1. הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את המסה המתאימה של agarose לתוך הבקבוק Erlenmeyer. ג &#39;ל agarose מוכנים באמצעות aw / פתרון V אחוז. ריכוז agarose ב ג&#39;ל יהיה תלוי בגדלים של קטעי דנ&quot;א להיפרד, עם רוב הג&#39;לים שנעו בין 0.5% -2%. נפח המאגר לא צריך להיות גדול מ 1/3 של קיבולת של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פועל חיץ כדי agarose בקבוק המכיל. מערבולת לערבב. ג&#39;ל הנפוץ ביותר הם פועל מאגרים טה (40 מ&quot;מ טריס, אצטט, 1 mM EDTA) ו TBE (45 מ&quot;מ טריס-borate, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תערובת agarose / חיץ. הדבר נעשה בדרך כלל על ידי חימום במיקרוגל, אבל יכול להיעשות גם על אש בונזן. ב 30 מרווחי ים, להסיר את הבקבוק ו מערבולת התוכן לערבב היטב. חזור על הפעולה עד agarose נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ethidium ברומיד (EtBr) לריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. לחלופין, ג&#39;ל עשוי גם להיות מוכתם לאחר אלקטרוphoresis בניהול מאגר המכיל 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​EtBr במשך 15-30 דקות, ואחריו destaining בניהול חיץ לאורך שווה של זמן. </li></ol> הערה: EtBr הוא קרצינוגן חשד חייב להיות מסולק כראוי לכל התקנות של המוסד. כפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול ג&#39;לים המכילים EtBr. צבעים חלופיים צביעה של ה-DNA זמינים, אך EtBr נשאר אחד הפופולריים ביותר וזאת עקב רגישותה ואת העלות. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose להתקרר גם על benchtop או הדגירה של אמבט מים 65 מעלות צלזיוס. אי ביצוע הוראה זו יהיה עיוות מגש ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגש הג&#39;ל לתוך מנגנון הליהוק. לחלופין, ניתן גם להדביק את הקצוות הפתוחים של מגש ג&#39;ל ליצור עובש. מניחים מסרק מתאימה לתבנית ג&#39;ל ליצור את הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את agarose מותכת לתוך תבנית ג&#39;ל. אפשר agarose להגדיר בטמפרטורת החדר. הסר את המסרק ואת המקום ג&#39;ל בתיבה ג&#39;ל. לחילופין, ה-Gאל ניתן גם עטוף בניילון ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש (איור 1). </li></ol> 2. הקמת מנגנון ג&#39;ל והפרדה של שברי ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טעינת צבע על דגימות דנ&quot;א להיפרד (איור 2). ג&#39;ל טעינת צבע מורכב בדרך כלל בריכוז 6X (0.25% bromphenol כחול, cyanol קסילן 0.25%, 30% גליצרול). טוען הצבע עוזר כדי לעקוב אחר כמה רחוק דגימת DNA שלך נסעה, וגם מאפשר דגימה לשקוע ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית כבל חשמל למתח הרצוי (1-5V/cm בין האלקטרודות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ פועל מספיק כדי לכסות את פני השטח של ג&#39;ל. חשוב להשתמש המאגר פועל זהה לזה המשמש להכנת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את תיבת הפניות של ג&#39;ל על ספק הכוח. הפעל את אספקת החשמל ולוודא כי הן תיבת ג&#39;ל ואת אספקת החשמל פועלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה. לאטבזהירות לטעון את דגימת DNA (ים) לתוך הג&#39;ל (איור 3). סמן המתאים לגודל ה-DNA תמיד צריך להיות טעון יחד עם דגימות מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את מכסה התיבה ג&#39;ל. הקתודה (מוביל שחורים) צריך להיות קרוב יותר בארות מאשר מוביל (אדומים) האנודה. בדוק את האלקטרודות מחוברים לאותה החריצים הנכונים באספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את המחשב. הפעל את הג&#39;ל עד צבע העביר את המרחק המתאים. </li></ol> 3. התבוננות שברי ה-DNA מופרדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה השלימה, לכבות את החשמל והסר את המכסה של תיבת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל מתיבת ג&#39;ל. מסננים את עודפי חיץ מפני השטח של ג&#39;ל. מניחים את המגש ג&#39;ל על מגבות נייר כדי לספוג את כל המאגר פועל נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל ממגש ג&#39;ל ולחשוף את הג&#39;ל לאור UV. הדבר נעשה בדרך כלל באמצעות תיעוד ג&#39;ל המערכת (איור 4). להקות ה-DNA צריך להראותבתור להקות ניאון כתומות. לצלם את הג&#39;ל (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו שצריך להיפטר ג&#39;ל ו חיץ פועל לפי תקנות המוסד. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 5 מייצג את התוצאה בדרך כלל אחרי אלקטרופורזה בג&#39;ל agarose של מוצרי ה-PCR. לאחר ההפרדה, את שברי ה-DNA וכתוצאה מכך נראים כמו פסים ברורים. תקן ה-DNA או סולם יש להפריד במידה המאפשרת קביעת שימושית של גדלים של להקות לדוגמה. בדוגמה המוצגת, שברי ה-DNA של 765 נ&quot;ב, 880 נ&quot;ב ו 1022 BP מופרדים על 1.5% agarose ג&#39;ל יחד עם סולם 2-log-DNA. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> באיור 1. הקרושה agarose ג&#39;ל לאחר הסרת מסרק. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> איור 2. תלמיד הוספת צבע טוען את דגימות ה-DNA שלה. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> איור 3. התלמיד טוען דגימת DNA לתוך באר ג&#39;ל. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> איור 4. דוגמה של מערכת תיעוד ג&#39;ל. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> איור 5. התמונה אלקטרופורזה של ג&#39;ל הודעה. EtBr נוספה ג&#39;ל אלקטרופורזה לפני לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, ואחריו ההפרדה V 100 במשך שעה 1. ג&#39;ל נחשף לאור UV ו תמונה לקחה עם מערכת תיעוד ג&#39;ל.

<ol>
	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל הוכיח את עצמו באופן יעיל ואפקטיבי של הפרדת חומצות גרעין. כוח ג&#39;ל גבוהה של agarose מאפשרת טיפול של ג&#39;ל שיעור נמוך להפריד את שברי דנ&quot;א גדולים. סנון מולקולרית נקבעת על ידי גודל של הנקבוביות שנוצר על ידי צרורות של agarose 7 במטריצה ​​ג&#39;ל. באופן כללי, ככל שעולה ריכוז agarose, קטן יותר גודל הנקבוביות. מסורתית ג&#39;ל agarose יעילים ביותר ההפרדה של שברי ה-DNA בין 100 נ&quot;ב ו -25 KB. להפריד בין שברי דנ&quot;א גדולים יותר מ -25 קילו, 1 תצטרך להשתמש בג&#39;ל הדופק בתחום אלקטרופורזה 6, הכוללת את היישום של זרם חילופין משני כיוונים שונים. בדרך זו יותר שברי דנ&quot;א בגודל מופרדות המהירות שבה הם לכוון את עצמם עם שינויים בכיוון הנוכחי. קטעי דנ&quot;א קטנות יותר מ -100 נ&quot;ב מופרדים בצורה יעילה יותר באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שונהagarose ג&#39;ל, ג&#39;ל מטריקס polyacrylamide נוצר באמצעות תגובה כימית רדיקלים חופשיים מונע. ג&#39;ל אלו הם דקים יותר של ריכוז גבוה יותר, מופעלים אנכית יש רזולוציה טובה יותר. ב-DNA המודרנית רצף אלקטרופורזה נימי משמש, לפיה צינורות נימי מלאים מטריקס ג&#39;ל. השימוש צינורות נימי מאפשר יישום של מתח גבוה, ובכך שהיא מאפשרת את ההפרדה בין שברי דנ&quot;א (וקביעת רצף ה-DNA) במהירות. Agarose יכול להיות שונה כדי ליצור התכה נמוכה agarose דרך hydroxyethylation. התכה נמוכה agarose משמש בדרך כלל כאשר הבידוד של שברי הדנ&quot;א המופרדים הרצוי. Hydroxyethylation מפחיתה את צפיפות האריזה של חבילות agarose, ובכך מפחיתה ביעילות גודל הנקבוביות שלהם 8. משמעות הדבר היא כי קטע DNA באותו גודל ייקח זמן רב יותר כדי לעבור התכה נמוכה agarose ג&#39;ל בניגוד ג&#39;ל agarose סטנדרטי. כי החבילות לקשר זה עם זהדרך לא קוולנטיים אינטראקציות 9, ניתן להמיס מחדש ג&#39;ל agarose לאחר הקימה. EtBr הוא מגיב הנפוץ ביותר להכתים-DNA agarose ג&#39;ל 10. בעת חשיפה לאור UV, האלקטרונים טבעת ארומטית של המולקולה ethidium מופעלים, מה שגורם לשחרור של האנרגיה (אור) כחזרה אלקטרונים למצב בשטח. EtBr עובד על ידי intercalating עצמו מולקולת ה-DNA באופן תלוי ריכוז. זה מאפשר הערכה של כמות ה-DNA בלהקה כל ה-DNA מסוים על בסיס עוצמתו. בגלל מטען חיובי שלו, את השימוש EtBr מפחית את שיעור ההגירה DNA ב -15%. EtBr הוא mutagen החשוד כמסרטן, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול ג&#39;ל agarose המכילים אותו. בנוסף, EtBr נחשב פסולת מסוכנת וצריך להיות מסולק כראוי. כתמים חלופיים-DNA ג&#39;ל agarose כוללים SYBR זהב, SYBR ירוק, קריסטל ויולט מתיל כחול. מבין אלה,מתיל כחול קריסטל ויולט אינם דורשים חשיפת הג&#39;ל לאור UV להדמיה של להקות ה-DNA, ובכך להפחית את הסיכוי של מוטציה אם ההחלמה של שבר דנ&quot;א בג&#39;ל הוא הרצוי. עם זאת, הרגישות שלהם נמוכה מזו של EtBr. SYBR זהב SYBR ירוק, שניהם רגישים מאוד, צבעים תלויים סגול עם רעילות נמוכה EtBr, אבל הם הרבה יותר יקר. יתר על כן, כל צבעי חלופיים או לא יכול להיות או לא עובדים טוב כאשר הוסיף ישירות ג&#39;ל, ג&#39;ל ולכן יהיה חייב להיות מוכתם הודעה לאחר אלקטרופורזה. בגלל הקלות עלות, תועלת, ורגישות, EtBr עדיין הצבע המועדף על חוקרים רבים. עם זאת, במצבים מסוימים, כגון כאשר סילוק פסולת מסוכנת או קשה כאשר תלמידים צעירים מבצעים ניסוי, צבע פחות רעיל עשוי להיות מועדף. צבעים טוען המשמשים ג&#39;ל אלקטרופורזה לשרת שלוש מטרות עיקריות. ראשית הם מוסיפים צפיפות מדגם, שמאפשר לו לשקוע ג&#39;ל. שנית, צובעת את לספק צבע ולפשט את תהליך הטעינה. לבסוף, צבעים נעות במחירים סטנדרטיים באמצעות ג&#39;ל, המאפשר הערכה של מרחק כי שברי דנ&quot;א היגרו. בגדלים המדויקים של קטעי דנ&quot;א מופרדות ניתן לקבוע על ידי התוויית יומן של משקל מולקולרי של להקות שונות של תקן ה-DNA על המרחק של הלהקה כל אחד. תקן ה-DNA מכיל תערובת של קטעי דנ&quot;א של שנקבעו מראש בגדלים שניתן בהשוואה מול דגימות ה-DNA ידועים. חשוב לציין כי צורות שונות של ה-DNA לעבור ג&#39;ל בקצב שונה. ה-DNA פלסמיד Supercoiled, בגלל קונפורמציה קומפקטית שלה, עובר דרך ג&#39;ל המהירה ביותר, ואחריו קטע DNA ליניארי באותו גודל, עם צורה עגולה פתוח נסיעה האיטי ביותר. לסיכום, מאז אימוץ agarose ג&#39;ל בשנות ה -1970 להפריד את ה-DNA, יש לוהוכחה אחת הטכניקות הכי שימושי צדדי במחקר מדעי ביולוגי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אני agarose </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> בור חומצה </td><td> סיגמא </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol כחול </td><td> סיגמא </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד </td><td> סיגמא </td><td> E7637 </td><td> מסרטנים, צריך להיות מסולק כמו פסולת מסוכנת </td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> דיג </td><td> BP2401-212 </td><td> מאכל </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylenדואר cyanol FF </td><td> סיגמא </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> סיגמא </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> החוקר / FX ג&#39;ל מערכת תיעוד </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ינשוף Easycast B1 מיני ג&#39;ל אלקטרופורזה מערכת </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 ספק כוח </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל הוא הדרך היעילה ביותר להפרדת קטעי ה-DNA בגדלים שונים הנעים בין BP 100-25 KB 1. Agarose מבודד סוגים אצות Gelidium ו Gracilaria, והוא מורכב agarobiose חזר (L-ו-D-גלקטוז) יחידות משנה 2. במהלך gelation, פולימרים agarose לקשר לא קוולנטית וליצור רשת של חבילות אשר גודל הנקבוביות לקבוע מאפיינים מולקולריים של ג&#39;ל סנון. השימוש בג&#39;ל אלקטרופורזה agarose מהפכה ההפרדה של ה-DNA. לפני אימוץ agarose ג&#39;לים, ה-DNA הופרדו בעיקר באמצעות צפיפות סוכרוז שיפוע צנטריפוגה, שרק סיפק הערכה של גודל. להפריד בין ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל, ה-DNA הוא נטען לתוך מראש יצוק בארות ג&#39;ל ו יישומי הנוכחי. עמוד השדרה של ה-DNA פוספט (ו-RNA) הוא מולקולה טעונים שלילית, ולכן כאשר הניח שדה חשמלי, שברי דנ&quot;א יהיה להגר עמ &#39;טעונה ositively האנודה. כי ה-DNA יש יחס אחיד המונית / תשלום, מולקולות ה-DNA מופרדים לפי גודל בתוך ג&#39;ל agarose בדפוס כזה המרחק הוא ביחס הפוך יומן של משקל מולקולרי שלה 3. הדגם המוביל של תנועת ה-DNA באמצעות ג&#39;ל agarose הוא &quot;מוטה reptation&quot;, לפיו החדשנית נע קדימה ומושך את שאר המולקולה יחד 4. שיעור ההגירה של מולקולת הדנ&quot;א דרך ג&#39;ל נקבעת על ידי הבאות: גודל 1) של מולקולת הדנ&quot;א, 2) ריכוז agarose; 3) קונפורמציה DNA 5, 4) יישומית, 5) מתח נוכחות ethidium ברומיד, 6) סוג מאגר agarose ו 7) אלקטרופורזה. לאחר ההפרדה, את מולקולות ה-DNA יכול להיות דמיינו תחת אור UV לאחר מכתים עם הצבע המתאים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, התלמידים צריכים להיות מסוגלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את המנגנון שבאמצעותו שברי ה-DNA מופרדים בתוך מטריצת הג&#39;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין כיצד קונפורמציה שלמולקולת ה-DNA תקבע הניידות שלה באמצעות מטריצת הג&#39;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הפתרון agarose הריכוז המתאים לצרכיהם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל agarose על אלקטרופורזה של דגימות דנ&quot;א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ג&#39;ל אלקטרופורזה מנגנון אספקת החשמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר המתח המתאים להפריד את שברי ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבין את המנגנון שבאמצעותו ברומיד ethidium מאפשר הדמיה של להקות ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הגדלים של שברי הדנ&quot;א המופרדים </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments at JoVE.com

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ&quot;א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל מתואר.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

agarose-gel-electrophoresis-for-the-separation-of-dna-fragments

Research

JoVE Journal

Biology

757.7K Views.  University of California Los Angeles. פרוטוקול בסיסי להפריד את שברי דנ"א באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל מתואר.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

Electroeluting קטעי DNA

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...