Name: agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments
Uploaded: 2012-04-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

1. הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את המסה המתאימה של agarose לתוך הבקבוק Erlenmeyer. ג &#39;ל agarose מוכנים באמצעות aw / פתרון V אחוז. ריכוז agarose ב ג&#39;ל יהיה תלוי בגדלים של קטעי דנ&quot;א להיפרד, עם רוב הג&#39;לים שנעו בין 0.5% -2%. נפח המאגר לא צריך להיות גדול מ 1/3 של קיבולת של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פועל חיץ כדי agarose בקבוק המכיל. מערבולת לערבב. ג&#39;ל הנפוץ ביותר הם פועל מאגרים טה (40 מ&quot;מ טריס, אצטט, 1 mM EDTA) ו TBE (45 מ&quot;מ טריס-borate, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תערובת agarose / חיץ. הדבר נעשה בדרך כלל על ידי חימום במיקרוגל, אבל יכול להיעשות גם על אש בונזן. ב 30 מרווחי ים, להסיר את הבקבוק ו מערבולת התוכן לערבב היטב. חזור על הפעולה עד agarose נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ethidium ברומיד (EtBr) לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. לחלופין, ג&#39;ל עשוי גם להיות מוכתם לאחר אלקטרוphoresis בניהול מאגר המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​EtBr במשך 15-30 דקות, ואחריו destaining בניהול חיץ לאורך שווה של זמן. </li></ol> הערה: EtBr הוא קרצינוגן חשד חייב להיות מסולק כראוי לכל התקנות של המוסד. כפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול ג&#39;לים המכילים EtBr. צבעים חלופיים צביעה של ה-DNA זמינים, אך EtBr נשאר אחד הפופולריים ביותר וזאת עקב רגישותה ואת העלות. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose להתקרר גם על benchtop או הדגירה של אמבט מים 65 מעלות צלזיוס. אי ביצוע הוראה זו יהיה עיוות מגש ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגש הג&#39;ל לתוך מנגנון הליהוק. לחלופין, ניתן גם להדביק את הקצוות הפתוחים של מגש ג&#39;ל ליצור עובש. מניחים מסרק מתאימה לתבנית ג&#39;ל ליצור את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את agarose מותכת לתוך תבנית ג&#39;ל. אפשר agarose להגדיר בטמפרטורת החדר. הסר את המסרק ואת המקום ג&#39;ל בתיבה ג&#39;ל. לחילופין, ה-Gאל ניתן גם עטוף בניילון ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש (איור 1). </li></ol> 2. הקמת מנגנון ג&#39;ל והפרדה של שברי ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טעינת צבע על דגימות דנ&quot;א להיפרד (איור 2). ג&#39;ל טעינת צבע מורכב בדרך כלל בריכוז 6X (0.25% bromphenol כחול, cyanol קסילן 0.25%, 30% גליצרול). טוען הצבע עוזר כדי לעקוב אחר כמה רחוק דגימת DNA שלך נסעה, וגם מאפשר דגימה לשקוע ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית כבל חשמל למתח הרצוי (1-5V/cm בין האלקטרודות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ פועל מספיק כדי לכסות את פני השטח של ג&#39;ל. חשוב להשתמש המאגר פועל זהה לזה המשמש להכנת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את תיבת הפניות של ג&#39;ל על ספק הכוח. הפעל את אספקת החשמל ולוודא כי הן תיבת ג&#39;ל ואת אספקת החשמל פועלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה. לאטבזהירות לטעון את דגימת DNA (ים) לתוך הג&#39;ל (איור 3). סמן המתאים לגודל ה-DNA תמיד צריך להיות טעון יחד עם דגימות מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את מכסה התיבה ג&#39;ל. הקתודה (מוביל שחורים) צריך להיות קרוב יותר בארות מאשר מוביל (אדומים) האנודה. בדוק את האלקטרודות מחוברים לאותה החריצים הנכונים באספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את המחשב. הפעל את הג&#39;ל עד צבע העביר את המרחק המתאים. </li></ol> 3. התבוננות שברי ה-DNA מופרדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה השלימה, לכבות את החשמל והסר את המכסה של תיבת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל מתיבת ג&#39;ל. מסננים את עודפי חיץ מפני השטח של ג&#39;ל. מניחים את המגש ג&#39;ל על מגבות נייר כדי לספוג את כל המאגר פועל נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל ממגש ג&#39;ל ולחשוף את הג&#39;ל לאור UV. הדבר נעשה בדרך כלל באמצעות תיעוד ג&#39;ל המערכת (איור 4). להקות ה-DNA צריך להראותבתור להקות ניאון כתומות. לצלם את הג&#39;ל (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו שצריך להיפטר ג&#39;ל ו חיץ פועל לפי תקנות המוסד. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 5 מייצג את התוצאה בדרך כלל אחרי אלקטרופורזה בג&#39;ל agarose של מוצרי ה-PCR. לאחר ההפרדה, את שברי ה-DNA וכתוצאה מכך נראים כמו פסים ברורים. תקן ה-DNA או סולם יש להפריד במידה המאפשרת קביעת שימושית של גדלים של להקות לדוגמה. בדוגמה המוצגת, שברי ה-DNA של 765 נ&quot;ב, 880 נ&quot;ב ו 1022 BP מופרדים על 1.5% agarose ג&#39;ל יחד עם סולם 2-log-DNA. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> באיור 1. הקרושה agarose ג&#39;ל לאחר הסרת מסרק. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> איור 2. תלמיד הוספת צבע טוען את דגימות ה-DNA שלה. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> איור 3. התלמיד טוען דגימת DNA לתוך באר ג&#39;ל. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> איור 4. דוגמה של מערכת תיעוד ג&#39;ל. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> איור 5. התמונה אלקטרופורזה של ג&#39;ל הודעה. EtBr נוספה ג&#39;ל אלקטרופורזה לפני לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, ואחריו ההפרדה V 100 במשך שעה 1. ג&#39;ל נחשף לאור UV ו תמונה לקחה עם מערכת תיעוד ג&#39;ל.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל הוכיח את עצמו באופן יעיל ואפקטיבי של הפרדת חומצות גרעין. כוח ג&#39;ל גבוהה של agarose מאפשרת טיפול של ג&#39;ל שיעור נמוך להפריד את שברי דנ&quot;א גדולים. סנון מולקולרית נקבעת על ידי גודל של הנקבוביות שנוצר על ידי צרורות של agarose 7 במטריצה ​​ג&#39;ל. באופן כללי, ככל שעולה ריכוז agarose, קטן יותר גודל הנקבוביות. מסורתית ג&#39;ל agarose יעילים ביותר ההפרדה של שברי ה-DNA בין 100 נ&quot;ב ו -25 KB. להפריד בין שברי דנ&quot;א גדולים יותר מ -25 קילו, 1 תצטרך להשתמש בג&#39;ל הדופק בתחום אלקטרופורזה 6, הכוללת את היישום של זרם חילופין משני כיוונים שונים. בדרך זו יותר שברי דנ&quot;א בגודל מופרדות המהירות שבה הם לכוון את עצמם עם שינויים בכיוון הנוכחי. קטעי דנ&quot;א קטנות יותר מ -100 נ&quot;ב מופרדים בצורה יעילה יותר באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שונהagarose ג&#39;ל, ג&#39;ל מטריקס polyacrylamide נוצר באמצעות תגובה כימית רדיקלים חופשיים מונע. ג&#39;ל אלו הם דקים יותר של ריכוז גבוה יותר, מופעלים אנכית יש רזולוציה טובה יותר. ב-DNA המודרנית רצף אלקטרופורזה נימי משמש, לפיה צינורות נימי מלאים מטריקס ג&#39;ל. השימוש צינורות נימי מאפשר יישום של מתח גבוה, ובכך שהיא מאפשרת את ההפרדה בין שברי דנ&quot;א (וקביעת רצף ה-DNA) במהירות. Agarose יכול להיות שונה כדי ליצור התכה נמוכה agarose דרך hydroxyethylation. התכה נמוכה agarose משמש בדרך כלל כאשר הבידוד של שברי הדנ&quot;א המופרדים הרצוי. Hydroxyethylation מפחיתה את צפיפות האריזה של חבילות agarose, ובכך מפחיתה ביעילות גודל הנקבוביות שלהם 8. משמעות הדבר היא כי קטע DNA באותו גודל ייקח זמן רב יותר כדי לעבור התכה נמוכה agarose ג&#39;ל בניגוד ג&#39;ל agarose סטנדרטי. כי החבילות לקשר זה עם זהדרך לא קוולנטיים אינטראקציות 9, ניתן להמיס מחדש ג&#39;ל agarose לאחר הקימה. EtBr הוא מגיב הנפוץ ביותר להכתים-DNA agarose ג&#39;ל 10. בעת חשיפה לאור UV, האלקטרונים טבעת ארומטית של המולקולה ethidium מופעלים, מה שגורם לשחרור של האנרגיה (אור) כחזרה אלקטרונים למצב בשטח. EtBr עובד על ידי intercalating עצמו מולקולת ה-DNA באופן תלוי ריכוז. זה מאפשר הערכה של כמות ה-DNA בלהקה כל ה-DNA מסוים על בסיס עוצמתו. בגלל מטען חיובי שלו, את השימוש EtBr מפחית את שיעור ההגירה DNA ב -15%. EtBr הוא mutagen החשוד כמסרטן, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול ג&#39;ל agarose המכילים אותו. בנוסף, EtBr נחשב פסולת מסוכנת וצריך להיות מסולק כראוי. כתמים חלופיים-DNA ג&#39;ל agarose כוללים SYBR זהב, SYBR ירוק, קריסטל ויולט מתיל כחול. מבין אלה,מתיל כחול קריסטל ויולט אינם דורשים חשיפת הג&#39;ל לאור UV להדמיה של להקות ה-DNA, ובכך להפחית את הסיכוי של מוטציה אם ההחלמה של שבר דנ&quot;א בג&#39;ל הוא הרצוי. עם זאת, הרגישות שלהם נמוכה מזו של EtBr. SYBR זהב SYBR ירוק, שניהם רגישים מאוד, צבעים תלויים סגול עם רעילות נמוכה EtBr, אבל הם הרבה יותר יקר. יתר על כן, כל צבעי חלופיים או לא יכול להיות או לא עובדים טוב כאשר הוסיף ישירות ג&#39;ל, ג&#39;ל ולכן יהיה חייב להיות מוכתם הודעה לאחר אלקטרופורזה. בגלל הקלות עלות, תועלת, ורגישות, EtBr עדיין הצבע המועדף על חוקרים רבים. עם זאת, במצבים מסוימים, כגון כאשר סילוק פסולת מסוכנת או קשה כאשר תלמידים צעירים מבצעים ניסוי, צבע פחות רעיל עשוי להיות מועדף. צבעים טוען המשמשים ג&#39;ל אלקטרופורזה לשרת שלוש מטרות עיקריות. ראשית הם מוסיפים צפיפות מדגם, שמאפשר לו לשקוע ג&#39;ל. שנית, צובעת את לספק צבע ולפשט את תהליך הטעינה. לבסוף, צבעים נעות במחירים סטנדרטיים באמצעות ג&#39;ל, המאפשר הערכה של מרחק כי שברי דנ&quot;א היגרו. בגדלים המדויקים של קטעי דנ&quot;א מופרדות ניתן לקבוע על ידי התוויית יומן של משקל מולקולרי של להקות שונות של תקן ה-DNA על המרחק של הלהקה כל אחד. תקן ה-DNA מכיל תערובת של קטעי דנ&quot;א של שנקבעו מראש בגדלים שניתן בהשוואה מול דגימות ה-DNA ידועים. חשוב לציין כי צורות שונות של ה-DNA לעבור ג&#39;ל בקצב שונה. ה-DNA פלסמיד Supercoiled, בגלל קונפורמציה קומפקטית שלה, עובר דרך ג&#39;ל המהירה ביותר, ואחריו קטע DNA ליניארי באותו גודל, עם צורה עגולה פתוח נסיעה האיטי ביותר. לסיכום, מאז אימוץ agarose ג&#39;ל בשנות ה -1970 להפריד את ה-DNA, יש לוהוכחה אחת הטכניקות הכי שימושי צדדי במחקר מדעי ביולוגי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אני agarose </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> בור חומצה </td><td> סיגמא </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td> סיגמא </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד </td><td> סיגמא </td><td> E7637 </td><td> מסרטנים, צריך להיות מסולק כמו פסולת מסוכנת </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> דיג </td><td> BP2401-212 </td><td> מאכל </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylenדואר cyanol FF </td><td> סיגמא </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> סיגמא </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> החוקר / FX ג&#39;ל מערכת תיעוד </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ינשוף Easycast B1 מיני ג&#39;ל אלקטרופורזה מערכת </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 ספק כוח </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל הוא הדרך היעילה ביותר להפרדת קטעי ה-DNA בגדלים שונים הנעים בין BP 100-25 KB 1. Agarose מבודד סוגים אצות Gelidium ו Gracilaria, והוא מורכב agarobiose חזר (L-ו-D-גלקטוז) יחידות משנה 2. במהלך gelation, פולימרים agarose לקשר לא קוולנטית וליצור רשת של חבילות אשר גודל הנקבוביות לקבוע מאפיינים מולקולריים של ג&#39;ל סנון. השימוש בג&#39;ל אלקטרופורזה agarose מהפכה ההפרדה של ה-DNA. לפני אימוץ agarose ג&#39;לים, ה-DNA הופרדו בעיקר באמצעות צפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה, שרק סיפק הערכה של גודל. להפריד בין ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל, ה-DNA הוא נטען לתוך מראש יצוק בארות ג&#39;ל ו יישומי הנוכחי. עמוד השדרה של ה-DNA פוספט (ו-RNA) הוא מולקולה טעונים שלילית, ולכן כאשר הניח שדה חשמלי, שברי דנ&quot;א יהיה להגר עמ &#39;טעונה ositively האנודה. כי ה-DNA יש יחס אחיד המונית / תשלום, מולקולות ה-DNA מופרדים לפי גודל בתוך ג&#39;ל agarose בדפוס כזה המרחק הוא ביחס הפוך יומן של משקל מולקולרי שלה 3. הדגם המוביל של תנועת ה-DNA באמצעות ג&#39;ל agarose הוא &quot;מוטה reptation&quot;, לפיו החדשנית נע קדימה ומושך את שאר המולקולה יחד 4. שיעור ההגירה של מולקולת הדנ&quot;א דרך ג&#39;ל נקבעת על ידי הבאות: גודל 1) של מולקולת הדנ&quot;א, 2) ריכוז agarose; 3) קונפורמציה DNA 5, 4) יישומית, 5) מתח נוכחות ethidium ברומיד, 6) סוג מאגר agarose ו 7) אלקטרופורזה. לאחר ההפרדה, את מולקולות ה-DNA יכול להיות דמיינו תחת אור UV לאחר מכתים עם הצבע המתאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, התלמידים צריכים להיות מסוגלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את המנגנון שבאמצעותו שברי ה-DNA מופרדים בתוך מטריצת הג&#39;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין כיצד קונפורמציה שלמולקולת ה-DNA תקבע הניידות שלה באמצעות מטריצת הג&#39;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הפתרון agarose הריכוז המתאים לצרכיהם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose על אלקטרופורזה של דגימות דנ&quot;א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ג&#39;ל אלקטרופורזה מנגנון אספקת החשמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר המתח המתאים להפריד את שברי ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את המנגנון שבאמצעותו ברומיד ethidium מאפשר הדמיה של להקות ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הגדלים של שברי הדנ&quot;א המופרדים </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ&quot;א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל מתואר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

763.1K Views.  University of California Los Angeles. פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל מתואר.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and others. However, the traditional SGE protocol is quite tedious, and the experiment takes a long time. Moreover, the chemical consumption in SGE experiments is very high. This work proposes a simple method for the separation of DNA fragments based on an SGE chip. The chip is made by an engraving machine. Two plastic sheets are used for the excitation and emission wavelengths of the optical signal. The fluorescence signal of the DNA bands is collected by smartphone. To validate this method, 50, 100, and 1,000 bp DNA ladders were separated. The results demonstrate that a DNA ladder smaller than 5,000 bp can be resolved within 12 min and with high resolution when using this method, indicating that it is an ideal substitute for the traditional SGE method.

Traditional slab gel electrophoresis (SGE) experiments require a complicated apparatus and high chemical consumption. This work presents a protocol that describes a low-cost method to separate DNA fragments within a short timeframe.

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Biochemistry

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioengineering

DNA Gel Electrophoresis

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of agarose, and within the gel, charge particles will migrate and separate based on size. The negatively charged phosphates of the DNA backbone cause DNA fragments to move toward the anode - a positively charged electrode.
The video explains the mechanism by which DNA fragments are resolved on an agarose gel, and it provides a step-by-step generalized procedure for how to prepare agarose gels, load DNA samples, run a DNA gel, visualize DNA fragments, and properly dispose of the gel and running buffer after the experiment is concluded.

DNA Gel Electrophoresis: Concept, Procedure, and Applications

אלקטרופורזה של ג'ל דנ"א

DNA gel electrophoresis is a technique used for the detection and separation of DNA molecules. An electric field is applied to a gel matrix comprised of ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

הפרדת חלבון עם SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.
This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

Gel Purification: Recovery of DNA Fragments after Electrophoretic Separation

טיהור ג'ל

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, ...

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify DNA fragments using a gel extraction protocol.
Gel extraction follows five major steps: running gel electrophoresis to separate fragments, isolating the individual bands, extracting DNA from those bands, and removing the dye and salts from the extracted mixture to obtain pure DNA.
In cloning experiments, both the insert and vector DNA fragments are obtained after digestion with restriction endonucleases. These DNA fragments of varying sizes are mixed with contaminants, such as enzymes, salts, etc., that can inhibit the ligation reaction that follows. Gel extraction is therefore used to obtain pure DNA fragments before ligation.
To set up a gel for extraction, a lower percent (0.7-0.8%) agarose solution is used to ensure efficient migration of the DNA bands. In addition, a wide-combed gel cast is used to obtain thick DNA bands that are easy to isolate. Then, gel electrophoresis is performed at a lower voltage to prevent heating of the gel and damage to the DNA.
Once gel electrophoresis is complete, the ethidium bromide-stained DNA is identified by exposing the gel to long-wavelength UV for a short time. Short exposure to UV radiation prevents damage to DNA. This is followed by cutting out the desired band using a clean razor blade.
The isolated gel slice containing the DNA fragment of interest is then processed through one of the commercially available gel extraction kits. All of these kits follow the same basic principle. First, the agarose gel is dissolved by a buffer solution containing salts, such as sodium iodide. Next, DNA is bound to a column containing an anionic resin and washed a few times with a dilute alcoholic solution to remove impurities. The column is then dried by spinning in a centrifuge. The pure DNA can now be eluted with buffer or deionized water.

Agarose Gel Electrophoresis for Separation of DNA Fragments

DNA אגרוז ג'ל אלקטרופורזה

Agarose gel electrophoresis is a laboratory technique commonly used to separate DNA fragments by size. However, it can also be used to isolate and purify ...

JoVE Core

Molecular Biology

Unit 2

Studying DNA and RNA

KEY TERMS AND CONCEPTS

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

To begin this procedure, add 250 microliters of a previously prepared protein sample solution to each slot of a 13-centimeter IPG strip holder. Place an 18-centimeter IPG strip, gel-side down, onto each protein sample solution, taking care to avoid bubbles. Then, add 3 to 4 milliliters of mineral oil to cover each IPG strip.
Next, assemble each IPG strip holder into an isoelectric focusing system, with the pointed end on the back plate, and the square end on the front plate. After rehydrating the IPG strips for 18 hours at room temperature, set the IEF parameters on the isoelectric focusing system with a total runtime of 7.5 hours and 36,875 volt hours.
After IEF, take out each IPG strip from the isoelectric focusing system, and remove the excess mineral oil with an insoluble paper towel. Then, wrap each strip in a sheet of plastic wrap, and store at -80 degrees Celsius.
To cast a 12% PAGE gel, add double-distilled water, 1.5 molar Tris-hydrochloric buffer, 40% acrylamide/bisacrylamide stock solution, 10% ammonium persulfate, and TEMED to a beaker. Mix the gel solution gently, taking care to avoid bubbles.
Gently pour the gel solution into a multi-casting chamber, up to the expected gel height of 19 centimeters. Immediately, add about 3 milliliters of double-distilled water to the multi-casting chamber to cover each resolving gel, and allow each gel to polymerize for about one hour.
This step is very important to prepare a high-quality SDS-PAGE gel. An equal volume water must be immediately added on the top of each gel.
Prepare two liters of electrophoresis buffer, then, add the buffer to an electrophoresis separation unit buffer tank.
After removing the focused IPG strips from the freezer, place them in a plastic vessel containing 1 milliliter of reducing equilibrium buffer and a trace of bromophenol blue, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking. After removing the reducing equilibrium buffer, add 4 milliliters of alkylation equilibrium buffer, and a trace of bromophenol blue to the IPG strips, and equilibrate them for 10 minutes with gentle rocking.
During gel equilibrium, disassemble the multi-casting chamber, and remove the prepared resolving gel cassette. Rinse the gel cassette three times with double-distilled water, then, remove excess water from the gel cassette with an insoluble paper towel, and place it in a gel stander.
Following this, rinse the equilibrated IPG strips with electrophoresis buffer, and remove excess liquid on each IPG strip surface with an insoluble paper towel. Place an IPG strip onto the resolving SDS-PAGE gel, allowing the IPG strip&#39;s plastic side to contact the longer glass plate, with the pointed end to the left.
Now, quickly add 3 to 4 milliliters of hot 1% agarose and SDS electrophoresis buffer, to seal the IPG strip on the top of each SDS-PAGE gel, and place the top side of the IPG strip down on the top of the shorter glass plate, taking care to avoid bubbles.
These steps are very important to seal the IPG strip to an SDS-PAGE gel. The hot agarose solutions must be immediately added, and the IPG strip must be immediately placed into the top of the SDS gel.
After polymerization, insert the assembled gel cassette vertically between the plastic gaskets and a vertical electrophoresis system. Place the top of the gel with the IPG strip next to the cathode. Next, adjust the level of electrophoresis buffer to immerse the gel cassette by adding the appropriate volume of buffer to the electrophoresis system.
Connect and set the power supply in constant voltage mode, and run at 200 volts for about 370 minutes while monitoring the dye. After the run is complete, take the gel cassette out of the electrophoresis system and gently remove the gel from the gel cassette, taking care to avoid tearing the gel.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

EoE Sub Articles

Agarose Gel Electrophoresis of DNA Amplicons Post PCR: A Method to Analyze Products of Multiplex PCR and Evaluate PCR Reaction Success

According to the manufacturer&#39;s recommendations, add agarose gel powder in 1x TBE buffer to reach 1.5 (weight/volume) percent, and heat to dissolve.
Prior to casting, tilt the dissolved gel solution briefly under running water. Add 5 microliters of fluorescent nucleic acid dye per 50 microliters of gel solution, and mix.
Assemble and level the casting tray. Add combs as appropriate for the number of samples. Pour the gel solution into the cast, and wait for it to solidify.
After that, submerge the cast containing the gel in 1x TBE buffer in a gel electrophoresis system. Mix 5 microliters of the PCR products together with 2 microliters of loading dye in new PCR strips. Transfer 5 microliters of the mixtures to the wells in the gel. Save at least one well empty. Add 5 microliters of DNA ladder in the empty well for reference.
Plug in the electrodes and run the gel at 110 volts per 15 centimeters for approximately 1 hour. Use a UV-based gel imaging system to verify the presence of multiple bands representing PCR amplicons.

ג'ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video