Name: agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

1. إعداد جيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج الكتلة المناسبة من الاغاروز الى دورق مخروطي. وتعد المواد الهلامية الاغاروز باستخدام AW / الخامس حل مئوية. سيكون تركيز الاغاروز في جل تعتمد على أحجام شظايا من الحمض النووي يمكن فصلها، مع معظم المواد الهلامية التي تتراوح بين 0.5٪ -2٪. وينبغي أن حجم المخزن المؤقت لا يكون أكبر من 1/3 من قدرة قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تشغيل العازلة القارورة التي تحتوي على الاغاروز. دوامة لخلط. الجل الأكثر شيوعا تشغيل مخازن هي تاي (40 ملم تريس، خلات، 1 ملم EDTA) وTBE (45 مم، تريس بورات، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوب الخليط الاغاروز / العازلة. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك عن طريق تسخين في الميكروويف، ولكن يمكن أيضا أن يتم على نار بنسن. على فترات ق 30، إزالة قارورة وعباب المحتويات إلى مزيج جيد. كرر حتى الاغاروز قد حلت تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إيثيديوم بروميد (EtBr) إلى تركيز 0.5 ميكروغرام / مل. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن جل ملطخة بعد الكهربائيةرحلان في تشغيل العازلة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr عن 15-30 دقيقة، تليها destaining في تشغيل المخزن المؤقت لمدة متساوية من الزمن. </li></ol> ملاحظة: EtBr هو مادة مسرطنة مشتبه بهم، ويجب التخلص منها بطريقة صحيحة في لوائح المؤسسة. وينبغي دائما أن ترتديه قفازات عند التعامل مع المواد الهلامية التي تحتوي على EtBr. الأصباغ البديلة لتلطيخ من الحمض النووي متاحة، ومع ذلك لا يزال EtBr الأكثر شعبية واحدة نظرا لحساسيتها والتكلفة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتبريد الاغاروز إما على الفوق أو حضانة في حمام ماء 65 درجة مئوية. وعدم القيام بذلك تشوه علبة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع علبة الجل في جهاز الصب. بدلا من ذلك، قد شريط واحد أيضا على حواف مفتوحة من علبة الجل لخلق القالب. تضع مشط المناسبة في القالب هلام لإنشاء الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الاغاروز المنصهر في القالب الجل. السماح للالاغاروز لتعيين في درجة حرارة الغرفة. إزالة مشط ووضع الجل في المربع هلام. بدلا من ذلك، زويمكن أيضا أن تكون ملفوفة في شرم الاغطية البلاستيكية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدام (الشكل 1). </li></ol> 2. إنشاء جهاز جل والفصل بين أجزاء الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تحميل صبغ عينات من الحمض النووي لا بد من فصل (الشكل 2). يتم عادة جل التحميل صبغ في تركيز 6X (0.25٪ برومفينول الزرقاء، 0.25٪ cyanol الزيلين، 30 الجلسرين٪). التحميل صبغ يساعد على تتبع مدى عينة الحمض النووي الخاص بك قد سافر، ويسمح أيضا العينة لتغرق في هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج التيار الكهربائي إلى الجهد المطلوب (1-5V/cm بين الأقطاب الكهربائية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة يكفي العازلة تشغيل لتغطية سطح هلام. من المهم لاستخدام المخزن المؤقت تشغيل نفسه بوصفها واحدة تستخدم لتحضير هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق يؤدي من مربع هلام لامدادات الطاقة. بدوره على امدادات الطاقة والتحقق من أن كلا من صندوق جل وامدادات الطاقة والعمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء. ببطءوتحميل بعناية عينة من الحمض النووي (ق) في هلام (الشكل 3). وينبغي دائما على حجم الحمض النووي مناسبة علامة يمكن تحميل جنبا إلى جنب مع نماذج تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال غطاء لصندوق هلام. وينبغي أن الكاثود (الخيوط السوداء) تكون أقرب الآبار من (الخيوط الحمراء) الأنود. مضاعفة التحقق التي تم توصيل أقطاب كهربائية في فتحات الصحيح في امدادات الطاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على السلطة. تشغيل هلام حتى الصبغة قد هاجروا إلى مسافة مناسبة. </li></ol> 3. ملاحظة شظايا من الحمض النووي مطلق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما أكملت الكهربائي، إيقاف تشغيل التيار الكهربائي وإزالة غطاء العلبة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من مربع هلام. تصريف فائض العازلة من على سطح الأرض من هلام. وضع علبة الجل على مناشف ورقية لامتصاص أي عازلة إضافية قيد التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من علبة الجل وفضح هلام للأشعة فوق البنفسجية. هو الأكثر شيوعا ويتم ذلك باستخدام نظام وثائق هلام (الشكل 4). وينبغي أن عصابات الحمض النووي تظهرعلى النحو العصابات فلوري البرتقالي. التقاط صورة من هلام (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص السليم من الجل وتشغيل العازلة في لوائح المؤسسة. </li></ol> 4. ممثل النتائج الشكل 5 يمثل نتيجة نموذجي بعد الكهربائي للهلام الاغاروز من المنتجات PCR. بعد الانفصال، وشظايا من الحمض النووي الناتج مرئية كما نطاقات محددة بوضوح. يجب أن يتم فصل معيار الحمض النووي أو سلم إلى درجة تسمح لتقرير مفيد من أحجام عينة العصابات. في المثال المعروض، ويفصل شظايا من الحمض النووي من 765 شركة بريتيش بتروليوم، BP 880 و بي بي 1022 على جل الاغاروز 1.5٪ جنبا إلى جنب مع سلم DNA 2-السجل. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> الشكل 1. جل الاغاروز طدت بعد إزالة المشط. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> الشكل 2. على الطالب إضافة إلى صبغ التحميل عينات من الحمض النووي لها. <img alt="الشكل 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> الشكل 3. الطالب تحميل عينة من الحمض النووي في بئر في هلام. <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> الشكل 4. مثال على هلام نظام التوثيق. <img alt="الشكل 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> الشكل 5. صورة لهلام إستشراد آخر. وأضيف إلى EtBr الجل قبل الكهربائي إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / لتر، يليه فصل في 100 فولت لمدة 1 ساعة. تعرضت الجل للأشعة فوق البنفسجية والصورة التي اتخذت مع هلام نظام التوثيق.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وقد أثبتت جل الاغاروز الكهربائي إلى أن يكون وسيلة ناجعة وفعالة لفصل الأحماض النووية. قوة الاغاروز في هلام عالية تسمح لمناولة المواد الهلامية انخفاض النسبة المئوية لانفصال شظايا من الحمض النووي كبير. يتم تحديد النخل الجزيئية حسب حجم المسام التي تم إنشاؤها بواسطة حزم من الاغاروز 7 في مصفوفة هلام. بشكل عام، وارتفاع تركيز الاغاروز، أصغر من حجم المسام. جل الاغاروز التقليدية هي الأكثر فعالية في فصل شظايا من الحمض النووي بين 100 كيلوبايت و BP 25. لفصل شظايا من الحمض النووي أكبر من 25 كيلوبايت، واحد في حاجة إلى استخدام نبض هلام إستشراد مجال 6، والتي تنطوي على تطبيق التيار المتردد من اتجاهين مختلفين. وبهذه الطريقة يتم فصل أكبر شظايا من الحمض النووي الحجم من السرعة التي تعيد توجيه نفسها مع التغيرات في الاتجاه الحالي. وعلى نحو أكثر فعالية فصل شظايا من الحمض النووي أصغر من 100 شركة بريتيش بتروليوم باستخدام بولكرلميد الكهربائي للهلام. على عكسالاغاروز المواد الهلامية، ويتم تشكيل مصفوفة هلام بولكرلميد من خلال الجذور الحرة تفاعل كيميائي يحركها. هذه المواد الهلامية هي أرق من تركيز أعلى، يتم تشغيلها عموديا ويكون أفضل قرار. ويستخدم الحمض النووي في تسلسل الحديث الكهربائي الشعري، حيث يتم ملء أنابيب شعرية مع مصفوفة هلام. استخدام أنابيب شعرية يسمح لتطبيق الفولتية العالية، مما يتيح للانفصال شظايا من الحمض النووي (وتحديد تسلسل الحمض النووي) بسرعة. ويمكن تعديل الاغاروز لخلق منخفض الاغاروز ذوبان من خلال hydroxyethylation. يستخدم عادة منخفضة ذوبان الاغاروز عندما يتم المطلوب عزل شظايا من الحمض النووي المشتتة. Hydroxyethylation يقلل من كثافة التعبئة والتغليف من الحزم الاغاروز، والحد بشكل فعال حجمها المسام 8. وهذا يعني أن جزء الحمض النووي من نفس الحجم وسوف يستغرق وقتا أطول للانتقال من خلال هلام الاغاروز ذوبان منخفضة بالمقارنة مع هلام الاغاروز القياسية. لأن حزم ربط مع بعضها البعضمن خلال المنظمات غير التساهمية التفاعلات 9، فمن الممكن لإعادة صهر 1 هلام الاغاروز بعد أن وضعت. EtBr هو كاشف الأكثر شيوعا التي تستخدم لصبغ الحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز 10. عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية، يتم تنشيط الإلكترونات في الحلقة العطرية للجزيء إيثيديوم، الأمر الذي يؤدي إلى إطلاق طاقة (الضوء)، وعودة الإلكترونات إلى الحالة الأرضية. EtBr يعمل عن طريق الإقحام نفسها في جزيء الحمض النووي بطريقة تعتمد على التركيز. وهذا يسمح لتقدير كمية من الحمض النووي DNA في أي فرقة خاصة تقوم على شدته. بسبب تهمة إيجابية، واستخدام EtBr يقلل من معدل الهجرة الحمض النووي بنسبة 15٪. EtBr هو المغير المشتبه بهم ومسرطنة، وبالتالي لا بد من توخي الحذر عند التعامل مع المواد الهلامية الاغاروز احتوائه. وبالإضافة إلى ذلك، يعتبر EtBr نفايات خطرة ويجب التخلص منها بشكل مناسب. البقع بديلة للحمض النووي في المواد الهلامية الاغاروز تشمل SYBR الذهب، والأخضر SYBR، بنفسجي كريستال والأزرق الميثيل. من هؤلاء،الميثيل الأزرق والبنفسجي كريستال لا تتطلب التعرض للأشعة فوق البنفسجية هلام للرؤية شرائح الحمض النووي، مما يقلل من احتمال تحور إذا هو المطلوب استرداد جزء من الحمض النووي من الجل. ومع ذلك، والحساسيات هم أقل من EtBr. SYBR الذهب والأخضر SYBR على حد سواء، للأشعة فوق البنفسجية حساسة للغاية تعتمد على الأصباغ مع أقل سمية من EtBr، لكنها أكثر تكلفة بكثير. وعلاوة على ذلك، كل من الأصباغ البديلة إما لا يمكن أن تكون أو لا تعمل بشكل جيد عندما تضاف مباشرة إلى هلام، وبالتالي فإن جل أن تكون ملطخة آخر بعد الكهربائي. نظرا لسهولة وتكلفة الاستخدام، والحساسية، EtBr لا تزال الصبغة المفضل لكثير من الباحثين. ومع ذلك، في حالات معينة، مثل التخلص من النفايات الخطرة عندما يصعب أو عند الطلاب الشباب يؤدون تجربة، قد يكون من المفضل صبغة أقل سمية. الأصباغ المستخدمة في التحميل الكهربائي للهلام تخدم ثلاثة أغراض رئيسية. لأول مرة إضافة إلى كثافة العينة، والسماح لها تغرق في هلام. ثانيا، توفير الأصباغ لون وتبسيط عملية التحميل. وأخيرا، فإن تحرك الأصباغ في المعدلات القياسية من خلال هلام، والسماح لتقدير المسافة التي شظايا من الحمض النووي قد هاجروا. ويمكن تحديد أحجام الدقيق للشظايا من الحمض النووي مفصولة المتهم بالتآمر في سجل من الوزن الجزيئي لفرق مختلفة من الحمض النووي ضد معيار المسافة التي تقطعها كل فرقة. مستوى الحمض النووي يحتوي على مزيج من شظايا من الحمض النووي من أحجام محددة مسبقا التي يمكن مقارنتها ضد عينات من الحمض النووي غير معروف. من المهم الإشارة إلى أن أشكالا مختلفة من الحمض النووي التحرك من خلال هلام بمعدلات مختلفة. البلازميد Supercoiled، بسبب التشكل الصغير، وينتقل من خلال أسرع هلام، يليه جزء DNA خطي من نفس الحجم، مع شكل دائري مفتوح يسافر أبطأ. في الختام، منذ اعتماد المواد الهلامية الاغاروز في 1970s لفصل الحمض النووي، لديهاثبت أن واحدة من التقنيات الأكثر فائدة وتنوعا في بحوث العلوم البيولوجية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الاغاروز أنا </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> سيغما </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> زرقة البروموفينول </td><td> سيغما </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد </td><td> سيغما </td><td> E7637 </td><td> المسببة للسرطان، يجب التخلص منها كنفايات خطرة </td></tr><tr><td> حامض الخليك الجليدي </td><td> الصياد </td><td> BP2401-212 </td><td> تآكل </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylenه cyanol FF </td><td> سيغما </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> تريس قاعدة </td><td> سيغما </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> محقق / FX نظام الجل وثائق </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بومة صغيرة Easycast هلام B1 نظام الكهربائي </td><td> الحرارية العلمية </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS امدادات الطاقة 301 </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

الاغاروز هلام إستشراد هو أنجع وسيلة للفصل بين شظايا من الحمض النووي من أحجام مختلفة تتراوح بين 100 شركة بريتيش بتروليوم إلى 25 كيلو بايت 1. معزول الاغاروز من الأعشاب البحرية Gelidium جنسا والجراسيلاريا، ويتكون من agarobiose المتكررة (L-D-والجالاكتوز) مفارز 2. خلال دبق، والبوليمرات الاغاروز ربط غير تساهمي وتشكيل شبكة من الحزم الذي المسام تحديد الأحجام جل والجزيئية خصائص النخل. ثورة في استخدام هلام إستشراد الاغاروز فصل الحمض النووي. وقبل اعتماد من المواد الهلامية الاغاروز، ويفصل في المقام الأول الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي السكروز التدرج الكثافة، والتي وفرت فقط تقريبي عن حجمها. لفصل الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربي، يتم تحميل الحمض النووي في سابقة الصب آبار في الهلام والتطبيقية الحالية. واتهم سلبا على العمود الفقري الفوسفات من الحمض النووي (RNA و) جزيء، وبالتالي عندما توضع في مجال كهربائي، وشظايا من الحمض النووي الهجرة إلى صاتهم ositively الأنود. لأن الحمض النووي لديه كتلة موحدة / المسؤول عن النسبة، يتم فصل جزيئات الحمض النووي من حيث الحجم داخل هلام الاغاروز في نمط من هذا القبيل أن المسافة المقطوعة تتناسب عكسيا إلى سجل من وزنه الجزيئي 3. و&quot;منحاز reptation&quot; النموذج الرائد للحركة الحمض النووي من خلال الجل الاغاروز، حيث الحافة الأمامية تتحرك إلى الأمام وتسحب بقية جزيء على طول 4. يتم تحديد معدل الهجرة من جزيء الحمض النووي من خلال مادة هلامية من قبل ما يلي: حجم 1) من جزيء الحمض النووي، 2) الاغاروز تركيز، 3) التشكل DNA 5، 4) الجهد التطبيقية، 5) وجود بروميد إيثيديوم، 6) نوع من عازلة الكهربائي الاغاروز و 7). بعد الانفصال، لا يمكن للجزيئات الحمض النووي يمكن تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد تلطيخ مع صبغ المناسبة. باتباع هذا البروتوكول، يجب أن يكون الطالب قادرا على: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الآلية التي يتم فصل شظايا من الحمض النووي داخل مصفوفة هلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم كيفية التشكل للوجزيء الحمض النووي تحديد التنقل من خلال مصفوفة هلام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على حل الاغاروز من تركيز مناسب لاحتياجاتهم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد هلام الاغاروز الكهربائي من لعينات من الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجهاز الكهربائي للهلام وامدادات الطاقة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الجهد المناسب لانفصال شظايا من الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الآلية التي إيثيديوم بروميد يسمح التصور من عصابات الحمض النووي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أحجام شظايا من الحمض النووي فصل </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

763.1K Views.  University of California Los Angeles. يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Biochemistry

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

هلام-seq: طريقة لإعداد مكتبة تسلسل واحد من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي باستخدام مصفوفات المائية

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioengineering

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.
This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Gel Purification: Recovery of DNA Fragments after Electrophoretic Separation

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

الحمض النووي الاغاروز هلام الرحلان الكهربائي

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

JoVE Core

Molecular Biology

Unit 2

Studying DNA and RNA

KEY TERMS AND CONCEPTS

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ثنائي الأبعاد: تقنية فصل لتحليل البروتينات في خليط البروتين المركب بناء على الشحنة والوزن الجزيئي

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

EoE Sub Articles

Agarose Gel Electrophoresis of DNA Amplicons Post PCR: A Method to Analyze Products of Multiplex PCR and Evaluate PCR Reaction Success

According to the manufacturer&#39;s recommendations, add agarose gel powder in 1x TBE buffer to reach 1.5 (weight/volume) percent, and heat to dissolve.
Prior to casting, tilt the dissolved gel solution briefly under running water. Add 5 microliters of fluorescent nucleic acid dye per 50 microliters of gel solution, and mix.
Assemble and level the casting tray. Add combs as appropriate for the number of samples. Pour the gel solution into the cast, and wait for it to solidify.
After that, submerge the cast containing the gel in 1x TBE buffer in a gel electrophoresis system. Mix 5 microliters of the PCR products together with 2 microliters of loading dye in new PCR strips. Transfer 5 microliters of the mixtures to the wells in the gel. Save at least one well empty. Add 5 microliters of DNA ladder in the empty well for reference.
Plug in the electrodes and run the gel at 110 volts per 15 centimeters for approximately 1 hour. Use a UV-based gel imaging system to verify the presence of multiple bands representing PCR amplicons.

الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز لأمبليكونات الحمض النووي بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): طريقة لتحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال وتقييم نجاح تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل