1. Preparação do Gel <ol><li> Pesar a massa adequada de agarose em um balão de Erlenmeyer. Géis de agarose são preparadas utilizando aw / v solução percentagem. A concentração de agarose num gel dependerá dos tamanhos dos fragmentos de ADN a ser separado, com a maioria dos géis que variam entre 0,5% -2%. O volume do tampão não deve ser maior do que 1/3 da capacidade do balão. </li><li> Adicionar tampão de corrida para o balão de agarose contendo. Agite para misturar. O gel mais comum em execução buffers são TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Derreta a mistura de agarose / buffer. Esta é mais comumente feito por aquecimento em microondas, mas também pode ser feito ao longo de uma chama de Bunsen. Em intervalos de 30 s, retirar o balão e agite o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose foi completamente dissolvido. </li><li> Adicionar brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 0,5 ug / ml. Alternativamente, o gel pode também ser coradas após electroforese em tampão de corrida contendo 0,5 ug / ml para EtBr 15-30 min, seguido de descoloração em tampão de corrida para um comprimento igual de tempo. </li></ol> Nota: EtBr é suspeito de ser carcinogênico e devem ser eliminadas de acordo com as normas da instituição. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis contendo EtBr. Corantes alternativos para a coloração do ADN estão disponíveis, no entanto EtBr continua a ser a mais popular devido à sua sensibilidade e custo. <ol start="5"><li> Permitir que a agarose para arrefecer tanto na bancada ou por incubação em um banho de água 65 ° C. Não fazer isso irá deformar a bandeja de gel. </li><li> Coloque o tabuleiro de gel dentro do aparelho de fundição. Alternativamente, pode-se também fita as extremidades abertas de um tabuleiro de gel para criar um molde. Coloque um pente apropriado para dentro do molde de gel para criar os poços. </li><li> Verter a agarose fundida no molde de gel. Permitir que a agarose para definir a temperatura ambiente. Remover o pente e colocar o gel na caixa de gel. Alternativamente, o gel também pode ser envolto em película de plástico e armazenado a 4 ° C até à sua utilização (Fig. 1). </li></ol> 2. Criação de Aparelhos Gel e separação dos fragmentos de DNA <ol><li> Adicionar carregamento corante para as amostras de DNA a ser separada (fig. 2). Carga de gel de corante é tipicamente feito a uma concentração 6X (0,25% azul de bromofenol, xilenocianol a 0,25%, 30% de glicerol). Carregando tintura ajuda a controlar o quanto sua amostra de DNA viajou, e também permite que a amostra afundar no gel. </li><li> Programa oferta o poder de tensão desejada (1-5V/cm entre os eletrodos). </li><li> Adicionar tampão de corrida suficiente para cobrir a superfície do gel. É importante usar o mesmo tampão executado como o utilizado para preparar o gel. </li><li> Ligue os fios da caixa de gel para o fornecimento de energia. Ligue a fonte de alimentação e verificar que tanto a caixa de gel e fonte de alimentação estão funcionando. </li><li> Remover a tampa. Lentamentee cuidadosamente carregar a amostra de DNA (s) para dentro do gel (Fig. 3). Um marcador de tamanho apropriado de DNA devem sempre ser carregado juntamente com amostras experimentais. </li><li> Colocar a tampa para a caixa de gel. O cátodo (fios pretos) deve estar mais perto dos poços do que o ânodo (pistas vermelhas). Verifique se os eletrodos estão conectados nos slots corretos no fornecimento de energia. </li><li> Ligue a alimentação. Executar o gel até o corante tenha migrado para uma distância apropriada. </li></ol> 3. Observando fragmentos de DNA separados <ol><li> Quando eletroforese foi concluído, desligue a fonte de alimentação e retire a tampa da caixa de gel. </li><li> Remover gel a partir da caixa de gel. Drenar o tampão em excesso a partir da superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em papel toalha para absorver qualquer buffer extra em execução. </li><li> Remover o gel a partir do tabuleiro de gel e expõe o gel à luz UV. Esta é mais comumente feito usando um sistema de documentação gel (Fig. 4). Bandas de DNA deve mostraracima como laranja bandas fluorescentes. Tire uma foto do gel (Fig. 5). </li><li> Descarte a gel e tampão de corrida por regulamentos da instituição. </li></ol> 4. Os resultados representativos A Figura 5 representa um resultado típico após electroforese em gel de agarose de produtos de PCR. Após a separação, os fragmentos de DNA resultantes são visíveis como bandas claramente definidos. O padrão de ADN ou de escada devem ser separados a um grau que permite a determinação útil dos tamanhos das bandas da amostra. No exemplo mostrado, fragmentos de DNA de 765 pb, 880 pb e 1022 pb foram separados num gel de agarose a 1,5%, juntamente com uma escada de DNA 2-log. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Um solidificou em gel de agarose após a remoção do pente. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Um estudante adicionando corante de carregamento para as amostras de DNA. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Um estudante carregamento da amostra de DNA dentro de um poço no gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Um exemplo de um sistema de documentação de gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. Uma imagem de uma electroforese em gel de pós. EtBr foi adicionado ao gel antes de electroforese para uma concentração final de 0,5 ug / ml, seguido de separação a 100 V durante 1 hora. O gel foi exposto a luz UV e da fotografia tirada com um sistema de documentação de gel.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Electroforese em gel de agarose provou ser um modo eficiente e eficaz de separar ácidos nucleicos. Força de agarose de gel de alta permite a manipulação de géis percentuais de baixo custo para a separação de fragmentos de ADN de grande porte. Peneiração molecular é determinado pelo tamanho dos poros gerados pelos feixes de agarose 7 na matriz de gel. Em geral, quanto maior a concentração de agarose, quanto menor o tamanho dos poros. Géis de agarose tradicionais são mais eficazes na separação de fragmentos de ADN entre 100 bp e 25 kb. Para separar fragmentos de ADN maiores do que 25 kb, uma será necessário usar pulso electroforese em gel de campo 6, que envolve a aplicação de corrente alternada a partir de duas direcções diferentes. Deste modo maiores fragmentos de DNA são separados por tamanho a velocidade a que eles reorientar-se com as mudanças na direcção da corrente. Os fragmentos de DNA mais pequenos do que 100 pb são mais eficazmente separados usando electroforese em gel de poliacrilamida. Ao contráriogéis de agarose, a matriz de gel de poliacrilamida é formada através de uma reacção química de radical livre accionado. Estes géis são mais finas de maior concentração, são executados na vertical e tem uma melhor resolução. No DNA moderna sequenciação electroforese capilar é usado, em que tubos capilares são preenchidos com uma matriz de gel. A utilização de tubos capilares permite a aplicação de tensões elevadas, permitindo assim a separação de fragmentos de DNA (e à determinação da sequência de ADN) rapidamente. Agarose pode ser modificada para criar baixo ponto de fusão de agarose através hydroxyethylation. Baixo ponto de fusão de agarose é geralmente usado quando o isolamento de fragmentos de DNA separados é desejada. Hydroxyethylation reduz a densidade de empacotamento dos feixes de agarose, reduzindo efectivamente o seu tamanho de poro 8. Isto significa que um fragmento de ADN do mesmo tamanho levará mais tempo para se mover através de um baixo ponto de fusão gel de agarose em oposição a um gel de agarose padrão. Porque os feixes associar com um outroatravés de interacções não covalentes 9, é possível re-derreter gel de agarose um depois de ter definido. EtBr é o reagente mais comum utilizado para corar o DNA em géis de agarose a 10. Quando exposta à luz UV, os electrões no anel aromático da molécula de etídio são activadas, o que leva à libertação de energia (luz) como o retorno electrões para estado fundamental. EtBr funciona por intercalando-se na molécula de ADN de uma forma dependente da concentração. Isto permite a uma estimativa da quantidade de DNA em qualquer banda de DNA particular com base na sua intensidade. Devido à sua carga positiva, o uso de EtBr reduz a taxa de migração de DNA em 15%. EtBr é um agente mutagênico e carcinogênico suspeito, portanto é preciso cuidado ao manusear géis de agarose que o contenham. Além disso, é considerado um EtBr resíduos perigosos e devem ser eliminados de forma adequada. Manchas alternativos para DNA em gel de agarose incluem SYBR Gold, SYBR verde, Cristal Violeta Metil e Azul. Destes,Metil Blue e Cristal Violeta não requerem a exposição do gel à luz UV para a visualização das bandas de DNA, reduzindo assim a probabilidade de mutação se a recuperação do fragmento de ADN a partir do gel é desejada. No entanto, as suas sensibilidades são mais baixos do que a de EtBr. SYBR ouro e SYBR verdes são ambos altamente sensíveis, uv corantes dependentes, com menor toxicidade do que EtBr, mas são consideravelmente mais caros. Além disso, todos os corantes alternativos ou não pode ser ou não funcionam bem quando adicionado directamente ao gel, portanto, o gel terá de ser coradas pós após a electroforese. Devido à facilidade de custo, de uso, e sensibilidade, EtBr continua a ser o corante de escolha para muitos investigadores. No entanto, em determinadas situações, tais como quando a eliminação de resíduos perigosos é difícil ou quando jovens são realizar um experimento, um corante menos tóxica pode ser preferido. Corantes de carregamento utilizadas no eletroforese em gel de servir a três propósitos principais. Primeiro adicionam densidade para a amostra, Permitindo que a afundar-se no gel. Em segundo lugar, os corantes proporcionar cor e simplificar o processo de carregamento. Finalmente, os corantes mover na taxa padrão através do gel, o que permite para a estimativa da distância que os fragmentos de DNA ter migrado. As dimensões exactas dos fragmentos de DNA separados pode ser determinada através da representação gráfica do logaritmo do peso molecular das bandas diferentes de um padrão de DNA contra a distância percorrida por cada banda. O padrão de DNA contém uma mistura de fragmentos de ADN de tamanhos pré-determinados que podem ser comparados contra as amostras de DNA desconhecidos. É importante notar que as diferentes formas de ADN mover-se através do gel com taxas diferentes. DNA de plasmídeo superenrolado, devido à sua conformação compacta, se move através da rápida em gel, seguida por um fragmento de DNA linear do mesmo tamanho, com a forma circular aberta viajando o mais lento. Em conclusão, uma vez que a adopção de géis de agarose na década de 1970 para a separação de DNA, que temprovado ser uma das técnicas mais úteis e versáteis na investigação ciências biológicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Eu Agarose </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> O brometo de etídio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerígeno-precisa ser eliminados como resíduos perigosos </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tronco e ramose cianol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigador / FX sistema de documentação de gel </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coruja Easycast B1 mini-sistema de eletroforese em gel </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS fonte de alimentação 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

De agarose de electroforese em gel é a forma mais eficaz de separar fragmentos de ADN de tamanhos variados que variam de 100 pb a 25 kb 1. De agarose é isolado a partir da alga géneros Gelidium e Gracilaria, e consiste de agarobiose repetido (L-e D-galactose) subunidades 2. Durante a gelificação, os polímeros de agarose associar não covalentemente e formam uma rede de feixes cujos poros tamanhos determinar um gel moleculares propriedades de peneiração. A utilização de electroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA. Antes da adopção de géis de agarose, o DNA foi primeiramente separados utilizando sacarose centrifugação em gradiente de densidade, que apresentou apenas uma aproximação de tamanho. Para separar o DNA usando electroforese em gel de agarose, o DNA é carregado no pré-moldados poços no gel e uma corrente aplicada. A espinha dorsal do fosfato do ADN (e RNA) molécula é carregada negativamente, por conseguinte, quando colocado num campo eléctrico, fragmentos de ADN irá migrar para a positively carregada ânodo. Como o DNA tem uma relação de massa / carga uniforme, moléculas de DNA são separados por tamanho dentro de um gel de agarose num padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular 3. O modelo principal para o movimento de DNA através de um gel de agarose é &quot;enviesada reptation&quot;, em que o bordo de ataque se move para a frente e puxa o resto da molécula ao longo de 4. A taxa de migração de uma molécula de DNA através de um gel é determinada pela sequência: tamanho 1) da molécula de ADN, 2) concentração de agarose, 3) conformação de DNA 5, 4) presença de tensão aplicada, 5) de brometo de etídio, 6) tipo de agarose e 7) tampão de electroforese. Após a separação, as moléculas de ADN podem ser visualizados sob luz UV, após coloração com um corante apropriado. Seguindo este protocolo, os alunos deverão ser capazes de: <ol><li> Compreender o mecanismo pelo qual os fragmentos de DNA são separados dentro de uma matriz de gel </li><li> Entenda como conformação daMolécula de ADN irá determinar a sua mobilidade por meio de uma matriz de gel </li><li> Identificar uma solução de agarose de concentração adequada para suas necessidades </li><li> Preparar um gel de agarose para eletroforese de amostras de DNA </li><li> Configure o aparelho de eletroforese em gel e fonte de alimentação </li><li> Seleccionar uma tensão apropriada para a separação de fragmentos de ADN </li><li> Compreender o mecanismo pelo qual o brometo de etídio permite a visualização das bandas de DNA </li><li> Determinar os tamanhos dos fragmentos de DNA separados </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

761.4K visualizações.  University of California Los Angeles. Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Vídeo: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Biologia

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

Electroeluting fragmentos de DNA

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

Separação eletroforética de proteínas

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Electroeluting fragmentos de DNA

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados Celular

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

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Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

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Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Electroeluting fragmentos de DNA

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados Celular