Wir möchten alle Mitglieder der Arbeitsgruppe für die Beratung, die hilfreichen Diskussionen und Kommentare zum Manuskript danken. Wir würden uns auch besonders gerne Marta Koch und Bassem Hassan für den ausgezeichneten Vorschlag, dass wir warten, bis 1,5 Stunden vor dem Sezieren APF Gehirne für die Kultivierung im Umbau Experimente danken. Wir danken auch dem NHGRI bildgebenden Einrichtung für die Nutzung ihrer konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der Basic Neuroscience Program der NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS003106) unterstützt.

A. Herstellung der Medien <ol><li> Planen kompletten Medien durch das Filter-Sterilisation Drosophila Schneider Medien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. </li><li> Die Medien sollten jedes Mal frisch zubereitet werden. Alternativ kann ein frisches Aliquot der vorgefrorene Medien vor jedem Gebrauch aufgetaut werden. </li><li> Vor der Kultivierung, fügen Sie 10 pg / ml Insulin und 2 pg / ml Ecdyson zu den Medien. Die Medikamente wurden als konzentrierte Bestände vorbereitet und in kleinen Portionen tiefgefroren. Aliquote aufgetaut waren nicht wieder eingefroren werden. </li><li> Alle arbeiten Lösungen sollten bei 25 ° C gehalten werden </li></ol> Die Züchtung von Larven Brains 1. Auswahl und Präparation der Larven Brains <ol><li> Fügen Sie 500 ul von Medien in ein 12 mm Millicell Zellkultureinsatzes. Die Gehirne seziert wird in dieser Einsätze platziert werden, um einfach Immunfärbung zu erleichtern. </li><li> Fügen Sie eine kleine Menge von präparierten Medien zu einer Dissektion Uhrglas. </li><li> Usingen einen kleinen Spachtel, abholen wandernden dritten Larvenstadium und legen Sie sie in das Uhrglas. (Wir gehen davon aus, dass die Ex-vivo-Kultur-Methode würde genauso gut auf erste oder zweite Larvenstadium, aber wir haben nicht getestet.) </li><li> Halten Sie das hintere Ende der Larve mit einer Pinzette vorsichtig öffnen, das vordere Ende mit einem zweiten Paar Nr. 5 Zange. </li><li> Schnell sezieren das Gehirn und hält die Bauchmark intakt. </li></ol> 2. Ex vivo Kultivierung der zerlegten Larven Brains <ol><li> Mit Pre-nass Pipettenspitzen, übertragen das Gehirn vorsichtig in die Zellkultur-Einsätzen, mit den Medien bereits ausgefüllt. </li><li> Transfer-Gehirn, in den Medien, zu einem Brutschrank bei 25 ° C, bis die gewünschte Zeit-Punkt erreicht ist. Diese Methode funktioniert effizient für bis zu 48 h in Kultur. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in 8 Stunden. Darüber hinaus ersetzen die Hälfte der Medien alle 5-6 Stunden. </li></ol> 3. Pharmakologische Manipulation vonLarven Brains Diese Methode der Ex-vivo-Kultivierung verwendet werden, um pharmakologisch bestätigen genetischen Interaktionen zuvor in unserem Labor 1 nachgewiesen werden. <ol><li> In 100 uM Roscovitin und 100 uM Olomoucin auf vorbereitete Medien. </li><li> Übertragen Sie sezierten Gehirne zu diesem Medium. </li><li> Kultur Gehirn bei 25 ° C für 24 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in 8 Stunden. Darüber hinaus ersetzen die Hälfte der Medien (mit Drogen) alle 5-6 Stunden. </li></ol> Die Anzucht von Puppenstadium Brains 1. Die Auswahl der Puppen für Dissection <ol><li> Mark White Puppen auf Flaschen / Vials. </li><li> Wählen Sie nur Puppen, die komplett weiß sind. Puppen mit jeder Art von Färbung sollten nicht einbezogen werden. </li><li> Diese Phase ist 0 Stunden Nach Puparium Formation (APF). </li><li> Diese Puppen werden bereit sein für die Dissektion 1,5 Stunden nach der Markierung. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Entwicklungsstörungen Rebschnitt erfolgt in ex vivo </em&gt; Kultur. </li></ol> 2. Dissektion der Puppen <ol><li> Fügen Sie 500 ul von Medien in ein 12 mm Millicell Zellkultureinsatzes. (Die Gehirne seziert wird in dieser Einsätze platziert werden, um einfach Immunfärbung zu erleichtern). </li><li> Sobald die gewünschte Zeit-Punkt erreicht worden ist, eine kleine Menge von zubereiteten Medien zu einer Dissektion Uhrglas. </li><li> Mit einem kleinen, nassen Spachtel, abholen Puppen zuvor für die Dissektion markiert und legen Sie sie in das Uhrglas. </li><li> Halten Sie das hintere Ende der Puppen mit einer Pinzette, öffnen Sie vorsichtig das vordere Ende der Puppe Fall mit einem zweiten Paar Nr. 5 Zange. </li><li> Schnell sezieren das Gehirn und hält die Bauchmark intakt und angeschlossen. </li></ol> 3. Ex vivo Kultivierung von Dissected Puppenstadium Brains <ol><li> Übertragen des Gehirns vorsichtig in die Zellkultur-Inserts, mit Medien vorgefüllt. </li><li> Übertragen Gehirn, in den Medien, in einen Inkubator bei 25 ° C, bis die gewünschte Zeit-pSalben erreicht ist. Wir verwendeten diese Methode bis zu 10 Stunden in Kultur für das gezeigte Experiment, aber es können längere Beobachtung und Behandlung verlängert werden, wenn nötig. </li><li> Für Zeit-Punkte mehr als 8 Stunden APF, Medien ersetzen alle 5-6 Stunden. </li></ol> Von diesem Schritt auf, bleibt das Protokoll unverändert sowohl für Larven und Puppen. B. Befestigung Dissected Brains <ol><li> Sobald die gewünschte Zeit-Punkt erreicht ist, zu entfernen Medien und fügt 500 ul 4% Formaldehyd in 1 × PBS mit 0,5% Triton X-100 (PBST) für 30 Minuten, Ersetzen mit frischem Formaldehyd nach 15 Minuten. </li><li> Achten Sie darauf, nicht zu erlauben, Hirn, um zu trocknen, während Ersatz von Medien mit Fixativ. </li><li> Abwaschen Formaldehyd mit vier 10-minütige Waschungen von 1 × PBS mit 0,5% Triton X-100 (PBST). </li></ol> C. Färbung Feste Brains <ol><li> Nach Formaldehyd gewaschen worden ist ausgeschaltet, blockiert Gehirne für 1 Stunde in einer Blocking-Lösung aus 1x PBS mit 1% NormalZiegenserum und 1% Rinderserumalbumin. </li><li> In primären Antikörper in Blockierungslösung gemacht. </li><li> Inkubieren Gehirne über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Morgen abwaschen primäre Antikörper mit vier 10-minütige Waschungen PBST. </li><li> Fügen Sie Sekundärantikörper in Blocking-Lösung gemacht. </li><li> Lassen Sie bei Raumtemperatur für 4 Stunden. </li><li> Abwaschen Sekundärantikörper mit vier 10 minütige Waschungen PBST. </li></ol> D. Montage fixiert und gefärbt Brains für die Mikroskopie <ol><li> Äquilibrieren Gehirne in Vectashield Eindeckmittel für 1 Stunde. </li><li> Montieren Gehirne auf Glasplättchen mit den Medien Vectashield Montage. </li><li> Legen Glaschips auf beiden Seiten des Gehirns vor der Montage des Deckglases. Dies verhindert, dass die Gehirne nicht gequetscht, unter Beibehaltung Probe dünn genug, um alle Fokalebenen mit einem konfokalen Mikroskop zu scannen. Brains waren grob orientiert sich bei der Montage zu erleichtern Betrachtung der Merkmale von Interesse. Wenn nötig,Gehirn Bilder waren verdreht Imaris Software, um eine optimale Sicht für die Dokumentation und Messung zu liefern. </li><li> Seal Deckgläser mit klarem Nagellack. </li><li> Shop gleitet weg vom Licht. </li></ol> E. repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt ein Panel von dritten Larvenstadium larvalen Gehirnen von (A) Wildtyp-Fliegen und (B) Fliegen, die eine dominant-negative Ableitung des Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000) zum Ausdruck bringen. Beide drücken Aktin-GFP (grün) in MB Gamma Neuronen. Wie zuvor beschrieben (Trunova et al., 2011), gibt es eine Region in den proximalen Axone von Wildtyp-Gamma-Neuronen, die an Aktin-GFP akkumulieren fehl, so zeigt sich als ein &quot;clear zone&quot; (A, Klammer), und fasciclin 2-Protein (rot) sammelt sich in den Axonen nur bis zu dem ventralen dieser Zone (weiße horizontale Linie). Die gepunktete Linie in der dritten Platte der 1 (A) zeigt die Position des MB, Hervorhebung der Tatin &quot;freien Zone&quot; und seine ventrale Grenze. In Fliegen exprimieren Cdk5DN ist das Actin freien Bereich nicht vorhanden (B) und Fasciclin 2 (FasII) Immunreaktivität breitet dorsal durch diese Region. (Beachten Sie, dass variable Anzahl von FasII-positive Axone Projekt horizontal über die MB; diese sind nicht relevant für den Phänotyp). Maßstabsbalken repräsentiert 20 um. Mit unserem Verfahren der Ex-vivo-Kultivierung, behandelten wir Wildtyp-Fliegen mit einer Kombination aus Roscovitin und Olomoucin, pharmakologische Inhibitoren von Cdk5 Aktivität. Abbildung 2 zeigt eine Gruppe von Dritt-Stadiums larvalen Gehirnen der Kontrolle (A) und Arzneimittel-behandelten (B ) Wildtyp-Fliegen. Ähnlich wie bei Fliegen Expression einer dominant negativen Cdk5 Konstrukt, Gehirne mit Cdk5 Inhibitoren für 24 Stunden behandelt wurden, zeigen die charakteristische Verlust von Aktin-freien Bereich und Verschiebung FasII Grenze (eckige Klammern). Weiße Linien zeigen Position des Wildtyp-FasII Grenze. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um. FiguRE 3 zeigt eine repräsentative Reihe von Drosophila Pilzkörper von 0 bis 10 Stunden APF, mit Membran-gezielte mCD8-GFP (grün) gekennzeichnet. Klammern geben den Kelch, das heißt, die dendritischen Projektionen des MB. Vor der Metamorphose, kann man sehen MB Axone Coursing dorsoventral in dicken Bündeln, sowie einem &#39;Haze&#39; von Fluoreszenz-Signal aus dem dichten dendritischen Dorn (Bügel). Feld A zeigt Gehirne seziert zum Zeitpunkt angegeben. Beachten Sie, das Beschneiden von Dendriten in der Region angedeutet durch die Klammern, (obwohl die axonale Signal bleibt unberührt), so dass von 6-8 Std. APF, die Trübung der dendritischen Signal weg ist. Brains in Panel B wurden bei 0 Stunden APF seziert, bevor der interne Ecdyson Spike (Truman und Riddiford, 2002), ex vivo kultiviert und, wie angegeben. Diese zeigen keine Entwicklungsstörungen Beschneiden von Dendriten, sondern die dendritischen Signal bestehen bleibt bei 10 Stunden APF. Um dies zu umgehen, sind Puppen bei 0 Stunden APF markiert, aber seziert bei 1,5 Stunden APF und kultiviert. Scheibel C zeigt eine repräsentative Reihe dieser Drosophila Pilzkörper von 0 bis 10 Stunden APF. Wie in den nicht-kultivierten Proben, wird das durch dendritische 8 Stunden APF nicht nachweisbar. Maßstabsbalken repräsentiert 20 um.

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Chronische genetische Manipulationen von Gewebe Struktur und Funktion, einschließlich Mutationen und Expression von Transgenen, erzeugen in der Regel eine Kombination aus sofortiger Wirkung und späten indirekte Folgen, die nur sehr schwer zu trennen sind. Als Ergänzung zu genetischen Methoden können mit Pharmakologie erleichtern Verhör des zeitlichen Verlaufs hinter einem Phänotyp. Zum Beispiel, war dies ein starker Ansatz zum Präparieren der Beiträge der verschiedenen Komponenten des Zytoskeletts während...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Schneiders Drosophila Medien </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum (hitzeinaktiviertem) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdyson </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 &amp;mgr; </td></tr><tr><td> Olomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 &amp;mgr; </td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicell Zellkultureinsätze </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 gut </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zange </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropräparate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 bis 548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex-vivo-Kultivierung von Drosophila ganze Gehirn. Dies kann als Kontrapunkt zu chronischen genetische Manipulationen zur Untersuchung der Zellbiologie und der Entwicklung der zentralen Gehirnstrukturen, indem akute pharmakologische Interventionen und Live-Imaging von zellulären Prozessen verwendet werden. Als ein Beispiel für die Technik, vor aus unserem Labor ein Arbeiten haben gezeigt, dass ein bisher nicht berücksichtigter subzellulären Kompartiment zwischen den Axonen und somatodendritischen Fächer von Axonen des zentralen Drosophila Gehirn liegt. Die Entwicklung dieser Kammer, die als das Axon ersten Segment (AIS) 2, wurde genetisch auf dem Neuronen-spezifischen Cyclin-abhängige Kinase, Cdk5 abhängen gezeigt. Wir zeigen hier, dass Ex-vivo-Behandlung von Wildtyp Drosophila Larve Gehirn mit dem Cdk5-spezifische pharmakologische Inhibitoren Roscovitin und Olomoucin 3 akuten Veränderungen im Aktin-Organisation verursacht, undin Lokalisation des Zelloberflächenprotein Fasciclin 2, die die Änderungen in Mutanten, die Cdk5 Aktivität fehlt genetisch gesehen zu imitieren. Ein zweites Beispiel für die Ex-vivo-Kultur Technik wird für Umbau der Verbindungen von embryonalen Pilzkörper (MB) Gamma-Neuronen während der Metamorphose von der Larve zum erwachsenen Verfügung gestellt. Der Pilzkörper ist das Zentrum des olfaktorischen Lernen und Gedächtnis in-the-fly 4, und diese Gamma-Neuronen beschneiden ihre Axonen und Dendriten Filialen während der gesamten Entwicklung und dann wieder verlängern Zweige zu einem späteren Zeitpunkt, um die erwachsenen Innervationsmuster 5 zu etablieren. Beschneiden dieser Neuronen des MB hat sich gezeigt, über lokale Degeneration von Neuriten Zweigen 6 auftreten, durch einen Mechanismus, durch Ecdyson, ein Steroidhormon, ausgelöst wird, prüft auf Ecdyson-Rezeptor B1 7, und das ist abhängig von der Aktivität der Ubiquitin-Proteasom-System 6. Unsere Methode der Ex-vivo-Kultivierung kann be verwendet werden, um weiter zu befragen, den Mechanismus der Entwicklungspsychologie Umbau. Wir fanden, dass in der ex vivo-Kultur Einstellung, Gamma-Neuronen des MB den Prozess der Entwicklung Beschneiden rekapituliert mit einem zeitlichen Verlauf ähnlich der in vivo. Es war jedoch wesentlich, um bis 1,5 Stunden nach Puparium Bildung vor Explantation des Gewebes, damit die Zellen irreversibel zu verpflichten, Metamorphose warten; Sezierung von Tieren zu Beginn der Puparium führten zu wenig oder gar keine Metamorphose in der Kultur. So, mit entsprechender Modifikation kann die Ex-vivo-Kultur-Ansatz angewendet, um zu studieren dynamische als auch stationäre zentrale Aspekte der Biologie des Gehirns werden.

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Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen kann<em&gt; In-vivo-</em&gt; Entwicklung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Pilzkörper in ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur-System.

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

13.0K Aufrufe.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen kann In-vivo- Entwicklung der Drosophila Pilzkörper in ein Ex vivo Kultur-System.

Serie: Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...