1. Preparação do Gel <ol><li> Pesar a massa adequada de agarose em um balão de Erlenmeyer. Géis de agarose são preparadas utilizando aw / v solução percentagem. A concentração de agarose num gel dependerá dos tamanhos dos fragmentos de ADN a ser separado, com a maioria dos géis que variam entre 0,5% -2%. O volume do tampão não deve ser maior do que 1/3 da capacidade do balão. </li><li> Adicionar tampão de corrida para o balão de agarose contendo. Agite para misturar. O gel mais comum em execução buffers são TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Derreta a mistura de agarose / buffer. Esta é mais comumente feito por aquecimento em microondas, mas também pode ser feito ao longo de uma chama de Bunsen. Em intervalos de 30 s, retirar o balão e agite o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose foi completamente dissolvido. </li><li> Adicionar brometo de etídio (EtBr) a uma concentração de 0,5 ug / ml. Alternativamente, o gel pode também ser coradas após electroforese em tampão de corrida contendo 0,5 ug / ml para EtBr 15-30 min, seguido de descoloração em tampão de corrida para um comprimento igual de tempo. </li></ol> Nota: EtBr é suspeito de ser carcinogênico e devem ser eliminadas de acordo com as normas da instituição. As luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis contendo EtBr. Corantes alternativos para a coloração do ADN estão disponíveis, no entanto EtBr continua a ser a mais popular devido à sua sensibilidade e custo. <ol start="5"><li> Permitir que a agarose para arrefecer tanto na bancada ou por incubação em um banho de água 65 ° C. Não fazer isso irá deformar a bandeja de gel. </li><li> Coloque o tabuleiro de gel dentro do aparelho de fundição. Alternativamente, pode-se também fita as extremidades abertas de um tabuleiro de gel para criar um molde. Coloque um pente apropriado para dentro do molde de gel para criar os poços. </li><li> Verter a agarose fundida no molde de gel. Permitir que a agarose para definir a temperatura ambiente. Remover o pente e colocar o gel na caixa de gel. Alternativamente, o gel também pode ser envolto em película de plástico e armazenado a 4 ° C até à sua utilização (Fig. 1). </li></ol> 2. Criação de Aparelhos Gel e separação dos fragmentos de DNA <ol><li> Adicionar carregamento corante para as amostras de DNA a ser separada (fig. 2). Carga de gel de corante é tipicamente feito a uma concentração 6X (0,25% azul de bromofenol, xilenocianol a 0,25%, 30% de glicerol). Carregando tintura ajuda a controlar o quanto sua amostra de DNA viajou, e também permite que a amostra afundar no gel. </li><li> Programa oferta o poder de tensão desejada (1-5V/cm entre os eletrodos). </li><li> Adicionar tampão de corrida suficiente para cobrir a superfície do gel. É importante usar o mesmo tampão executado como o utilizado para preparar o gel. </li><li> Ligue os fios da caixa de gel para o fornecimento de energia. Ligue a fonte de alimentação e verificar que tanto a caixa de gel e fonte de alimentação estão funcionando. </li><li> Remover a tampa. Lentamentee cuidadosamente carregar a amostra de DNA (s) para dentro do gel (Fig. 3). Um marcador de tamanho apropriado de DNA devem sempre ser carregado juntamente com amostras experimentais. </li><li> Colocar a tampa para a caixa de gel. O cátodo (fios pretos) deve estar mais perto dos poços do que o ânodo (pistas vermelhas). Verifique se os eletrodos estão conectados nos slots corretos no fornecimento de energia. </li><li> Ligue a alimentação. Executar o gel até o corante tenha migrado para uma distância apropriada. </li></ol> 3. Observando fragmentos de DNA separados <ol><li> Quando eletroforese foi concluído, desligue a fonte de alimentação e retire a tampa da caixa de gel. </li><li> Remover gel a partir da caixa de gel. Drenar o tampão em excesso a partir da superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em papel toalha para absorver qualquer buffer extra em execução. </li><li> Remover o gel a partir do tabuleiro de gel e expõe o gel à luz UV. Esta é mais comumente feito usando um sistema de documentação gel (Fig. 4). Bandas de DNA deve mostraracima como laranja bandas fluorescentes. Tire uma foto do gel (Fig. 5). </li><li> Descarte a gel e tampão de corrida por regulamentos da instituição. </li></ol> 4. Os resultados representativos A Figura 5 representa um resultado típico após electroforese em gel de agarose de produtos de PCR. Após a separação, os fragmentos de DNA resultantes são visíveis como bandas claramente definidos. O padrão de ADN ou de escada devem ser separados a um grau que permite a determinação útil dos tamanhos das bandas da amostra. No exemplo mostrado, fragmentos de DNA de 765 pb, 880 pb e 1022 pb foram separados num gel de agarose a 1,5%, juntamente com uma escada de DNA 2-log. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Um solidificou em gel de agarose após a remoção do pente. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Um estudante adicionando corante de carregamento para as amostras de DNA. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Um estudante carregamento da amostra de DNA dentro de um poço no gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Um exemplo de um sistema de documentação de gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. Uma imagem de uma electroforese em gel de pós. EtBr foi adicionado ao gel antes de electroforese para uma concentração final de 0,5 ug / ml, seguido de separação a 100 V durante 1 hora. O gel foi exposto a luz UV e da fotografia tirada com um sistema de documentação de gel.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Electroforese em gel de agarose provou ser um modo eficiente e eficaz de separar ácidos nucleicos. Força de agarose de gel de alta permite a manipulação de géis percentuais de baixo custo para a separação de fragmentos de ADN de grande porte. Peneiração molecular é determinado pelo tamanho dos poros gerados pelos feixes de agarose 7 na matriz de gel. Em geral, quanto maior a concentração de agarose, quanto menor o tamanho dos poros. Géis de agarose tradicionais são mais eficazes na separação de fragmentos de ADN entre 100 bp e 25 kb. Para separar fragmentos de ADN maiores do que 25 kb, uma será necessário usar pulso electroforese em gel de campo 6, que envolve a aplicação de corrente alternada a partir de duas direcções diferentes. Deste modo maiores fragmentos de DNA são separados por tamanho a velocidade a que eles reorientar-se com as mudanças na direcção da corrente. Os fragmentos de DNA mais pequenos do que 100 pb são mais eficazmente separados usando electroforese em gel de poliacrilamida. Ao contráriogéis de agarose, a matriz de gel de poliacrilamida é formada através de uma reacção química de radical livre accionado. Estes géis são mais finas de maior concentração, são executados na vertical e tem uma melhor resolução. No DNA moderna sequenciação electroforese capilar é usado, em que tubos capilares são preenchidos com uma matriz de gel. A utilização de tubos capilares permite a aplicação de tensões elevadas, permitindo assim a separação de fragmentos de DNA (e à determinação da sequência de ADN) rapidamente. Agarose pode ser modificada para criar baixo ponto de fusão de agarose através hydroxyethylation. Baixo ponto de fusão de agarose é geralmente usado quando o isolamento de fragmentos de DNA separados é desejada. Hydroxyethylation reduz a densidade de empacotamento dos feixes de agarose, reduzindo efectivamente o seu tamanho de poro 8. Isto significa que um fragmento de ADN do mesmo tamanho levará mais tempo para se mover através de um baixo ponto de fusão gel de agarose em oposição a um gel de agarose padrão. Porque os feixes associar com um outroatravés de interacções não covalentes 9, é possível re-derreter gel de agarose um depois de ter definido. EtBr é o reagente mais comum utilizado para corar o DNA em géis de agarose a 10. Quando exposta à luz UV, os electrões no anel aromático da molécula de etídio são activadas, o que leva à libertação de energia (luz) como o retorno electrões para estado fundamental. EtBr funciona por intercalando-se na molécula de ADN de uma forma dependente da concentração. Isto permite a uma estimativa da quantidade de DNA em qualquer banda de DNA particular com base na sua intensidade. Devido à sua carga positiva, o uso de EtBr reduz a taxa de migração de DNA em 15%. EtBr é um agente mutagênico e carcinogênico suspeito, portanto é preciso cuidado ao manusear géis de agarose que o contenham. Além disso, é considerado um EtBr resíduos perigosos e devem ser eliminados de forma adequada. Manchas alternativos para DNA em gel de agarose incluem SYBR Gold, SYBR verde, Cristal Violeta Metil e Azul. Destes,Metil Blue e Cristal Violeta não requerem a exposição do gel à luz UV para a visualização das bandas de DNA, reduzindo assim a probabilidade de mutação se a recuperação do fragmento de ADN a partir do gel é desejada. No entanto, as suas sensibilidades são mais baixos do que a de EtBr. SYBR ouro e SYBR verdes são ambos altamente sensíveis, uv corantes dependentes, com menor toxicidade do que EtBr, mas são consideravelmente mais caros. Além disso, todos os corantes alternativos ou não pode ser ou não funcionam bem quando adicionado directamente ao gel, portanto, o gel terá de ser coradas pós após a electroforese. Devido à facilidade de custo, de uso, e sensibilidade, EtBr continua a ser o corante de escolha para muitos investigadores. No entanto, em determinadas situações, tais como quando a eliminação de resíduos perigosos é difícil ou quando jovens são realizar um experimento, um corante menos tóxica pode ser preferido. Corantes de carregamento utilizadas no eletroforese em gel de servir a três propósitos principais. Primeiro adicionam densidade para a amostra, Permitindo que a afundar-se no gel. Em segundo lugar, os corantes proporcionar cor e simplificar o processo de carregamento. Finalmente, os corantes mover na taxa padrão através do gel, o que permite para a estimativa da distância que os fragmentos de DNA ter migrado. As dimensões exactas dos fragmentos de DNA separados pode ser determinada através da representação gráfica do logaritmo do peso molecular das bandas diferentes de um padrão de DNA contra a distância percorrida por cada banda. O padrão de DNA contém uma mistura de fragmentos de ADN de tamanhos pré-determinados que podem ser comparados contra as amostras de DNA desconhecidos. É importante notar que as diferentes formas de ADN mover-se através do gel com taxas diferentes. DNA de plasmídeo superenrolado, devido à sua conformação compacta, se move através da rápida em gel, seguida por um fragmento de DNA linear do mesmo tamanho, com a forma circular aberta viajando o mais lento. Em conclusão, uma vez que a adopção de géis de agarose na década de 1970 para a separação de DNA, que temprovado ser uma das técnicas mais úteis e versáteis na investigação ciências biológicas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Eu Agarose </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> O brometo de etídio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerígeno-precisa ser eliminados como resíduos perigosos </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Pescador </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tronco e ramose cianol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigador / FX sistema de documentação de gel </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coruja Easycast B1 mini-sistema de eletroforese em gel </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS fonte de alimentação 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

De agarose de electroforese em gel é a forma mais eficaz de separar fragmentos de ADN de tamanhos variados que variam de 100 pb a 25 kb 1. De agarose é isolado a partir da alga géneros Gelidium e Gracilaria, e consiste de agarobiose repetido (L-e D-galactose) subunidades 2. Durante a gelificação, os polímeros de agarose associar não covalentemente e formam uma rede de feixes cujos poros tamanhos determinar um gel moleculares propriedades de peneiração. A utilização de electroforese em gel de agarose revolucionou a separação de DNA. Antes da adopção de géis de agarose, o DNA foi primeiramente separados utilizando sacarose centrifugação em gradiente de densidade, que apresentou apenas uma aproximação de tamanho. Para separar o DNA usando electroforese em gel de agarose, o DNA é carregado no pré-moldados poços no gel e uma corrente aplicada. A espinha dorsal do fosfato do ADN (e RNA) molécula é carregada negativamente, por conseguinte, quando colocado num campo eléctrico, fragmentos de ADN irá migrar para a positively carregada ânodo. Como o DNA tem uma relação de massa / carga uniforme, moléculas de DNA são separados por tamanho dentro de um gel de agarose num padrão tal que a distância percorrida é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular 3. O modelo principal para o movimento de DNA através de um gel de agarose é &quot;enviesada reptation&quot;, em que o bordo de ataque se move para a frente e puxa o resto da molécula ao longo de 4. A taxa de migração de uma molécula de DNA através de um gel é determinada pela sequência: tamanho 1) da molécula de ADN, 2) concentração de agarose, 3) conformação de DNA 5, 4) presença de tensão aplicada, 5) de brometo de etídio, 6) tipo de agarose e 7) tampão de electroforese. Após a separação, as moléculas de ADN podem ser visualizados sob luz UV, após coloração com um corante apropriado. Seguindo este protocolo, os alunos deverão ser capazes de: <ol><li> Compreender o mecanismo pelo qual os fragmentos de DNA são separados dentro de uma matriz de gel </li><li> Entenda como conformação daMolécula de ADN irá determinar a sua mobilidade por meio de uma matriz de gel </li><li> Identificar uma solução de agarose de concentração adequada para suas necessidades </li><li> Preparar um gel de agarose para eletroforese de amostras de DNA </li><li> Configure o aparelho de eletroforese em gel e fonte de alimentação </li><li> Seleccionar uma tensão apropriada para a separação de fragmentos de ADN </li><li> Compreender o mecanismo pelo qual o brometo de etídio permite a visualização das bandas de DNA </li><li> Determinar os tamanhos dos fragmentos de DNA separados </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

757.4K visualizações.  University of California Los Angeles. Um protocolo de base para a separação de fragmentos de DNA usando electroforese em gel de agarose é descrito.

Vídeo: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Biologia

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Triagem para Agregação de amilóide por Semi-desnaturação Eletroforese Gel Detergente-Agarose

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

Electroeluting fragmentos de DNA

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...