Die Autoren danken dem Howard Hughes Medical Institute für eine UF Science for Life Award an AH

1. Vorbereitung der Kassetten <ol><li> Saubere Vorder-und Rückseite eines gebrauchten Platten Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassette, oder andere Geschäfte Minigel Kassette. </li><li> Bereiten Sie etwa 1-3 ml Kunststoff Epoxy und gut mischen nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Anwenden das Epoxidharz auf die Innenkante der Frontplatte, wobei die beiden Platten in Berührung kommen wird, wenn die Kassette montiert ist. </li><li> Schieben ein Stück Filterpapier Papier oder Karton durch den Bodenschlitz der Rückplatte bei der Montage der Kassette, um überschüssiges Epoxidharz von Abdichten der Öffnung zu verhindern. Entfernen Sie das Filterpapier, sobald die beiden Platten zusammengebaut werden. </li><li> Zeigen Binder Clips an den Rändern für einen dichten Verschluss, und lassen Sie die Kassetten sitzen über Nacht für das Epoxidharz vollständig aushärten. </li><li> Verschließen Sie den Schlitz an der Unterseite der hinteren Platte mit Isolierband. </li></ol> 2. Gießen des Trenngels <ol><li> Um einen 125-ml Seitenarm Kolben, fügen Sie die folgende:2,25 ml 4X Tris-Base Trenngelpuffer pH 8,70, 3,50 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 3,25 ml Typ I analysenreines Wasser (IRG-H 2 O) mit einem Gesamtvolumen von 9 ml. </li><li> De-Gas die Lösung für 10 min durch Anbringen der Seitenarm des Kolbens auf einer Vakuumvorrichtung, und Platzieren eines invertierten Anschlag auf dem oberen Ende des Kolbens. </li><li> Übertragen Sie die 9 ml entgastem Lösung auf eine 50 ml Einweg-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 30 ul 10% ammounium Persulfat (APS) und 6 ul N, N, N &#39;, N&#39;,-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und mischen auch durch Schwenken der Lösung zu vermeiden, Einführen von Bläschen. </li><li> Gießen Sie sofort die Lösung in der Kassette, so dass es zu laufen an der Seite der Kassette, um alle Blasenbildung zwischen den Gel-Platten zu verhindern. Füllen Sie die Kassette auf ca. 2 cm vom oberen Rand des vorderen (kürzeren) Platte. </li><li> Sanft fügen Sie 0,5 ml 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt und lassen Sie das Gel für 1 polymerisierenStunde. </li></ol> 3. Gießen der Sammelgel <ol><li> Fügen Sie das folgende in einen 125 ml Seitenarm Flasche: 0,75 ml 4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer pH 6,80, 0,40 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 1,85 ml IRG-H 2 O mit einem Gesamtvolumen von 3 ml. </li><li> De-Gas die Lösung für 10 min, wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Während die Stacking-Gel-Lösung Entgasung, giesst die 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer von der Oberseite des Trenngels gesättigt. Spülen Sie den oberen Rand des Trenngels einmal mit IRG-H 2 O. Gießen Sie das Wasser ab und verwenden Sie eine saugfähige oder Whatman-Filterpapier, um restliche Flüssigkeit zu absorbieren. </li><li> Nehmen Sie 3 ml Ihren entgaste Lösung und fügen 9 ul von 10% APS und 2 ul TEMED und gut mischen. </li><li> Schnell geben die Lösung in der Kassette, so dass er mittig entlang der Seite der Kassette, bis sie nahe dem oberen Rand der kürzeren vorderen Gelplatte ist. </li><li> Legen Sie eine saubere Gel Kamm in der Spitze des Gelkassette,Stellen Sie einen Binder Clip auf der Kassette über den Kamm zu halten Sie es fest. Lassen Sie die Stacking-Gel für 1 Stunde bis über Nacht zu polymerisieren. </li></ol> 4. Speichern Sie das Gel <ol><li> Wenn das Gel vollständig polymerisiert, entfernen Sie die Binder Clips und legen Sie die Kassette in einer heißsiegelfähigen Plastikbeutel oder eine wieder verschließbare Plastiktüte. </li><li> Gießen 20 ml 1X Stacking-Gel Puffer, 0,1% Natriumazid in den Beutel enthält. </li><li> Heißzusiegeln den Beutel für 5 Sekunden und stellen Sie sicher, es gibt keine Lecks in der Tasche. </li><li> Bewahren Sie das Gel bei 4 ° C </li></ol> 5. Die Vorbereitung der Proben <ol><li> In einem dünnwandigen Mikrozentrifugenröhrchen, summieren sich auf 6,5 ul der Probe Protein, 7,5 ul 2x Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer, 1 ul 100 mM Dithiothreitol (DTT) und IRG-H 2 O (falls erforderlich) für ein Gesamtvolumen von 15 ul. </li><li> Mischen Sie die Probe durch Vortexen, und kurz zentrifugieren Sie die Probe auf Inhalte auf dem Boden des Röhrchens zu bringen. </li> &lt;li&gt; denaturieren die Probe bei 70 ° C für 10 min. </li></ol> 6. Das Ausführen des Gels <ol><li> Richten Sie das Novex Gel-Apparatur. </li><li> Zugabe von 200 ml Tris-Glycin-Laufpuffer, die 500 ul NuPAGE Antioxidationsmittel in die innere Kammer, und 300 ml Tris-Glycin-Laufpuffer in die äußere Kammer enthält. </li><li> Legen Sie die denaturierten Proteinproben (15 ul) in die Vertiefungen mit einem Gelbeladung Pipettenspitze. </li><li> Die Elektrophorese bei 200 V für 60-70 min. </li></ol> 7. Färbung des Gels <ol><li> Nehmen Sie die Kassette aus dem Gel Apparate und brechen die Epoxiddichtung durch Aufhebeln der beiden Kunststoff-Gel-Platten auseinander mit einem Messer oder einem Gel steif Spachtel. Trennen Sie vorsichtig das Gel von den Platten, darauf achtend, nicht reißen das Gel. </li><li> Spülen des Gels mit IRG-H 2 O dreimal mit leichtem Schütteln. </li><li> Färben des Gels mit Invitrogen SimplyBlue SafeStain für 1 Stunde unter leichtem Rühren. </li><li> Abgießen und FärbelösungEntfärben des Gels mit IRG-H 2 O. </li></ol> 8. Die Reinigung der Kassetten <ol><li> Verwenden Sie einen Spachtel aus Metall zu kratzen oder ablösen all dem Epoxidharz auf den Kassetten, so dass sie wieder verwendet werden können. </li><li> Waschen Sie jede der Kunststoff-Gel-Platten mit einer milden Reinigungslösung, und spülen Sie gut mit Leitungswasser mit destilliertem Wasser spülen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Da Epoxy eine wasserdichte Abdichtung (1) bilden wird, werden die Kassetten nicht lecken, wenn das Acrylamid-Lösung in sie gegossen wird. Darüber hinaus können die Gelkassetten leicht geöffnet werden, um das Gel für die Färbung abzurufen, und das Epoxidharz kann aus der Kassetten abgezogen werden, um ihre weitere Wiederverwendung zu ermöglichen. Wie in 2 gezeigt ist, zeigt das Gel klare Trennung von Protein-Marker und Probe Bands für den routinemäßigen-Elektrophorese. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. AppliKationen von Epoxy zu Minigel Kassetten abzudichten. Eine dünne Schicht von Epoxid wird an den Rand einer der Kassetten vor der Montage aufgebracht. Um das Epoxid zu markieren, war es falsch-rot gefärbt in diesem Bild. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Trennung von Proteinen auf einem SDS-Tris-Glycin-Gel gegossen und mit wieder verwendet Minigel Kassetten. SDS-PAGE durchgeführt wurde, wie oben beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel aus der Minigel Kassette, in SimplyBlue SafeStain gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt entfernt und fotografiert mit weißem Licht übertragen. Spur M enthält SeeBlue Plus2 Pre-gefärbten Protein-Standards. Die Molekulargewichte der Proteine ​​in Spur M sind auf der rechten Seite des Gels in Kilodalton (kDa) angegeben. Die anderen Spuren für Proteine ​​aus einem geklärten Lysat von Bakterien Expression eines Glutathion-S-Transferase (GST)-markierte Protein. Die Proteine ​​sind diejenigen vom g gewaschenlutathione Kügelchen vor der Elution des GST-markierten Proteins.

<ol>
	<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis.">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa.">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li><li>Shapiro, A. L., Vi&#241;uela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels.">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Protein-Gel-Elektrophorese ist eine unverzichtbare Methode für die meisten molekularbiologischen Laboratorien. Im Handel erhältliche Minigelen bieten ein hohes Maß an Komfort, sondern kann teuer werden. Hier zeigen wir, wie man die Wiederverwendung der Minigel Kassetten aus einer populären Marke im Handel erhältliche Minigelen. Dieses Verfahren hält die Einfachheit eines vorgefertigten Quelle von Gelen, aber nur einen Bruchteil der Kosten für im Handel erhältliche Minigelen. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Cassette (1,0 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> Erhältlich in 2, 5, 10, 12, 15 und 2D-Brunnen </td></tr><tr><td> Kunststoff Epoxy </td><td> Loctite </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> Electrical Tape </td><td> Scotch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 ml Seitenarm Kolben </td><td> Pyrex </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X Tris-Base Trenngelpuffer </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-Base pH 8,7 </td></tr><tr><td> Acrylamid </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-Acrylamid </td><td> MP Biomedicals, Inc. </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> 30,8% Acrylamid-Lösung </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 Acrylamid: Bisacrylamid in IRG-H 2 O </td></tr><tr><td> 10% igen APS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP179-25 </td><td> 0,1 g Ammoniumpersulfat in 1 ml IRG-H 2 O, unmittelbar vor der Verwendung hergestellt </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Arcos Organics </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt </td><td></td><td></td><td> 5.02 1-Butanol auf 1X Trenngelpuffer </td></tr><tr><td> 4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-Base pH 6,8 </td></tr><tr><td> Gel Kamm </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 gut, 1,0 mm Stärke </td></tr><tr><td> Impulssiegelgerät </td><td> TEW Elektroheizausruestung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heisssiegelfähige Pouch </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 Pint Größe (6,5 &quot;x 8&quot;) </td></tr><tr><td> Gel-Speicherpuffer </td><td></td><td></td><td> 1X Sammelgel-Puffer mit 0,1% Natriumazid </td></tr><tr><td> Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X Tris-Gylcine Laufpuffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 1L von 10X Lager: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g Glycin, 10,0 g SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Knife </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue Sichere Stain </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes

Die Auswertung der Proteine ​​mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE-Analyse) ist eine gängige Technik der Biochemie und Molekularbiologie Forscher 1-4 verwendet. Für Laboratorien, die täglich Analyse von Proteinen führen, können die Kosten für im Handel erhältliche Polyacrylamidgelen (~ $ 10/gel) beträchtlich sein im Laufe der Zeit. Um diese Kosten zu mindern, bereiten einige Forscher ihre eigenen Polyacrylamidgelen. Traditionelle Methoden der Ausgießen dieser Gele verwenden üblicherweise spezialisierte Ausrüstung und Glas-Gel-Platten, die teuer und schließt Gießen viele Gele und speichert sie für eine zukünftige Verwendung kann. Darüber hinaus kann der Handhabung von Glasplatten bei der Reinigung oder Gel in Gießen versehentlichem Bruch schafft ein Sicherheitsrisiko darstellen, was ihren Einsatz in Labor Undergraduate-Klassen ausschließen kann zur Folge haben. Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele gleichzeitig gießen Recycling von Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten, und preiswert maMaterialien gekauft zu einem Baumarkt. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen. Darüber hinaus sind Kunststoff Gelkassetten extrem bruchfest, was sie ideal für Bachelor-Labor Klassenzimmer macht.

Watch this Scientific Journal Video about Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes at JoVE.com

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele zu einer Zeit, gießen durch Recycling Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten und kostengünstige Materialien zu einem Baumarkt gekauft. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen.

Gießen und Ausführen eines Protein-Gel durch die Wiederverwendung von Gewerbe-Kassetten

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

pouring-and-running-a-protein-gel-by-reusing-commercial-cassettes

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Aufrufe.  University of Florida. Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele zu einer Zeit, gießen durch Recycling Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten und kostengünstige Materialien zu einem Baumarkt gekauft. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und ...

Serie: Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Forschung

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

A Simple and Inexpensive Running Wheel Model for Progressive Resistance Training in Mice

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most recently, weighted-sled pulling, are highly effective at providing a hypertrophic stimulus to induce skeletal muscle adaptations. While these models have proven invaluable for skeletal muscle research, they are either invasive or involuntary and labor-intensive. Fortunately, many rodent strains voluntarily run long distances when given access to a running wheel. Loaded wheel running (LWR) models in rodents are capable of inducing adaptations commonly observed with resistance training in humans, such as increased muscle mass and fiber hypertrophy, as well as stimulation of muscle protein synthesis. However, the addition of moderate wheel load either fails to deter mice from running great distances, which is more reflective of an endurance/resistance training model, or the mice discontinue running nearly entirely due to the method of load application. Therefore, a novel high-load wheel running model (HLWR) has been developed for mice where external resistance is applied and progressively increased, enabling mice to continue running with much higher loads than previously utilized. Preliminary results from this novel HLWR model suggest it provides sufficient stimulus to induce hypertrophic adaptations over the 9 week training protocol. Herein, the specific procedures to execute this simple yet inexpensive progressive resistance-based exercise training model in mice are described.

This procedure describes a translatable progressive loaded running wheel resistance training model in mice. The primary advantage of this resistance training model is that it is entirely voluntary, thus reducing stress for the animals and the burden on the researcher.

Ein einfaches und kostengünstiges Laufradmodell für progressives Widerstandstraining bei Mäusen

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most ...

Vereinfachung von Angiogenese-Studien mit einem modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Angiogenese und Gefäßpermeabilität durch einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...