Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Morgridge para la Investigación y la Universidad de Wisconsin Foundation. Damos las gracias a Krista Eastman por su asistencia editorial.

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	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Los autores revelan que JAT es uno de los fundadores, los accionistas, consultor y miembro del consejo de celulares Dynamics International (CDI). También se desempeña como asesor científico y tiene intereses financieros en las tácticas Empresas II de células madre.

Los protocolos actuales para la toma de pares bibliotecas final requieren entre 1 mg 9 a 2,5 mg 10 importe de partida de ARN total. A continuación les presentamos nuestra amplificación lineal T7 basada (T7LA) para preparar los dos una sola lectura y bibliotecas pares Illumina final de secuenciación y demostrar que este método permite la generación de bibliotecas de precios tan bajos como 10 ng de ARN total, la producción de datos que es comparable a la de mínimamente ampliado (MinAmp) bibliotecas de material veces más, a partir 1000 (10 mg de ARN total). Las 10 bibliotecas ng no sólo descubrir las semejanzas en el número total de genes, sino que también producen las firmas de expresión genética que son similares (Figuras 3a yb). Por otra parte, tanto la única lectura y bibliotecas pares final producido por el método T7LA son muy similares entre sí (Figura 3c), que permite a los investigadores comparar los datos generados por las bibliotecas a partir de cualquiera de los protocolos. Desde estas bibliotecas fueron preparados a partir de ARN humano de células madre embrionarias, se realizaron búsquedasde 30 genes de células madre específicas entre las bibliotecas y encontrar que casi todos los de estos genes (93-100%) se identifican por las bibliotecas a partir de al menos 10 ng de RNA total de partida (Figura 4), validando así el protocolo. Creemos que el protocolo sería muy útil para los investigadores, especialmente en circunstancias como las celdas de flujo ordenado o láser micro-disección del tejido en que el material de partida es limitante. En tales circunstancias, el protocolo que permitirá la generación de datos de expresión génica comparable a las bibliotecas a partir de cantidades mucho más grandes de partida ya que el protocolo produce perfiles de expresión comparable a través de al menos 3 órdenes de magnitud a partir de ARN.

<table border="1"><tbody><tr><td> Empresa </td><td> Kit / Reactivo </td><td> Catálogo # </td><td> Comentarios especiales </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> La fragmentación de reactivos </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Revestimiento de acrilamida </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC no tratados de agua libre de nucleasa </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP conjunto </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTPs metilado </td><td> R0431 </td><td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Grupo Generación kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Sec Kit v5 36 ciclos </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Sec. de chips preparación de muestras Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura. Pueden ser reemplazados con los ORC muestra de ADN Mix Master Set de preparación un gato # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Grupo Generación kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Para la preparación de parejas de la muestra final, sólo </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Muestras pareadas final Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Para la preparación de parejas de la muestra final, sólo </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb plus escalera </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNasa H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNasa fuera </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Buffer 5x segunda cadena </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimerasa </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR seguro del 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superíndice III (5X buffer FS y TDT 0,1 M) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ARN quibit kit de ensayo </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA SA qubit kit de ensayo </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli ADN ligasa </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ADN polimerasa T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure DNasa RNasa agua </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superíndice II doble varados cDNA síntesis kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Primer azar (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Para la preparación de parejas de la muestra final, sólo </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B imprimación </td><td> N / A </td><td> Para un solo sam Leerejemplo de preparación sólo </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 digestión kit </td><td> R0189S </td><td> Para la preparación de la muestra individual de sólo lectura </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel kit de purificación </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNasa conjunto </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Investigación </td><td> ADN limpia y concentrador (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

La secuenciación del transcriptoma todo por ARNm-Seq ahora se utiliza ampliamente para llevar a cabo la expresión génica global, la mutación, la expresión específica de alelo y otros análisis en todo el genoma. ARNm-Seq, incluso abre la puerta para el análisis de expresión génica de no secuenciado los genomas. ARNm-Seq ofrece una alta sensibilidad, un rango dinámico amplio y permite la medición del número de copias de transcripción en una muestra. Analizador de Illumina genoma lleva a cabo la secuenciación de un gran número (&gt; 10 7) de la secuencia relativamente corto se lee (&lt;150 pb). El &quot;fin de pares&quot;, enfoque, en el que una lectura única y larga es la secuencia en sus dos extremos, permite el seguimiento de los cruces alternativos de empalme , inserciones y eliminaciones, y es útil para de novo de montaje transcriptoma. Uno de los principales desafíos que enfrentan los investigadores es una cantidad limitada de material de partida. Por ejemplo, en experimentos donde se cosechan las células de micro-disección con láser, disponible a partir del ARN total de may medida en nanogramos. Preparación de las bibliotecas de mRNA-Sec de las muestras se han descrito 1, 2, sino que implica importantes amplificación por PCR que puedan introducir sesgos. Otros ARN-Seq procedimientos de construcción de la biblioteca con un mínimo de amplificación de PCR se han publicado 3, 4, sino que requieren cantidades de microgramos a partir de ARN total. A continuación se describe un protocolo para la plataforma Illumina Genoma Analyzer II para la secuenciación de ARNm-Seq para la preparación de la biblioteca, que evita importantes amplificación por PCR y sólo requiere de 10 nanogramos de ARN total. Aunque este protocolo ha sido descrito previamente y validado para un solo fin de la secuencia 5, donde se ha demostrado para producir bibliotecas de dirección sin la introducción de un sesgo de amplificación importantes, aquí lo validamos para su utilización como un protocolo de final emparejados. Nos selectivamente amplificar ARN mensajero de partida poliadenilado ARN total utilizando el método basado en Eberwine T7 amplificación lineal, acuñado &quot;T7LA &quot;(T7 amplificación lineal). La amplificación de poli-A ARNm están fragmentados, transcripción reversa y el adaptador de liga para producir la biblioteca de la secuencia final. Para ambas carreras finales individuales de lectura y pares, las secuencias se asignan a los humanos transcriptoma 6 y normalizado para que los datos de varias ejecuciones se pueden comparar. Presentamos la medida de expresión génica en las unidades de las transcripciones por millón (TPM), que es una medida superior a RPKM al comparar muestras 7.

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Aquí se describe un método para la preparación de los dos pares de solo lectura y final Illumina Sec-mRNA bibliotecas genómicas para el análisis de expresión genética basado en la amplificación del ARN T7 lineal. Este protocolo requiere solamente 10 nanogramos de ARN total a partir bibliotecas y genera muy consistente que representa transcripciones conjunto.

Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

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39.0K vistas.  Morgridge Institute for Research. Aquí se describe un método para la preparación de los dos pares de solo lectura y final Illumina Sec-mRNA bibliotecas genómicas para el análisis de expresión genética basado en la amplificación del ARN T7 lineal. Este protocolo requiere solamente 10 nanogramos de ARN total a partir bibliotecas y genera muy consistente que representa transcripciones conjunto.