الكتاب أشكر معهد هوارد هيوز الطبي لعلوم الحياة الجبهة المتحدة للمشاركة في الجائزة إلى AH

1. إعداد أشرطة الكاسيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة الأمامي والخلفي لوحات لاستخدامها كاسيت Nupage إينفيتروجن minigel Novex، أو غيرها من كاسيت minigel التجارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مل 1-3 تقريبا من الايبوكسي البلاستيك وتخلط جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الايبوكسي إلى حافة داخل لوحة الجبهة، حيث اثنين من لوحات وسوف تأتي في اتصال عندما يتم تجميعها في شريط كاسيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرك قطعة من الورق أو الورق المقوى مرشح من خلال الشق السفلي من لوحة الى الوراء عندما تجميع كاسيت لمنع الايبوكسي الزائدة من ختم الافتتاح. إزالة ورقة الترشيح في أقرب وقت ويتم تجميع اثنين من لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لقطات الموثق على طول الحواف لختم ضيق، والسماح لأشرطة الجلوس بين عشية وضحاها لالايبوكسي لعلاج تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق فتحة في الجزء السفلي من اللوحة الخلفية مع الشريط الكهربائي. </li></ol> 2. صب جل حل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى قارورة 125 مل ذراع الجانب، إضافة ما يلي:2.25 مل من 4X تريس، قاعدة حل ودرجة الحموضة عازلة هلام 8.70، 3.50 مل من مادة الأكريلاميد 30.8٪ / bisacrylamide، 3.25 مل من النوع الأول للمياه كاشف الصف (IRG-H 2 O) لحجم ما مجموعه 9 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دي غاز الحل لمدة 10 دقيقة عن طريق ربط الذراع الجانب من القارورة إلى جهاز فراغ، ومما يضع حدا مقلوب على الجزء العلوي من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مل 9 من اجتثاث بالغاز حل ل50 مل يمكن التخلص منها البولي بروبلين أنبوب الطرد المركزي، وإضافة 30 ميكرولتر من بيرسلفات ammounium 10٪ (APS) و 6 ميكرولتر من N، N، N &#39;، N&#39;،، tetramethylethylenediamine (TEMED)، ومزيج بشكل جيد من قبل يحوم الحل لتجنب إدخال فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب فورا الحل في الكاسيت، والسماح لها لتشغيل أسفل الجانب من كاسيت لمنع أي الفقاعات من النشوء بين لوحات هلام. شغل كاسيت إلى ما يقرب من 2 سم من الحافة العلوية من لوحة (أقصر) من الأمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 0.5 مل من بيوتانول-1 مشبعة 1X العازلة جل حل، والسماح للهلام تتبلمر لمدة 1ساعة. </li></ol> 3. صب جل التراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التالية إلى قارورة 125 مل ذراع الجانب: 0.75 مل من 4X تريس، التراص قاعدة هلام درجة الحموضة عازلة 6.80، 0.40 مل من مادة الأكريلاميد 30.8٪ / bisacrylamide، 1.85 مل من O 2 IRG-H لإجمالي حجم 3 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دي غاز الحل لمدة 10 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين حل هلام التراص والتفريغ، من أجل الخروج من 1-بيوتانول مشبعة 1X العازلة حل وهلام من الجزء العلوي من جل حل. شطف الجزء العلوي من جل حل مرة واحدة مع O. 2 IRG-H صب قبالة المياه واستخدام ورقة أو ماص Whatman مرشح لامتصاص أي السائل المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 3 مل من الحل degassed وإضافة 9 ميكرولتر من وكالة الأنباء الجزائرية 10٪ و 2 ميكرولتر من TEMED وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب بسرعة الحل في الكاسيت، والسماح لها لتشغيل أسفل الجانب من الكاسيت إلى أن يقع بالقرب من الحافة العلوية للوحة الأمامية أقصر هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود مشط هلام النظيفة في الجزء العلوي من كاسيت هلام،وضع مقطع الموثق على كاسيت على مشط ليثبت في مكانه. السماح للهلام التراص تتبلمر لمدة 1 ساعة ليلة وضحاها. </li></ol> 4. تخزين هلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الجل وبلمرة تماما، وإزالة لقطات الموثق ووضع الكاسيت في كيس بلاستيكي قابل للغلق للحرارة، أو كيس من البلاستيك اعادة اغلاقها باحكام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 20 مل من 1X العازلة هلام التراص الذي يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم في الحقيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة ختم الحقيبة لمدة 5 ثوانى وتأكد من عدم وجود تسرب في الحقيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين هلام في درجة مئوية 4 </li></ol> 5. إعداد العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب microcentrifuge رقيقة الجدران، إضافة ما يصل إلى 6.5 ميكرو لتر من عينة بروتين، 7.5 ميكرو لتر من Novex 2X تريس، جليكاين العازلة عينة SDS، 1 ميكرولتر من dithiothreitol 100 ملم (DTT) وIRG O-H 2 (إذا لزم الأمر) ل اجمالى حجم التداول من 15 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط العينة vortexing، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة عينة لجلب محتويات إلى أسفل الأنبوب. </li> &lt;لى&gt; تفسد العينة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 6. تشغيل هلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز هلام Novex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 مل من عازلة الجري تريس، جليكاين الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من مضادات الأكسدة Nupage إلى الدائرة الداخلية، و 300 مل من تريس، جليكاين تشغيل المخزن إلى غرفة الخارجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينات من التشويه والتحريف بروتين (15 ميكرولتر) في الآبار باستخدام طرف جل ماصة التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل جل في 200 V لل60-70 دقيقة. </li></ol> 7. تلطيخ الجل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كاسيت من جهاز جل وكسر ختم الايبوكسي من قبل المتطفلين على اثنين من لوحات هلام البلاستيك وبصرف النظر باستخدام سكين هلام أو سكين المعجون شديدة. بعناية فصل جل من لوحات، مع الحرص على عدم المسيل للدموع الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الجل مع IRG-H 2 O ثلاث مرات مع تحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في هلام مع إينفيتروجن SimplyBlue SafeStain لمدة 1 ساعة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب قبالة حل وتلطيخيزيل اللون الجل مع O. 2 IRG-H </li></ol> 8. تنظيف الأشرطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستخدم ملعقة معدنية لكشط أو تقشر الايبوكسي في كل شيء على أشرطة الكاسيت بحيث يمكن إعادة استخدامها مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل واحدة من لوحات هلام البلاستيك بمحلول منظف معتدل، وشطف جيدا مع ماء الصنبور يليه الماء المقطر. </li></ol> 9. ممثل النتائج لان الايبوكسي ستشكل ختم المياه ضيق، (الشكل 1)، فإن أشرطة الكاسيت لا تسرب عندما يتم سكب مادة الأكريلاميد في حل منها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لأشرطة هلام فتحت بسهولة لاسترداد هلام لتلطيخ، ويمكن مقشر والايبوكسي الخروج من أشرطة الكاسيت للسماح المستمر إعادة استخدامها. كما هو مبين في الشكل 2، وهلام ويبين فصل واضح من علامات البروتين وشرائح عينة مناسبة للبروتين الكهربائي الروتيني. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تطبيق صحيفةالكاتيون من الايبوكسي لختم أشرطة minigel. يتم تطبيق طبقة رقيقة من الايبوكسي إلى حافة واحدة من أشرطة الكاسيت قبل التجميع. لتسليط الضوء على الايبوكسي، كانت كاذبة اللون الأحمر في هذه الصورة. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. صب فصل البروتينات على هلام SDS-تريس، جليكاين باستخدام إعادة استخدام الأشرطة minigel. تم تنفيذ SDS-PAGE على النحو المبين أعلاه. الكهربائي التالية تم إزالة جل من كاسيت minigel، ملطخة في SafeStain SimplyBlue وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وتصويرها باستخدام الضوء الأبيض المنقولة. حارة M يحتوي على بروتين SeeBlue المعايير Plus2 قبل الملون. يشار إلى الأوزان الجزيئية للبروتينات في M ممر على الجانب الأيمن من هلام في kilodaltons (قده). الممرات الأخرى تظهر من البروتينات المحللة تطهيرها من البكتيريا تعبر عن الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (ضريبة المبيعات) الموسومة بروتين. البروتينات هي تلك التي تظهر غسلها من زالخرز lutathione قبل شطف من البروتين ضريبة السلع والخدمات الموسومة.

<ol>
	<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis.">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shapiro, A. L., Vi&#241;uela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels.">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بروتين الكهربائي للهلام هو وسيلة لا غنى عنها للمختبرات البيولوجيا الجزيئية الأكثر. minigels المتاحة تجاريا توفير مستوى عال من الراحة، ولكن يمكن أن يكون مكلفا. هنا نبين كيفية إعادة استخدام الأشرطة minigel من ماركة شعبية من minigels متاحة تجاريا. هذا الأسلوب يحتفظ الراحة من وجود ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> إينفيتروجن Nupage كاسيت Minigel Novex (1.0 مم) </td><td> إينفيتروجن </td><td> NC2010 </td><td> المتاحة في 2 و 5 و 10 و 15 و 12 و الآبار 2D </td></tr><tr><td> البلاستيك إبوكسي </td><td> وكتايت </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> الكهربائية الشريط </td><td> سكوتش </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 ذراع الجانب مل دورق </td><td> بيركس </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X تريس، قاعدة عازلة حل وهلام </td><td></td><td></td><td> 1.5 م تريس قاعدة درجة الحموضة 8.7 </td></tr><tr><td> الأكريلاميد </td><td> فيشر العلمية </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> مكرر الأكريلاميد </td><td> Biomedicals عضو البرلمان، والمؤتمر الوطني العراقي. </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> 30.8٪ حل الأكريلاميد </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 الأكريلاميد: مكرر الأكريلاميد في O 2 IRG-H </td></tr><tr><td> 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP179-25 </td><td> 0،1 ز بيرسلفات الأمونيوم في 1 مل O 2 IRG-H، الذي أعد على الفور قبل استخدامه </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> العضوية أركوس </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-بيوتانول مشبعة العازلة 1X حل وهلام </td><td></td><td></td><td> 05:02 1-بيوتانول إلى 1X العازلة حل وهلام </td></tr><tr><td> 4X تريس، قاعدة عازلة هلام التراص </td><td></td><td></td><td> 1.5 م تريس قاعدة درجة الحموضة 6.8 </td></tr><tr><td> جل مشط </td><td> إينفيتروجن </td><td> NC3015 </td><td> 15 بشكل جيد، وسمك 1.0 ملم </td></tr><tr><td> دفعة السدادة </td><td> TEW أجهزة التدفئة الكهربائية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> قابل للغلق الحقيبة الحرارة </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 الحجم نصف لتر (6.5 &quot;× 8&quot;) </td></tr><tr><td> هلام تخزين العازلة </td><td></td><td></td><td> 1X التراص العازلة هلام مع أزيد الصوديوم 0.1٪ </td></tr><tr><td> Novex SDS العازلة عينة تريس، جليكاين (2X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X العازلة الجري تريس-Gylcine </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC2675 </td><td> 1L من الأوراق المالية 10X: 29،0 ز تريس للقاعدة، 144،0 ز جليكاين، 10،0 ز SDS </td></tr><tr><td> إكس سيل SureLock مصغرة خلية </td><td> إينفيتروجن </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> جل سكين </td><td> إينفيتروجن </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue الآمن اللطخة </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC6065 </tد&gt; <td></td></tr></tbody></table>

pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes

تقييم البروتينات باستخدام كبريتات الصوديوم بولكرلميد دوديسيل الهلام الكهربائي (SDS-PAGE) التحليل هو التقنية المستخدمة من قبل الباحثين الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية 1-4. بالنسبة للمختبرات التي تقوم بإجراء التحاليل اليومية من البروتينات، يمكن أن تكلفة المواد الهلامية بولكرلميد المتاحة تجاريا (~ $ 10/gel) أن تكون كبيرة بمرور الوقت. للتخفيف من هذه التكاليف، وبعض الباحثين تعد المواد الهلامية التي بولكرلميد الخاصة. الطرق التقليدية في صب هذه المواد الهلامية تستخدم عادة المعدات المتخصصة وألواح الزجاج هلام التي يمكن أن تكون باهظة الثمن ويحول دون صب المواد الهلامية كثير وتخزينها لاستخدامها في المستقبل. وعلاوة على ذلك، يمكن التعامل مع لوحات من الزجاج أثناء التنظيف أو هلام صب يؤدي إلى كسر عرضي خلق يشكل خطرا على السلامة، والتي قد تحول دون استخدامها في الصفوف الجامعية مختبر. بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، وماجستير غير مكلفةاستنباط مواد تم شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. ويمكن من خلال إعادة استخدام الأشرطة هلام البلاستيك من المواد الهلامية المتاحة تجاريا، ومختبرات المواد الهلامية التي تعمل بروتين متكرر توفير تكاليف كبيرة ويساعد في تحسين البيئة. وبالإضافة إلى ذلك، والأشرطة هلام البلاستيك هي مقاومة جدا للكسر، الأمر الذي يجعلها مثالية لقاعات الدراسة الجامعية مختبر.

Watch this Scientific Journal Video about Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes at JoVE.com

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، ومواد غير مكلفة شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. ويمكن من خلال إعادة استخدام الأشرطة هلام البلاستيك من المواد الهلامية المتاحة تجاريا، ومختبرات المواد الهلامية التي تعمل بروتين متكرر توفير تكاليف كبيرة ويساعد في تحسين البيئة.

صب وتشغيل جل البروتين عن طريق إعادة استخدام شرائط التجاري

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

pouring-and-running-a-protein-gel-by-reusing-commercial-cassettes

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  University of Florida. بروتوكول لدينا يوضح كيفية صب المواد الهلامية بروتين متعددة في وقت واحد بواسطة Nupage إعادة تدوير أشرطة إينفيتروجن minigel Novex، ومواد غير مكلفة شراؤها في منزل تحسين تخزين. هذه الطريقة اقتصادية ويشمل تبسيط وسيلة لتخزين المواد الهلامية في 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع. و?...

Video: Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

A Simple and Inexpensive Running Wheel Model for Progressive Resistance Training in Mice

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most recently, weighted-sled pulling, are highly effective at providing a hypertrophic stimulus to induce skeletal muscle adaptations. While these models have proven invaluable for skeletal muscle research, they are either invasive or involuntary and labor-intensive. Fortunately, many rodent strains voluntarily run long distances when given access to a running wheel. Loaded wheel running (LWR) models in rodents are capable of inducing adaptations commonly observed with resistance training in humans, such as increased muscle mass and fiber hypertrophy, as well as stimulation of muscle protein synthesis. However, the addition of moderate wheel load either fails to deter mice from running great distances, which is more reflective of an endurance/resistance training model, or the mice discontinue running nearly entirely due to the method of load application. Therefore, a novel high-load wheel running model (HLWR) has been developed for mice where external resistance is applied and progressively increased, enabling mice to continue running with much higher loads than previously utilized. Preliminary results from this novel HLWR model suggest it provides sufficient stimulus to induce hypertrophic adaptations over the 9 week training protocol. Herein, the specific procedures to execute this simple yet inexpensive progressive resistance-based exercise training model in mice are described.

This procedure describes a translatable progressive loaded running wheel resistance training model in mice. The primary advantage of this resistance training model is that it is entirely voluntary, thus reducing stress for the animals and the burden on the researcher.

نموذج عجلة تشغيل بسيط وغير مكلف للتدريب على المقاومة التدريجية في الفئران

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most ...

تبسيط دراسات تكوين الأوعية باستخدام مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في تكوين الأوعية ونفاذية الأوعية من خلال مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

تعديل في الجسم الحي مصفوفة هلام المكونات مقايسة لدراسات تولد الأوعية

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...