이 작품은 연구와 위스콘신 재단의 대학 Morgridge 연구소의 자금 지원에 의해 지원되었다. 우리는 편집 지원 크리스타 이스트만 주셔서 감사합니다.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

저자는 잣은 세포 역학 국제 (CDI)의 설립자, stockowner, 컨설턴트 및 이사회의 구성원임을 공개. 그는 또한 과학 고문 역할과 전술 II의 줄기 세포 벤처 금융 이익 있습니다.

Current protocols for making paired end libraries require between 1 &mu;g9 to 2.5 &mu;g10 starting amount of total RNA. Here we present our linear T7 amplification based (T7LA) method to prepare both single read and paired end Illumina sequencing libraries and show that this method allows generation of libraries from as low as 10 ng of total RNA, producing data that is comparable to that of minimally amplified (MinAmp) libraries made from 1000 fold more starting material (10 &mu;g total RNA). The 10 ng libraries not only identify similar total numbers of genes, but also produce gene expression signatures that are similar (Figures 3a and b). Moreover, both the single read and paired end libraries produced by the T7LA method are very similar to each other (Figure 3c), which allows researchers to compare data generated by libraries made from either protocol. Since these libraries were prepared from human embryonic stem cell RNA, we searched for 30 stem cell specific genes among the libraries and find that almost all of these genes (93-100%) are identified by the libraries made from at least 10 ng of starting total RNA (Figure 4), thus validating our protocol. We believe our protocol would be very useful for researchers, especially in circumstances such as flow sorted cells or laser-micro-dissected tissue where starting material is limiting. In such circumstances, our protocol would allow generation of gene expression data comparable to libraries made from much larger starting quantities since our protocol produces expression profiles comparable across at least 3 orders of magnitude of starting RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> 회사 </td><td> 키트 / 시약 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 특별 코멘트 </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> 파쇄 시약 </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> 라이너 아크릴 아미드 </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 키트 </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> 비 DEPC는 nuclease 무료로 물을 처리 </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP 세트 </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> methylated dNTPs </td><td> R0431 </td><td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR 클러스터 생성 키트 V5 </td><td> GD - 203-5001 </td><td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq 키트 V5 36주기 </td><td> FC - 104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> 칩 Seq 샘플 준비 키트 </td><td> IP - 102-1001 </td&gt; <td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만. 코 DNA 샘플 준비 마스터 믹스로 교체할 수 있습니다 한 고양이 # E6040S 설정 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE 클러스터 생성 키트 V5 </td><td> PE - 203-5001 </td><td> 이점 엔드 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> 이점 최종 샘플 준비 키트 </td><td> PE - 102-1001 </td><td> 이점 엔드 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1킬로바이트 플러스 사다리 </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. 대장균 Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase 아웃 </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 둘째 스트랜드 버퍼 5 배 </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. 대장균의 DNA 효소 </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E - 젤 SYBR 안전 2퍼센트 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 윗첨자 III (5 배 FS 버퍼와 0.1M DTT 포함) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit 분석 키트 </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit 분석 키트 </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. 대장균 DNA ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4의 DNA 중합 효소 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 울트라 퓨어 Dnase Rnase 물 </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 윗첨자 II 이중 좌초 cDNA 합성 키트 </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 임의 프라이머 (invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> 이점 엔드 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B의 입문서 </td><td> N / A </td><td> 단일 읽어 샘ple 준비에만 </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo DT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 코 </td><td> Not1 소화 키트 </td><td> R0189S </td><td> 단일 읽기 샘플 준비에 대해서만 </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute 키트 </td><td> 74,204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy 미니 키트 (50) </td><td> 74,104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> 겔 정화 키트 </td><td> 28,604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase 세트 </td><td> 79,254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute 키트 </td><td> 74,204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo 연구 </td><td> DNA 깨끗하고 농축기 (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

mRNA - Seq하여 전체 transcriptome 배열은 현재 전세계 유전자 발현, 돌연변이, allele 특정 표현과 다른 게놈 차원의 분석을 수행하기 위해 광범위하게 사용됩니다. mRNA - Seq도 아닌 합성의 genomes의 유전자 발현 분석을위한 게이트가 열립니다. mRNA - Seq는 높은 감도, 넓은 동적 범위를 제공하고 샘플에 성적표 사본 번호를 측정하실 수 있습니다. Illumina의 게놈 분석기는 하나의 긴 읽기 궁극적으로 &quot;이점 엔드&quot;접근 방식이 모두의 끝에 합성 수 있습니다. 대형 상대적으로 짧은 시퀀스 번호 (&gt; 10 7) (&lt;150 BP) 읽기의 순서 수행 대체 스플 라이스 분기점을 추적 가능 , 삽입 및 삭제, 그리고 드 노보 transcriptome 조립하는 데 유용합니다. 연구자들이 직면한 주요 도전 과제 중 하나는 재료를 시작하는 제한된 금액을 말합니다. 예를 들어, 세포가 레이저 마이크로 해부 가능하여 수확 아르 실험 총 RNA m를 시작나노 그램의 대책을 불안. 이러한 샘플에서 mRNA - Seq 라이브러리의 준비는 1, 2를 설명하지만 편견을 소개 중대한 PCR 증폭을 포함하고 있습니다. 최소한의 PCR 증폭 다른 RNA - Seq 라이브러리 구축 절차 3, 4를 발표했지만 전체 RNA를 시작하는 마이크로 그램 금액을 요구했습니다. 여기 우리는 중요한 PCR 증폭을 피할 수 및 총 RNA의 10 나노 그램이 필요 도서관 준비 mRNA - Seq의 시퀀싱을위한 Illumina 게놈 분석기 II 플랫폼을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 그것이 상당한 증폭 바이어스를 도입하지 않고 방향 라이브러리를 제작 게재된 단일 엔드 시퀀싱 5, 이전에 설명한 및 검증되어 있지만, 여기서 우리는 이점 엔드 프로토콜로 사용하기 위해 추가로 그것을 확인합니다. 우리는 선택 &#39;T7 주장, T7 기반 Eberwine 선형 증폭 방법을 사용하여 총 RNA를 시작 polyadenylated 메신저 RNAs를 증폭라 &quot;(T7 선형 증폭). 증폭 폴리 - A mRNAs이 조각되어 최종 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 출혈도 잡았 베꼈는데와 어댑터 역방향. 모두 하나의 읽기 및 이점 최종 실행을 위해, 시퀀스는 인간의 transcriptome 6 매핑하고되도록 정규화 여러 실행에서 데이터를 비교할 수 있습니다. 우리는 샘플 7 비교하면 RPKM에 뛰어난 측정합니다 만명 당 성적 단위로 유전자 발현 측정 (TPM)를보고합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

여기 T7 RNA 선형 증폭을 기반으로 유전자 발현 분석을 위해 모두 하나의 읽기 및 이점 엔드 Illumina mRNA - Seq 시퀀싱 라이브러리의 준비를위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 총 RNA를 시작하는 10 나노 그램이 필요하고 전체 성적표를 나타내는 매우 일관된 라이브러리를 생성합니다.

10 나노 그램 총 RNA의 단일 읽기와 결합하여 최종 mRNA - Seq의 Illumina 도서관

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

39.0K 조회수.  Morgridge Institute for Research. 여기 T7 RNA 선형 증폭을 기반으로 유전자 발현 분석을 위해 모두 하나의 읽기 및 이점 엔드 Illumina mRNA - Seq 시퀀싱 라이브러리의 준비를위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 총 RNA를 시작하는 10 나노 그램이 필요하고 전체 성적표를 나타내는 매우 일관된 라이브러리를 생성합니다.