1. إعداد جيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج الكتلة المناسبة من الاغاروز الى دورق مخروطي. وتعد المواد الهلامية الاغاروز باستخدام AW / الخامس حل مئوية. سيكون تركيز الاغاروز في جل تعتمد على أحجام شظايا من الحمض النووي يمكن فصلها، مع معظم المواد الهلامية التي تتراوح بين 0.5٪ -2٪. وينبغي أن حجم المخزن المؤقت لا يكون أكبر من 1/3 من قدرة قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تشغيل العازلة القارورة التي تحتوي على الاغاروز. دوامة لخلط. الجل الأكثر شيوعا تشغيل مخازن هي تاي (40 ملم تريس، خلات، 1 ملم EDTA) وTBE (45 مم، تريس بورات، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوب الخليط الاغاروز / العازلة. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك عن طريق تسخين في الميكروويف، ولكن يمكن أيضا أن يتم على نار بنسن. على فترات ق 30، إزالة قارورة وعباب المحتويات إلى مزيج جيد. كرر حتى الاغاروز قد حلت تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إيثيديوم بروميد (EtBr) إلى تركيز 0.5 ميكروغرام / مل. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن جل ملطخة بعد الكهربائيةرحلان في تشغيل العازلة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr عن 15-30 دقيقة، تليها destaining في تشغيل المخزن المؤقت لمدة متساوية من الزمن. </li></ol> ملاحظة: EtBr هو مادة مسرطنة مشتبه بهم، ويجب التخلص منها بطريقة صحيحة في لوائح المؤسسة. وينبغي دائما أن ترتديه قفازات عند التعامل مع المواد الهلامية التي تحتوي على EtBr. الأصباغ البديلة لتلطيخ من الحمض النووي متاحة، ومع ذلك لا يزال EtBr الأكثر شعبية واحدة نظرا لحساسيتها والتكلفة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتبريد الاغاروز إما على الفوق أو حضانة في حمام ماء 65 درجة مئوية. وعدم القيام بذلك تشوه علبة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع علبة الجل في جهاز الصب. بدلا من ذلك، قد شريط واحد أيضا على حواف مفتوحة من علبة الجل لخلق القالب. تضع مشط المناسبة في القالب هلام لإنشاء الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الاغاروز المنصهر في القالب الجل. السماح للالاغاروز لتعيين في درجة حرارة الغرفة. إزالة مشط ووضع الجل في المربع هلام. بدلا من ذلك، زويمكن أيضا أن تكون ملفوفة في شرم الاغطية البلاستيكية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدام (الشكل 1). </li></ol> 2. إنشاء جهاز جل والفصل بين أجزاء الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تحميل صبغ عينات من الحمض النووي لا بد من فصل (الشكل 2). يتم عادة جل التحميل صبغ في تركيز 6X (0.25٪ برومفينول الزرقاء، 0.25٪ cyanol الزيلين، 30 الجلسرين٪). التحميل صبغ يساعد على تتبع مدى عينة الحمض النووي الخاص بك قد سافر، ويسمح أيضا العينة لتغرق في هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج التيار الكهربائي إلى الجهد المطلوب (1-5V/cm بين الأقطاب الكهربائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة يكفي العازلة تشغيل لتغطية سطح هلام. من المهم لاستخدام المخزن المؤقت تشغيل نفسه بوصفها واحدة تستخدم لتحضير هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق يؤدي من مربع هلام لامدادات الطاقة. بدوره على امدادات الطاقة والتحقق من أن كلا من صندوق جل وامدادات الطاقة والعمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء. ببطءوتحميل بعناية عينة من الحمض النووي (ق) في هلام (الشكل 3). وينبغي دائما على حجم الحمض النووي مناسبة علامة يمكن تحميل جنبا إلى جنب مع نماذج تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال غطاء لصندوق هلام. وينبغي أن الكاثود (الخيوط السوداء) تكون أقرب الآبار من (الخيوط الحمراء) الأنود. مضاعفة التحقق التي تم توصيل أقطاب كهربائية في فتحات الصحيح في امدادات الطاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على السلطة. تشغيل هلام حتى الصبغة قد هاجروا إلى مسافة مناسبة. </li></ol> 3. ملاحظة شظايا من الحمض النووي مطلق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما أكملت الكهربائي، إيقاف تشغيل التيار الكهربائي وإزالة غطاء العلبة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من مربع هلام. تصريف فائض العازلة من على سطح الأرض من هلام. وضع علبة الجل على مناشف ورقية لامتصاص أي عازلة إضافية قيد التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من علبة الجل وفضح هلام للأشعة فوق البنفسجية. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك باستخدام نظام وثائق هلام (الشكل 4). وينبغي أن عصابات الحمض النووي تظهرعلى النحو العصابات فلوري البرتقالي. التقاط صورة من هلام (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص السليم من الجل وتشغيل العازلة في لوائح المؤسسة. </li></ol> 4. ممثل النتائج الشكل 5 يمثل نتيجة نموذجي بعد الكهربائي للهلام الاغاروز من المنتجات PCR. بعد الانفصال، وشظايا من الحمض النووي الناتج مرئية كما نطاقات محددة بوضوح. يجب أن يتم فصل معيار الحمض النووي أو سلم إلى درجة تسمح لتقرير مفيد من أحجام عينة العصابات. في المثال المعروض، ويفصل شظايا من الحمض النووي من 765 شركة بريتيش بتروليوم، BP 880 و بي بي 1022 على جل الاغاروز 1.5٪ جنبا إلى جنب مع سلم DNA 2-السجل. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> الشكل 1. جل الاغاروز طدت بعد إزالة المشط. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> الشكل 2. على الطالب إضافة إلى صبغ التحميل عينات من الحمض النووي لها. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> الشكل 3. الطالب تحميل عينة من الحمض النووي في بئر في هلام. <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> الشكل 4. مثال على هلام نظام التوثيق. <img alt="الشكل 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> الشكل 5. صورة لهلام إستشراد آخر. وأضيف إلى EtBr الجل قبل الكهربائي إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / لتر، يليه فصل في 100 فولت لمدة 1 ساعة. تعرضت الجل للأشعة فوق البنفسجية والصورة التي اتخذت مع هلام نظام التوثيق.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وقد أثبتت جل الاغاروز الكهربائي إلى أن يكون وسيلة ناجعة وفعالة لفصل الأحماض النووية. قوة الاغاروز في هلام عالية تسمح لمناولة المواد الهلامية انخفاض النسبة المئوية لانفصال شظايا من الحمض النووي كبير. يتم تحديد النخل الجزيئية حسب حجم المسام التي تم إنشاؤها بواسطة حزم من الاغاروز 7 في مصفوفة هلام. بشكل عام، وارتفاع تركيز الاغاروز، أصغر من حجم المسام. جل الاغاروز التقليدية هي الأكثر فعالية في فصل شظايا من الحمض النووي بين 100 كيلوبايت و BP 25. لفصل شظايا من الحمض النووي أكبر من 25 كيلوبايت، واحد في حاجة إلى استخدام نبض هلام إستشراد مجال 6، والتي تنطوي على تطبيق التيار المتردد من اتجاهين مختلفين. وبهذه الطريقة يتم فصل أكبر شظايا من الحمض النووي الحجم من السرعة التي تعيد توجيه نفسها مع التغيرات في الاتجاه الحالي. وعلى نحو أكثر فعالية فصل شظايا من الحمض النووي أصغر من 100 شركة بريتيش بتروليوم باستخدام بولكرلميد الكهربائي للهلام. على عكسالاغاروز المواد الهلامية، ويتم تشكيل مصفوفة هلام بولكرلميد من خلال الجذور الحرة تفاعل كيميائي يحركها. هذه المواد الهلامية هي أرق من تركيز أعلى، يتم تشغيلها عموديا ويكون أفضل قرار. ويستخدم الحمض النووي في تسلسل الحديث الكهربائي الشعري، حيث يتم ملء أنابيب شعرية مع مصفوفة هلام. استخدام أنابيب شعرية يسمح لتطبيق الفولتية العالية، مما يتيح للانفصال شظايا من الحمض النووي (وتحديد تسلسل الحمض النووي) بسرعة. ويمكن تعديل الاغاروز لخلق منخفض الاغاروز ذوبان من خلال hydroxyethylation. يستخدم عادة منخفضة ذوبان الاغاروز عندما يتم المطلوب عزل شظايا من الحمض النووي المشتتة. Hydroxyethylation يقلل من كثافة التعبئة والتغليف من الحزم الاغاروز، والحد بشكل فعال حجمها المسام 8. وهذا يعني أن جزء الحمض النووي من نفس الحجم وسوف يستغرق وقتا أطول للانتقال من خلال هلام الاغاروز ذوبان منخفضة بالمقارنة مع هلام الاغاروز القياسية. لأن حزم ربط مع بعضها البعضمن خلال المنظمات غير التساهمية التفاعلات 9، فمن الممكن لإعادة صهر 1 هلام الاغاروز بعد أن وضعت. EtBr هو كاشف الأكثر شيوعا التي تستخدم لصبغ الحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز 10. عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية، يتم تنشيط الإلكترونات في الحلقة العطرية للجزيء إيثيديوم، الأمر الذي يؤدي إلى إطلاق طاقة (الضوء)، وعودة الإلكترونات إلى الحالة الأرضية. EtBr يعمل عن طريق الإقحام نفسها في جزيء الحمض النووي بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يسمح لتقدير كمية من الحمض النووي DNA في أي فرقة خاصة تقوم على شدته. بسبب تهمة إيجابية، واستخدام EtBr يقلل من معدل الهجرة الحمض النووي بنسبة 15٪. EtBr هو المغير المشتبه بهم ومسرطنة، وبالتالي لا بد من توخي الحذر عند التعامل مع المواد الهلامية الاغاروز احتوائه. وبالإضافة إلى ذلك، يعتبر EtBr نفايات خطرة ويجب التخلص منها بشكل مناسب. البقع بديلة للحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز تشمل SYBR الذهب، والأخضر SYBR، بنفسجي كريستال والأزرق الميثيل. من هؤلاء،الميثيل الأزرق والبنفسجي كريستال لا تتطلب التعرض للأشعة فوق البنفسجية هلام للرؤية شرائح الحمض النووي، مما يقلل من احتمال تحور إذا هو المطلوب استرداد جزء من الحمض النووي من الجل. ومع ذلك، والحساسيات هم أقل من EtBr. SYBR الذهب والأخضر SYBR على حد سواء، للأشعة فوق البنفسجية حساسة للغاية تعتمد على الأصباغ مع أقل سمية من EtBr، لكنها أكثر تكلفة بكثير. وعلاوة على ذلك، كل من الأصباغ البديلة إما لا يمكن أن تكون أو لا تعمل بشكل جيد عندما تضاف مباشرة إلى هلام، وبالتالي فإن جل أن تكون ملطخة آخر بعد الكهربائي. نظرا لسهولة وتكلفة الاستخدام، والحساسية، EtBr لا تزال الصبغة المفضل لكثير من الباحثين. ومع ذلك، في حالات معينة، مثل التخلص من النفايات الخطرة عندما يصعب أو عند الطلاب الشباب يؤدون تجربة، قد يكون من المفضل صبغة أقل سمية. الأصباغ المستخدمة في التحميل الكهربائي للهلام تخدم ثلاثة أغراض رئيسية. لأول مرة إضافة إلى كثافة العينة، والسماح لها تغرق في هلام. ثانيا، توفير الأصباغ لون وتبسيط عملية التحميل. وأخيرا، فإن تحرك الأصباغ في المعدلات القياسية من خلال هلام، والسماح لتقدير المسافة التي شظايا من الحمض النووي قد هاجروا. ويمكن تحديد أحجام الدقيق للشظايا من الحمض النووي مفصولة المتهم بالتآمر في سجل من الوزن الجزيئي لفرق مختلفة من الحمض النووي ضد معيار المسافة التي تقطعها كل فرقة. مستوى الحمض النووي يحتوي على مزيج من شظايا من الحمض النووي من أحجام محددة مسبقا التي يمكن مقارنتها ضد عينات من الحمض النووي غير معروف. من المهم الإشارة إلى أن أشكالا مختلفة من الحمض النووي التحرك من خلال هلام بمعدلات مختلفة. البلازميد Supercoiled، بسبب التشكل الصغير، وينتقل من خلال أسرع هلام، يليه جزء DNA خطي من نفس الحجم، مع شكل دائري مفتوح يسافر أبطأ. في الختام، منذ اعتماد المواد الهلامية الاغاروز في 1970s لفصل الحمض النووي، لديهاثبت أن واحدة من التقنيات الأكثر فائدة وتنوعا في بحوث العلوم البيولوجية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الاغاروز أنا </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> سيغما </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> زرقة البروموفينول </td><td> سيغما </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد </td><td> سيغما </td><td> E7637 </td><td> المسببة للسرطان، يجب التخلص منها كنفايات خطرة </td></tr><tr><td> حامض الخليك الجليدي </td><td> الصياد </td><td> BP2401-212 </td><td> تآكل </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylenه cyanol FF </td><td> سيغما </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> تريس قاعدة </td><td> سيغما </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> محقق / FX نظام الجل وثائق </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بومة صغيرة Easycast هلام B1 نظام الكهربائي </td><td> الحرارية العلمية </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS امدادات الطاقة 301 </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

الاغاروز هلام إستشراد هو أنجع وسيلة للفصل بين شظايا من الحمض النووي من أحجام مختلفة تتراوح بين 100 شركة بريتيش بتروليوم إلى 25 كيلو بايت 1. معزول الاغاروز من الأعشاب البحرية Gelidium جنسا والجراسيلاريا، ويتكون من agarobiose المتكررة (L-D-والجالاكتوز) مفارز 2. خلال دبق، والبوليمرات الاغاروز ربط غير تساهمي وتشكيل شبكة من الحزم الذي المسام تحديد الأحجام جل والجزيئية خصائص النخل. ثورة في استخدام هلام إستشراد الاغاروز فصل الحمض النووي. وقبل اعتماد من المواد الهلامية الاغاروز، ويفصل في المقام الأول الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي السكروز التدرج الكثافة، والتي وفرت فقط تقريبي عن حجمها. لفصل الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربي، يتم تحميل الحمض النووي في سابقة الصب آبار في الهلام والتطبيقية الحالية. واتهم سلبا على العمود الفقري الفوسفات من الحمض النووي (RNA و) جزيء، وبالتالي عندما توضع في مجال كهربائي، وشظايا من الحمض النووي الهجرة إلى صاتهم ositively الأنود. لأن الحمض النووي لديه كتلة موحدة / المسؤول عن النسبة، يتم فصل جزيئات الحمض النووي من حيث الحجم داخل هلام الاغاروز في نمط من هذا القبيل أن المسافة المقطوعة تتناسب عكسيا إلى سجل من وزنه الجزيئي 3. و&quot;منحاز reptation&quot; النموذج الرائد للحركة الحمض النووي من خلال الجل الاغاروز، حيث الحافة الأمامية تتحرك إلى الأمام وتسحب بقية جزيء على طول 4. يتم تحديد معدل الهجرة من جزيء الحمض النووي من خلال مادة هلامية من قبل ما يلي: حجم 1) من جزيء الحمض النووي، 2) الاغاروز تركيز، 3) التشكل DNA 5، 4) الجهد التطبيقية، 5) وجود بروميد إيثيديوم، 6) نوع من عازلة الكهربائي الاغاروز و 7). بعد الانفصال، لا يمكن للجزيئات الحمض النووي يمكن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد تلطيخ مع صبغ المناسبة. باتباع هذا البروتوكول، يجب أن يكون الطالب قادرا على: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الآلية التي يتم فصل شظايا من الحمض النووي داخل مصفوفة هلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم كيفية التشكل للوجزيء الحمض النووي تحديد التنقل من خلال مصفوفة هلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على حل الاغاروز من تركيز مناسب لاحتياجاتهم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هلام الاغاروز الكهربائي من لعينات من الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجهاز الكهربائي للهلام وامدادات الطاقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الجهد المناسب لانفصال شظايا من الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الآلية التي إيثيديوم بروميد يسمح التصور من عصابات الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أحجام شظايا من الحمض النووي فصل </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

757.7K Views.  University of California Los Angeles. يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

تغيير طبيعة الكهربائي جل التدرج (DGGE)

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

الفحص الأمثل الفايبرين الخرزة جل لدراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

الكشف عن تجميع اميلويد بواسطة تغيير طبيعة شبه الكهربائي جل منظفات - Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

Electroeluting شظايا الحمض النووي

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

زرقاء هلام بولي أكريلاميد الأصلية الكهربائي (BN - PAGE) للتحليل من المجمعات Multiprotein Lysates الخليوي

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

تصور الوسطيات المتماثل للأشعة فوق البنفسجية يتسبب في E. القولونية ثنائي الأبعاد باستخدام Agarose جل التحليل

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...