneğin, deneylerde hücreler lazer mikro-diseksiyonu, hasat başlangıç ​​total RNA mnanogram ölçü ay. MRNA Seq kütüphaneler bu tür numunelerin hazırlanması 1, 2 tarif edilmiştir ancak önyargı tanıtmak önemli PCR içerir. Minimal PCR ile RNA Sıra kütüphane yapım prosedürleri, 3, 4 yayınlanmış olmasına rağmen, toplam RNA başlayan mikrogram miktarlarda ihtiyaç var. Burada önemli PCR önler ve total RNA sadece 10 nanogram gerektirir kütüphane hazırlanması için mRNA Seq sıralama için Illumina Genom Analyzer II platformu için bir protokol. Bu protokol tanıtan önemli bir amplifikasyon önyargı olmadan yönlü kütüphaneleri üretmek için gösterilen tek sonunda sıralama 5, daha önce açıklanan ve onaylanmıştır olmasına karşın, biz burada eşleştirilmiş bir protokol olarak kullanmak için daha da doğrulamak. Biz seçici icat &quot;T7, T7 tabanlı Eberwine doğrusal amplifikasyon yöntemi kullanılarak toplam RNA başlayarak polyadenylated haberci RNA&#39;lar yükseltmekLA &quot;(T7 lineer amplifikasyon). Amplifiye poli-A mRNA&#39;ların parçalanmış, transkripsiyonu ve adaptör final sıralama kütüphanesi üretmek için bağlandı tersine her ikisi de tek bir okuma ve eşli sonuna çalışır, diziler insan transcriptome 6 eşleştirilir ve böylece normalize birden çok çalışır verileri mukayese edilebilir. numuneleri 7 karşılaştırırken RPKM üstün bir ölçü, bir milyon kişi başına transkript birimlerinde gen ekspresyonu ölçümü (TPM), rapor .

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Burada T7 lineer RNA amplifikasyon dayalı gen ekspresyon analizi için iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna Illumina mRNA Seq sıralama kütüphaneler hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, toplam RNA başlayan sadece 10 nanogram gerektirir ve tüm transkript temsil eden son derece tutarlı bir kütüphane oluşturur.

10 nanogram Total RNA tek okuyun ve Eşleştirilmiş Sona mRNA-Seq Illumina Kütüphaneler

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

39.0K Görüntüleme.  Morgridge Institute for Research. Burada T7 lineer RNA amplifikasyon dayalı gen ekspresyon analizi için iki tek okudum ve eşleştirilmiş sonuna Illumina mRNA Seq sıralama kütüphaneler hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, toplam RNA başlayan sadece 10 nanogram gerektirir ve tüm transkript temsil eden son derece tutarlı bir kütüphane oluşturur.