Biz el yazması üzerine tavsiye, yararlı tartışmalar ve yorumlar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Biz de özellikle biz yeniden deneylerde yetiştiricilik için beyinlerini parçalayıp önce 1.5 saat APF kadar beklemeniz mükemmel bir öneri için Marta Koch ve Bassem Hassan teşekkür etmek istiyorum. Biz de onların konfokal mikroskop kullanımı için NHGRI görüntüleme tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, Ulusal Sağlık Enstitüsü (Z01 NS003106) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Ortam hazırlanışı <ol><li> Filtre-sterilizasyon Schneider&#39;in Drosophila Medya% 10 Fetal Bovine Serum ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş tarafından eksiksiz bir medya hazırlayın. </li><li> Medya her zaman taze hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, önceden dondurulmuş ortam taze bir alikotu her kullanımdan önce çözülür edilebilir. </li><li> Kültür öncesinde, 10 mikrogram / ml insülin ve medyaya 2 mcg / ml ecdysone ekleyin. Uyuşturucu konsantre stok olarak hazırlanır ve küçük hacimde de donduruldu. Çözülmüş alikotları tekrar dondurulmamalıdır değildi. </li><li> Tüm çalışma çözeltileri 25 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir </li></ol> Larva Brains kültürünün 1. Larva Brains Seçimi ve Diseksiyon <ol><li> 12 mm Millicell hücre kültürü yazısına medya 500 ul ekleyin. Disseke beyinler kolay immun kolaylaştırmak için bu ekler yerleştirilir. </li><li> Diseksiyon bir saat camı ile hazırlanmış ortam küçük bir miktar ekleyin. </li><li> U, küçük bir spatula şarkı dolaşıp Üçüncü dönem larva almak ve saat camı koyun. (Biz ex vivo kültür yöntemi ilk veya ikinci Larvalar için eşit derecede geçerli olacağını tahmin, ama biz bunu test edemedim.) </li><li> , Forseps bir çift ile larva posterior ucundan tutarak dikkatle # 5 forseps ikinci bir çift ile ön sonuna kadar açın. </li><li> Hızla ventral sinir kordonu korunarak, beynin incelemek. </li></ol> Dissected Larva Brains 2. Ex vivo kültür <ol><li> Ön ıslak pipet uçları kullanarak, hücre kültürü ekler, medya ile önceden doldurulmuş dikkatle beyin aktarın. </li><li> 25 küvözde medya Transfer beyinleri, ° C kadar zaman istenilen noktaya ulaşılır. Bu yöntem, kültürde 48 saat için verimli çalışır. </li><li> 8 saat ortamı değiştirin. Bunun ötesinde, medya her 5-6 saatte yarısı değiştirin. </li></ol> 3. Farmakolojik ManipülasyonLarva Brains Ex vivo kültürleme Bu yöntem, farmakolojik olarak daha önce laboratuar 1 &#39;de gösterilmiştir genetik etkileşimler teyit etmek için kullanılabilir. <ol><li> 100 uM roscovitine ve hazırlanmış medya 100 uM olomoucine ekleyin. </li><li> Bu medya disseke beyinleri aktarın. </li><li> 25 de kültüre beyinleri ° C&#39;de 24 saat boyunca. </li><li> 8 saat ortamı değiştirin. Bunun ötesinde, medyanın yarısı (uyuşturucu ile) her 5-6 saat değiştirin. </li></ol> Pupa Brains kültürünün 1. Diseksiyon için Pupalar Seçimi <ol><li> Şişe / şişe beyaz pupa işaretleyin. </li><li> Sadece tamamen beyaz pupa seçin. Renklenme herhangi bir sıralama ile pupa dahil edilmemelidir. </li><li> Bu aşama Puparium Formasyonu (APF) sonra 0 saattir. </li><li> Bu pupa 1.5 saat işaretleme sonrası diseksiyon için hazır olacak. Bu adım, bu gelişimsel budama ex vivo meydana sağlamak için çok önemlidir </em&gt; kültürü. </li></ol> 2. Pupa diseksiyonu <ol><li> 12 mm Millicell hücre kültürü yazısına medya 500 ul ekleyin. (Disseke beyinler kolay immun kolaylaştırmak için bu ekler yer alacak). </li><li> İstenilen zaman noktaya ulaşıldığında, bir diseksiyon saat camı için hazırlanmış medya küçük bir miktar ekleyin. </li><li> Küçük, ıslak spatula kullanarak, pupa önce diseksiyon için işaretlenmiş pick up ve saat camı koyun. </li><li> Forseps bir çift ile pupa arka sonuna Holding, dikkatle # 5 forseps ikinci bir çift ile pupa halinde ön ucunu açmak. </li><li> Hızla ventral sinir kordonu sağlam ve bağlı tutmak, beynin incelemek. </li></ol> Dissected pupa Brains 3. Ex vivo Kültürleme <ol><li> Hücre kültürü ekler, medya ile önceden doldurulmuş dikkatle beyin aktarın. </li><li> İstediğiniz zaman p kadar 25 inkübatör ° C ortam Transfer beyinleri,oint ulaşılır. Biz gösterilen deney için kültürde 10 saat için bu yöntemi kadar kullanılan, ancak gerekirse, gözlem ve tedavi daha uzun süre için uzatılabilir. </li><li> 8 saat APF fazla zaman noktaları daha uzun süre, medya her 5-6 saat değiştirin. </li></ol> Bu adımdan, protokol larva ve pupa hem de değişmeden kalır. B. Dissected Brains Tespit <ol><li> İstediğiniz zaman noktaya ulaşıldığında, medya çıkarın ve 1x PBS içinde% 4 formaldehit 500 ul eklemek% 0.5 Triton 15 dakika sonra taze formaldehit ile değiştirerek 30 dakika boyunca X-100 (PBST). </li><li> Sabitleştirici ile medya değiştirirken beyinleri kuruması için değil emin olun. </li><li> % 0.5 TritonX-100 (PBST) ile 1x PBS dört adet 10 dakikalık yıkar ile formaldehit yıkayın. </li></ol> C. Sabit Brains Boyama <ol><li> Formaldehit yıkanıp sonra,% 1 ile Normal 1x PBS bir bloke edici çözelti içinde 1 saat süreyle beyinleri blokeKeçi serum ve% 1 Bovine Serum Albumin. </li><li> Çözümü engelleme kadar yapılan birincil antikor ekleyin. </li><li> 4 gece boyunca inkübe beyinleri ° C </li><li> Ertesi sabah, PBST dört 10 dakikalık yıkama primer antikorlar yıkayın. </li><li> Çözümü engelleme kadar yapılan sekonder antikor ekleyin. </li><li> 4 saat için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> PBST dört 10 dakikalık yıkar ile sekonder antikorlar yıkayın. </li></ol> D. Mikroskopi Sabit ve Vitray Brains Montaj <ol><li> 1 saat Vectashield montaj medya beyinleri dengeye. </li><li> Vectashield yarığına kullanılarak cam slaytlar üzerine kafa monte edin. </li><li> Kapak kayma monte edilmeden önce beyinleri her iki tarafında da cam yongaları yerleştirin. Bir konfokal mikroskop ile tüm odak uçakları taramak için yeterli örnek ince tutarken, ezilmiş olmaktan beyinleri engeller. Brains ilgi özelliklerini inceleyen kolaylaştırmak için montaj üzerine kabaca odaklı idi. Gerektiğinde,beyin görüntüleri dokümantasyon ve ölçüm için optimal bir görünüm sağlamak için Imaris yazılımı ile döndürüldü. </li><li> Net tırnak cilası ile kayar kapağı kapatın. </li><li> Mağaza ışıktan uzak slaytlar. </li></ol> E. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 (A) vahşi tip sineklerin üçüncü evre larva beyinleri bir panel gösterir ve (B) Cdk5 bir baskın-negatif türevi (Cdk5DN) (Connell-Crowley ve ark., 2000) ifade sinekler. MB gama nöronlarda hem ekspres aktin-GFP (yeşil). Daha önce açıklandığı gibi (Trunova ve ark., 2011), bu nedenle bir &quot;açık bölgesi&quot; (A, dirseği) olarak gösteren, ve, aktin-GFP birikmesine başarısız yaban-tip gamma nöronların proksimal akson bir bölgenin olduğu fasciclin 2 protein (kırmızı) sadece yukarı bu bölgenin ventral sınır (beyaz yatay çizgi) aksonlar birikir. Şekil 1 (A) üçüncü panelinde noktalı çizgi hareket öne, MB konumunu gösterir&quot;açık bölge&quot; ve ventral sınırında. Cdk5DN ifade sinekler ise, aktin temiz zon yoktur (B) ve Fasciclin 2 (FasII) immünreaktivite o bölge üzerinden dorsal yayılır. (Yatay MB arasında FasII pozitif aksonları değişken sayıda unutmayın; bu fenotipi ile ilgili değildir). Ölçek bar 20 mikron temsil eder. Ex vivo kültürleme bizim yöntemi kullanarak, roscovitine ve olomoucine, Cdk5 aktivitesinin inhibitörleri farmakolojik bir kombinasyonu ile vahşi tip sinekler muamele. Şekil 2, bir kontrol üçüncü evre larva beyinleri (A) paneli ve (B ilaçla işleme tabi tutulmuş gösterir ) vahşi tip sinekler. 24 saat Cdk5 inhibitörleri ile tedavi beyinleri baskın bir olumsuz Cdk5 yapı ifade sinekler benzer karakteristik aktin açık alan kaybı ve FasII sınırında shift (köşeli parantez) göstermektedir. Beyaz çizgiler vahşi tip FasII sınır konumunu göstermektedir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder. Figuyeniden 3 mCD8-GFP (yeşil) membran hedefli etiketli 0-10 saat APF gelen Drosophila mantar organlarının temsilcisi dizi gösterir. Braketler kaliks, yani MB dendritik projeksiyonları göstermektedir. Önceden metamorfoz üzere, bir kalınlıkta demetler yanı sıra, yoğun dendritik mili (taşıyıcı) kaynaklanan flüoresan sinyalinin bir &#39;pus&#39; in dorso-ventral akan MB aksonlardan görebiliriz. Zamanda parçalanmış panel A gösterir beyinleri göstermiştir. Bölgede dendritlerin budama (akson sinyali etkilenmemiş olsa da) 6-8 saat ile APF, dendritik sinyal pus gitti öyle ki, parantez ile gösterilir unutmayın. Panel B Brains iç ecdysone başak (Truman ve Riddiford, 2002) ve belirtildiği gibi kültürlü ex vivo önce, 0 saat APF de diseke edildi. Bu dendritler hiçbir gelişimsel budama göstermek; yerine dendritik sinyal 10 saat APF de devam etmektedir. Bunu aşmak için, pupa 0 saat APF işaretlenmiş, ancak 1,5 saat APF ve kültürlü olarak disseke edilir. Panel C 0-10 saat APF bu Drosophila mantar organlarının temsilcisi dizi gösterir. Non-kültüre örneklerde olduğu gibi, dendritik sinyali 8 saat YGø ile mümkün değildir. Ölçek bar 20 mikron temsil eder.

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Mutasyonlar ve transgenlerin ifadesi de dahil olmak üzere doku yapısı ve fonksiyonları, kronik genetik manipülasyonlar, tipik olarak ayırmak çok zor olabilir ve ani etkilerini ve geç dolaylı sonuçları karışımından oluşur. Farmakoloji ile genetik yöntemler tamamlayan bir fenotip arkasında zaman tabii sorgulama kolaylaştırabilir. Örneğin, bu Drosophila 10 spermatogenezisin sırasında farklı sitoskeletal bileşenlerin katkılarını kesme için güçlü bir yaklaşım olmu?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Schneider&#39;in Drosophila Medya </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (ısıyla inaktive edilmiş) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdysone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Formaldehit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> % 0.5 </td></tr><tr><td> Fosfat Tamponlu Salin </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Hücre Kültürü Uçlar </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, iyi 4 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Cam Kapak </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

Biz bütün Drosophila beyinleri ex vivo kültürlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu akut farmakolojik ve hücresel süreçlerin canlı görüntüleme izin vererek hücre biyolojisi ve merkezi beyin yapılarının gelişimini araştırmak için kronik genetik manipülasyonlar için bir kontrpuan olarak kullanılabilir. Tekniğinin bir örneği olarak, önce bizim laboratuar 1 ile çalışmak, daha önce tanınmayan Subselüler bölmesi Drosophila merkezi beynin akson aksonal ve somatodendritik bölmeler arasında yattığını göstermiştir. Aksonun ilk segmenti (AIS) 2 olarak adlandırılan bu bölmeye gelişimi, nöron spesifik siklin-bağımlı kinaz, Cdk5 bağlı genetik olarak gösterildi. Biz Cdk5-spesifik farmakolojik inhibitörleri roscovitine ve olomoucine 3 ile yabani tip Drosophila larva beyinleri ex vivo tedavi aktin örgütü akut değişikliklere neden olur, ve burada göstermekGenetik olarak Cdk5 aktivitesi eksikliği görülen mutantlarının değişiklikler taklit hücre yüzey proteini Fasciclin 2, lokalizasyonunu. Ex vivo kültürü tekniği ikinci bir örneği, embriyonik mantar gövdesi (MB) larva yetişkine kadar metamorfoz sırasında gamma nöronların bağlantıların remodeling için sağlanmıştır. Mantar vücudu koku öğrenme ve sinek 4 bellek merkezidir ve bu gama nöronlar yetişkin innervasyon desen 5 kurmak için bir sonraki timepoint yeniden uzatması dalları daha sonra pupa gelişimi sırasında aksonal ve dendritik dalları budamak ve. MB Bu nöronların budama ecdysone reseptör B1 7 de hareket ederek, ecdysone, bir steroid hormon tarafından tetiklenen bir mekanizma ile, nörit dalları 6 lokal dejenerasyonu ile meydana gösterilmiştir ve bu aktivite bağımlı olmuştur ubikuitin-proteazom sistemi 6. Ex vivo kültür Bizim yöntemi b yapabilirsinize daha da gelişimsel yeniden mekanizmasını sorgulamak için kullanılır. Biz ex vivo kültür ortamında, MB gama nöronlar in vivo benzer bir zamanlaması ile gelişimsel budama işlemi değinmeyecek bulundu. Bu hücreler başkalaşım geri dönüşümsüz olarak işlemesi amacıyla doku explanting önce 1.5 saat puparium oluşumundan sonra beklemek, ancak, önemli idi; kültüründe çok az veya hiç metamorfoz yol pupariation başlangıcında hayvanların diseksiyonu. Böylece, uygun bir modifikasyonu ile ex vivo kültürü yaklaşımı ve merkezi beyin biyoloji açıdan kararlı şekilde dinamik incelemek için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem açıklanır<em&gt; In vivo</emBir&gt; gelişme<em&gt; Drosophila</emBir de&gt; mantar vücut<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür sistemi.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

13.0K Görüntüleme.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem açıklanır In vivo gelişme Drosophila mantar vücut Ex vivo Kültür sistemi.

Video: Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Nörobilim

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Konfokal Görüntülerle Fare Retina OCT Fibergram Hizalaması

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Glokom Tanı ve Tedavisi için In Vivo ve Ex Vivo Retinal Görüntülemedeki Gelişmeler 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...