1。ゲルの調製<ol><li>三角フラスコにアガロースの適切な質量を量る。アガロースゲルは、AW / Vの割合のソリューションを用いて調製される。ゲルのアガロース濃度は0.5％-2％の範囲のほとんどのゲルで分離するDNA断片の大きさに依存します。バッファーの量は、フラスコの容量の1/3を超えるべきではありません。 </li><li>アガロース含有フラスコにバッファを実行して追加します。混合する渦巻。バッファを実行する最も一般的なゲルはTAE（40mMのTris-酢酸、1mMのEDTA）とTBE（45 mMのTris-ホウ酸、1mMのEDTA）である。 </li><li>アガロース/バッファ混合物を溶かす。これは最も一般的に電子レンジで加熱することによって行われますが、ブンゼン火炎を介しても行うことができます。 30秒間隔で、内容をよく混合し、フラスコと渦を削除します。アガロースが完全に溶解するまで繰り返します。 </li><li> 0.5μg/ mlの濃度にエチジウムブロマイド（EtBrを）を追加します。また、ゲルはまた、電気の後に染色することができ時間の長さが等しいためにバッファを実行する際に脱色続いて15から30分間、0.5μg/ mlのEtBrを含むバッファを実行しているで泳動。 </li></ol>注：EtBrをが疑われる発がん性物質であると正しく機関の規制ごとに廃棄しなければなりません。 EtBrを含むゲルを取り扱う際の手袋を常に着用する必要があります。 DNAの染色のための代替染料は使用可能ですがEtBrを、その感度とコストのために最も人気のひとつ​​です。 <ol start="5"><li>アガロースは、ベンチトップまたは65°Cの水浴中でインキュベートすることによりどちらかに冷却することができます。これを怠ると、ゲルトレイをワープします。 </li><li>鋳造装置にゲルトレイを置きます。あるいは、また、金型を作成するためのゲルトレイのオープンエッジをテープがあります。井戸を作成するためにゲル型に適切な櫛を配置します。 </li><li>ゲル型に溶融アガロースを注ぎます。アガロースは室温で設定することができます。櫛を削除し、ゲルボックスにゲルを置きます。また、Gエルは、ラップに包んで4℃で保存することができます°Cを使用する（ 図1）まで。 </li></ol> 2。ゲル装置およびDNA断片の分離の設定<ol><li> （ 図2）分離するDNAサンプルをロードする染料を追加します。ゲルローディング色素は、通常、6X濃度（0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノール、30％グリセロール）で行われています。ローディング色素は、あなたのDNAサンプルが旅してきたどこまで追跡するのに役立ち、また、サンプルがゲルにシンクすることができます。 </li><li>所望の電圧にプログラム停電電源装置（電極間1-5V/cm）。 </li><li>ゲルの表面を覆うために十分なランニングバッファーを追加します。ゲルを製造するために使用されるものと同じランニングバッファーを使用することが重要です。 </li><li>電源にゲルボックスのリード線を接続します。電源をオンにしてゲルボックスと電源の両方が機能していることを確認してください。 </li><li>蓋を外します。徐々にと慎重に（ 図3）ゲルにDNAサンプル（s）をロードします。適切なDNAサイズマーカーは、常に実験試料と一緒にロードする必要があります。 </li><li>ゲルボックスに蓋を交換してください。カソード（黒リード）は、陽極側（赤色リード線）よりも井戸でなければなりません。電極は電源の正しいスロットに接続されていることをダブルチェック。 </li><li>電源をオンにします。染料は、適切な距離に移行するまで、ゲルを実行します。 </li></ol> 3。分離したDNA断片を観察する<ol><li>電気泳動が完了したときは、電源をオフにして、ゲルボックスの蓋を取り外します。 </li><li>ゲルボックスからゲルを外します。ゲルの表面から余分なバッファを切る。余分なランニングバッファーを吸収するためペーパータオルの上でゲルトレイを置きます。 </li><li>ゲルトレイからゲルを外し、UV光にゲルを公開します。これは最も一般的なゲルドキュメンテーションシステム（ 図4）を使用して行われます。 DNAのバンドが表示されるはずですアップオレンジ蛍光バンドとして。ゲルの写真（ 図5）を取ります 。 </li><li>適切にゲルおよび機関の規制ごとにランニングバッファーに廃棄してください。 </li></ol> 4。代表的な結果 図5は、PCR産物のアガロースゲル電気泳動後の典型的な結果を表します。分離後、得られたDNA断片は明確に定義されたバンドとして表示されます。 DNA標準またはラダーは、サンプルのバンドのサイズの便利な決定を可能にする程度に分離する必要があります。図示の例では、765 bpで、880 bpと1022 bpのDNA断片が2ログのDNAラダーと一緒に1.5％アガロースゲル上で分離されています。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> 櫛を除去した後の図1。固化したアガロースゲル。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> 図2学生は、彼女のDNAサンプルにローディング色素を追加します。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> 図3ゲルのウェルにDNAサンプルをロードする学生。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> 図4：ゲルドキュメンテーションシステムの例を示します。 <img alt="図5。" src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> 図5。ゲル電気泳動後の画像。 EtBrを1時間、100 Vで分離に続いて、0.5μg/ mlの最終濃度を電気泳動前にゲルに追加されました。ゲルをUV光およびゲルドキュメンテーションシステムで撮影した画像にさらされていた。

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

アガロースゲル電気泳動は、核酸を分離する効率的かつ効果的な方法であることが証明されています。アガロースの高いゲル強度は、大規模なDNA断片を分離するための割合が低いゲルの処理を行うことができます。分子ふるいは、ゲルマトリックス内のアガロース7のバンドルによって生成された細孔のサイズによって決まります。一般的に、アガロース、より小さい細孔径のより高い濃度である。従来のアガロースゲルは、100 bpと25キロバイトの間でDNA断片の分離に最も効果的です。 25キロバイトより大きいDNA断片を分離するために、1つは、2つの異なる方向からの交流電流のアプリケーションが含まれ、パルスフィールドゲル電気泳動法6を使用する必要があります。このように大きなサイズのDNA断片は、それらが現在の方向の変化に自分自身を再方向付けする速度で区切られています。 100 bp未満のDNA断片がより効果的にポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離されています。とは異なり、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルマトリックスは、フリーラジカル主導の化学反応により形成されています。これらの薄いゲルは、高い濃度である垂直に実行され、良好な分解能を持っています。キャピラリー電気泳動シーケンシング現代のDNAが使用されているで、それによってキャピラリーチューブはゲルマトリックスで充填される。キャピラリーチューブの使用は、それによって迅速にDNA断片の分離（およびDNA配列の決定）を有効にする、高電圧の印加が可能になります。 アガロースは、ヒドロキシエチル化によって低融点アガロースを作成するために変更することができます。低融点アガロースは、一般的に分離したDNA断片の分離が望まれているときに使用されます。ヒドロキシエチル化が効果的に細孔サイズ8を減らし、アガロースバンドルの充填密度を減らすことができます。これは、同じ大きさのDNA断片は、標準的なアガロースゲルとは対照的に低融点アガロースゲルを介して移動に時間がかかることを意味します。バンドルには、お互いに関連付けるためそれが設定された後に非共有結合的相互作用9を介して、それが再溶解アガロースゲル電気泳動することが可能です。 EtBrを、アガロースゲル10でDNAを染色するために使用される最も一般的な試薬です。紫外線にさらされると、エチ分子の芳香環の電子は電子が基底状態に戻るようにエネルギーの放出（光）につながる、活性化される。 EtBrを、濃度依存的にDNA分子に自分自身を挿入することによって動作します。これは、その強度に基づいて、任意の特定のDNAバンドのDNA量の推定が可能になります。ため、その正電荷が、EtBrを使用すると、15％のDNAの移動速度を減少させる。 EtBrを容疑者変異原性と発がん性物質である、従ってそれを含むアガロースゲルを取り扱う際に一つ注意しなければなりません。さらに、EtBrをは有害廃棄物とみなされ、適切に廃棄する必要があります。アガロースゲル中のDNAのための代替染色はSYBRゴールド、SYBRグリーン、クリスタルバイオレット、メチルブルーが含まれています。これらの、メチルブルーとクリスタルバイオレットは、ゲルからDNA断片の回収が必要な場合は、それによって突然変異の確率を減少させる、DNAバンドの可視化のための紫外光へのゲルの露出を必要としません。しかし、その感度はEtBrをより低くなっています。 SYBR金とSYBRグリーンはEtBrをより低い毒性の両方で高感度、UV依存染料であるが、それらはかなり高価です。また、代替染料のすべてのことはできませんいずれか、またはゲルに直接​​添加したときにうまく機能しない、したがって、ゲル電気泳動後のポストで染色しなければならないでしょう。ので、コスト、使いやすさ、感度の、EtBrを、まだ多くの研究者のための選択の染料のままです。しかし、このような有害廃棄物処理が困難な場合や、若い学生である場合など、特定の状況で実験を行っている、毒性の少ない染料が好ましい可能性があります。 ゲル電気泳動に使用されるローディングの染料は、三大目的があります。最初に、彼らは、サンプルに密度を追加する、それがゲルにシンクすることができます。第二に、染料の色を提供し、ロード·プロセスを簡素化します。最後に、色素は、DNA断片が移行し​​た距離の推定を可能にし、ゲルを介して標準的な速度で移動します。 分離したDNA断片の正確なサイズは、各バンドが移動した距離に対するDNA基準の異なるバンドの分子量の対数をプロットすることにより決定することができます。 DNA標準では、未知のDNAサンプルと比較することができますあらかじめ決められたサイズのDNA断片の混合物を含んでいます。それはDNAの異なる形態が異なる速度でゲル内を移動することに注意することが重要です。スーパーコイルプラスミドDNAは、ため、そのコンパクトな立体構造の、最も遅い走行開いた円形のフォームと同じ大きさの直鎖状DNA断片、続いて、最速のゲルを通して移動します。 結論としては、DNAの分離のための1970年代のアガロースゲルを採用しているので、それが持つ生物科学研究の中で最も有用と多彩な技術の一つであることが証明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アガロースI </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマ</td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマ</td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>シグマ</td><td> E7637 </td><td>有害廃棄物として処分される発癌性、必要がある</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャー</td><td> BP2401-212 </td><td>腐食性の</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td>キシレン電子シアノールFF </td><td>シグマ</td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>シグマ</td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td>治験責任医師/ FXゲルドキュメンテーションシステム</td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td>フクロウEasycast B1ミニゲル電気泳動システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301電源</td><td> GEヘルスケア</td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

アガロースゲル電気泳動で100 bpから25キロバイト1までさまざまなサイズのDNA断片を分離する最も効果的な方法です。アガロースは、海藻テングサ属とオゴノリから分離され、繰り返しagarobiose（L-およびD-ガラクトース）のサブユニット2から構成されています。ゲル化時には、アガロースポリマーは、非共有結合的に関連付け、孔径ゲルの分子ふるい特性を決定するバンドルのネットワークを形成しています。アガロースゲル電気泳動の使用は、DNAの分離に革命をもたらしました。アガロースゲルの採択に先立ち、DNAは、主にのみサイズの近似値を提供してショ糖密度勾配遠心法を用いて分離した。アガロースゲル電気泳動を使用して、別のDNAに、DNAは、ゲルと印加される電流にプレキャストウェルにロードされます。 DNA（およびRNA）分子のリン酸バックボーンは負電場に置かれたとき、したがって、充電され、DNA断片は、pに移行しますositivelyアノードを充電されます。 DNAが均一な質量/電荷比を持つため、DNA分子が移動する距離は、その分子量3のログに反比例するようなパターンで、アガロースゲル内のサイズで区切られています。アガロースゲルを介してDNAの動きのための主要なモデルは、リーディングエッジが前方に移動し、4に沿って分子の残りの部分を引っ張ることにより、 &quot;レプにバイアス&quot;です。 2）アガロース濃度、3）DNAのコンフォメーション5、4）臭化エチジウム、6の電圧が適用され、5）が存在する）タイプのDNA分子の1）サイズ：ゲルを介してDNA分子の移動速度は、次の要素によって決まりますアガロースおよび7）電気泳動用バッファーの。分離した後、DNA分子は、適切な染料で染色した後、UV光下で可視化することができる。このプロトコルに従うことによって、学生のことができるようになります。 <ol><li> DNA断片をゲルマトリックス内に分離されているメカニズムを理解する</li><li>のコンフォメーション方法を理解するDNA分子はゲルマトリックスを通じて、モビリティを決定します</li><li>彼らのニーズに合わせて適切な濃度のアガロース溶液を識別する</li><li> DNAサンプルの電気泳動用アガロースゲルを準備します。 </li><li>ゲル電気泳動装置と電源を設定する</li><li> DNA断片の分離に適した電圧を選択します。 </li><li>エチジウムブロマイドはDNAバンドの可視化を可能にするメカニズムを理解する</li><li>分離したDNA断片のサイズを決定</li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

アガロースゲル電気泳動を用いたDNA断片の分離のための基本的なプロトコルが記述されています。

DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

759.3K ビュー.  University of California Los Angeles. アガロースゲル電気泳動を用いたDNA断片の分離のための基本的なプロトコルが記述されています。

ビデオ: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）

生物学

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE）

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

DNAフラグメントをElectroeluting

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...