وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1SC2GM092789-01A1، وكان MS باحث هيوز الطبي NMSU هوارد برامج مؤسسة بحوث الجامعية. كان موجها الفيديو والتي تنتجها لاناسا ايمي وبتنسيق من الدكتور فيليب لويس مع معهد الإعلام الإبداعي في NMSU.

إجراء 1. البعوض تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفية البعوض الأنوفيلة الغامبية سلالة G3 في insectary 27.5 ° C في ذات الرطوبة 80٪ و12:12 دورة ساعة من الضوء / الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتغذى اليرقات مع القط الغذاء الأرضي مع الخميرة في نسبة 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية البعوض البالغ على دم الفئران لمدة 3 أيام في آخر ظهور لإنتاج البيض. </li></ol> 2. البعوض الوتر تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدوات تشريح الأوتوكلاف (الشرائح وملقط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 50 البعوض باستخدام الشافطة ووضعها على السرير CO تدفق 2 (في نهاية المطاف Flypad). شطف عينة البعوض بشكل تسلسلي في أطباق بتري تحتوي على 3 الإيثانول 70٪ لتنظيف سطح الجسم البعوض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة على شريحة زجاجية تحت stereomicroscopy. إزالة الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 50 الشجاعة في حالة لعزل الحمض النووي metagenomic. جمع 50 الشجاعة في حالة عزلة عن RNA metagenomic. </li></ol&gt; 3. Metagenomic DNA عزل ملاحظة: يتم عزل DNA Metagenomic باستخدام ميتا-G-DNA نومي عزل كيت (التكنولوجيات الحيوية EPICENTRE) مع التعديل هو موضح أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 50 في 300 الشجاعة البعوض TE ميكرولتر. التجانس لهم لمدة 1 دقيقة باستخدام بيو جنرال PRO200 الخالط (PRO العلمي المؤتمر الوطني العراقي، الولايات المتحدة الأمريكية) في 2،000 دورة في الدقيقة السرعة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من محلول الليزوزيم جاهزة وليز و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز A إلى تعليق الخلية. مزيج من vortexing واحتضان في C ° 37 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من التلوي يزيس محلول (2X) و 1 ميكرولتر من K بروتين إلى الأنبوب. مزيج من vortexing. لفترة وجيزة نبض أجهزة الطرد المركزي في أنبوب للتأكد من أن جميع من الحل هو في الجزء السفلي من الأنبوب، واحتضان في 65 ل° C 15 دقيقة، باردة لدرجة حرارة الغرفة، ثم مكان على الجليد لمدة 3-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر من البروتين MPC الكاشف الأمطار إلى أنبوب ومزيج من vortexing بقوة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه رانه الحطام بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لأنبوب مل 2-نظيفة، وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 570 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لطاف. مزيج من الأنبوب مرات عدة قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحمض النووي بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 XG في 4 درجات مئوية. إزالة الأيزوبروبانول دون طرد بيليه DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪ لغسل بيليه. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12000 XG في C. ° 4 إزالة الإيثانول من دون إزعاج بيليه DNA. الهواء تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ملاحظة: لا الإفراط في تجفيف بيليه DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه DNA في 50 ميكرولتر من العازلة TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من صحة حجم DNA المعزولة من خلال المقارنة مع الحمض النووي تحكم Fosmid (40 KB و 100 نانوغرام / ميكرولتر) الواردة في هذه المجموعة، عن طريق الكهربائي للهلام هلام الاغاروز على 1٪. </li></ol> 4. مجموع RNA العزلة ملاحظة: تنظيف منطقة العملمع RNaseZap للحد من التلوث ريبونوكلياز. تم عزل الحمض النووي الريبي Metagenomic من عينات الأمعاء البعوض باستخدام الكاشف عزل TriPure (روش) مع تعديل طفيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 50 الشجاعة البعوض في أنبوب مل 2-مع 500 ميكرولتر TriPure الكاشف عزل. التجانس لمدة 1 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة السرعة على الجليد باستخدام الخالط. اسمحوا الجلوس في RT لمدة 5 دقائق للسماح للتفكك المجمعات البروتين النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم ودوامة لمدة 12 ثانية، وترك الجلوس في RT لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 10000 XG لمدة 10 دقيقة. تأخذ بعناية الأنبوب من دون إزعاج مراحل فصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد، إضافة 250 ميكرولتر الأيزوبروبانول، تخلط جيدا، ووضع في -20 ° C لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لRNA راسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف دون طرد بيليه. غسل بيليه مع الايثانول 75٪ 750 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة قبالة طاف دون الإخلال بيليه. Aالأشعة تحت الحمراء أنبوب تجفيف لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق على RNA مع 30 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج مع الحمض النووي الريبي مجموع الدناز في C ° 37 لمدة 20 دقيقة، ثم تعطيل والدناز من احتضان عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. RNA راسب مع الإيثانول وRNA resuspend في 30 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام NanoDrop. </li></ol> 5. الريباسي RNA استنفاد ملاحظة: تم وضع بروتوكول يعتمد على الأساليب المذكورة سابقا 12،13،15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR التضخيم من الجينات الريباسي شظايا الحمض النووي الريبي هذه الخطوة بإنشاء حمامات عينة محددة الرنا الريباسي، التي سيتم استخدامها كقوالب لفي النسخ المختبر لإنتاج مضاد للاحساس الريباسي الحمض النووي الريبي (arRNA) تحقيقات التي هي مجانية لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم وتركيب مجموعات التمهيدي لالرنا الريباسي جزء PCR (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل PCR في 50ميكرولتر رد فعل البلمرة DNA باستخدام طق (QIAGEN) مع 50 نانوغرام قالب DNA، 1 × PCR العازلة، المغنيسيوم 1.5mM 2 الكلورين، 0.2 ميكرومتر الاشعال مع 35 دورات يبدل طبيعة في 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 15 ثانية الصلب عند 40 درجة مئوية لمدة AMPLICON 23S البكتيرية، و 50 ° C للamplicons أخرى، وتمتد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض المنتجات PCR على 1٪ الاغاروز هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية المنتجات PCR PCR باستخدام تنقية QIAquick عدة مع شطف العازلة في 50 ميكرولتر شطف. قياس تركيز باستخدام NanoDrop. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في النسخ المختبر من البيوتين التي تحمل علامات تحقيقات الرنا الريباسي المضادة للإحساس (arRNA). ملاحظة: في هذه الخطوة، وقد تم تجميع عينة محددة من تحقيقات amplicons الرنا الريباسي مختلف باستخدام T7 MEGAscript عدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رد فعل 20 ميكرولتر لكل عينة محددة الرنا الريباسي AMPLICON عن طريق خلط المكونات أدناه (الجدول 2). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. <stroنانوغرام&gt; ملاحظة: عادة غلة رد فعل&gt; RNA ميكروغرام 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر الدناز I (المدرجة في المجموعة) إلى رد فعل واحتضان في C ° 37 لمدة 20 دقيقة لإزالة قالب DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪ إلى رد فعل، الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ليعجل توليفها arRNA. تجاهل طاف وغسل بيليه مع الايثانول 75٪ 750 ميكرولتر. إعادة تعليق تحقيقات RNA في 50 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام NanoDrop. تحقيقات المحل في -80 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرنا الريباسي الطرح مع arRNA المعقدة البيروكسيديز. ملاحظة: هذه الخطوة توظف arRNA المعقدة البيروكسيديز لهجن لالرنا الريباسي في العينة RNA الكلي. يتم التقاط الهجينة الرنا الريباسي-arRNA من streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي. ويستند هذا الإجراء على بروتوكول الموصوفة في المرجع 13 مع تعديلات طفيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0،1 N هيدروكسيد الصوديوم، الصوديوم الكلور 20XIDE-سترات (SSC) و 1 X SSC مع الفورماميد 20٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج RNA ميكروغرام 1 المجموع مع 16S 23S البكتيرية وتحقيقات (0.75 ميكروغرام لكل منهما)، 18S 28S البعوض وتحقيقات (0.75 ميكروغرام لكل منهما)، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 2.5 ميكرولتر 20X العازلة SSC، 10 ميكرولتر الفورماميد 100٪ في أنبوب PCR ميكرولتر 200 ، إضافة نوكلياز خالية المياه إلى 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب التفاعل في cycler الحرارية واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفتح هيكل الثانوي والطريق المنحدر إلى أسفل إلى 25 ° C باستخدام 5 ° C الزيادات لمدة 1 دقيقة لكل ° C للسماح للتهجين من تحقيقات والرنا الريباسي arRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرنا الريباسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 300 ميكرولتر الخرز المغلفة streptavidin في أنبوب مل 1.7. وضع أنبوب على رف الفصل المغناطيسي لشل الخرز. إزالة طاف. إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم و0.1N ميلX أيضا. وضع أنبوب عودة إلى رف المغناطيسي وماصة قبالة طاف. إعادة تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من 1X SSC، تخلط جيدا، والخرز شل ماصة قبالة طاف. تكرار غسل مع 300 ميكرولتر من 1X وقت واحد أكثر SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم 3 مأخوذة من الخرز، 100 ميكرولتر لكل منهما، في أنابيب مل 1.7. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي، وإزالة طاف بواسطة pipetting. ملاحظة: يتم استخدام مأخوذة من الخرز لمدة 3 جولات من التقاط المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي-arRNA الهجينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر 1X SSC مع الفورماميد 20٪ في رد فعل 50 ميكرولتر التهجين. نقل رد الفعل في أنبوب قسامة حبة الأول، وتخلط جيدا. احتضان RT في لمدة 10 دقيقة للسماح استولت على التحقيق المعقدة البيروكسيديز-الرنا الريباسي الهجينة من الخرز streptavidin. نفض الغبار الأنبوب كل دقيقة 2 إلى مزيج أثناء الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لشل الخرز، ونقل إلى طاف عليق 2عشق من الخرز، تخلط جيدا واحتضان على النحو الوارد أعلاه. إجراء القبض الثالثة نقل طاف في أنبوب الثالث من الخرز. خلط واحتضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل غير الرنا الريباسي طاف في أنبوب جديد وتنقية السلوك باستخدام مجموعة MinElute RNeasy لإزالة الفورماميد بعد دليل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من كفاءة استنفاد الرنا الريباسي باستخدام RNA 6000 اجيلنت بيكو عدة شرائح على Bioanalyzer (الشكل 4). </li></ol></li></ol></li></ol> ملاحظة: إن المنضب الرنا الريباسي عينات الحمض النووي الريبي تتعرض لمرنا التضخيم إذا لزم الأمر 8.

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+the+Bemisia+tabaci+Transcriptome+Reveals+a+Highly+Diverse+Bacterial+Community+and+a+Robust+System+for+Insecticide+Resistance.">Pyrosequencing the Bemisia tabaci Transcriptome Reveals a Highly Diverse Bacterial Community and a Robust System for Insecticide Resistance.</a> PLoS One. 7, e35181 (2012).</li><li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+metatranscriptome+of+the+protistan+community+in+Coptotermes+formosanus+with+emphasis+on+the+lignocellulolytic+system.">Profiling the metatranscriptome of the protistan community in Coptotermes formosanus with emphasis on the lignocellulolytic system.</a> Genomics. 99, 246-255 (2012).</li><li>Gosalbes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+approach+to+analyze+the+functional+human+gut+microbiota.">Metatranscriptomic approach to analyze the functional human gut microbiota.</a> PLoS One. 6, e17447 (2011).</li><li>Urich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assessment+of+soil+microbial+community+structure+and+function+through+analysis+of+the+meta-transcriptome.">Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome.</a> PLoS One. 3, e2527 (2008).</li><li>Gilbert, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+large+numbers+of+novel+sequences+in+the+metatranscriptomes+of+complex+marine+microbial+communities.">Detection of large numbers of novel sequences in the metatranscriptomes of complex marine microbial communities.</a> PLoS One. 3, e3042 (2008).</li><li>Gifford, S. M., Sharma, S., Rinta-Kanto, J. M., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+a+deeply+sequenced+marine+microbial+metatranscriptome.">Quantitative analysis of a deeply sequenced marine microbial metatranscriptome.</a> ISME J. 5, 461-472 (2011).</li><li>Poretsky, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+day/night+metatranscriptomic+analysis+of+microbial+communities+in+the+North+Pacific+subtropical+gyre.">Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre.</a> Environmental microbiology. 11, 1358-1375 (2009).</li><li>Shrestha, P. M., Kube, M., Reinhardt, R., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+activity+of+paddy+soil+bacterial+communities.">Transcriptional activity of paddy soil bacterial communities.</a> Environmental Microbiology. 11, 960-970 (2009).</li><li>Mettel, C., Kim, Y., Shrestha, P. M., Liesack, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+mRNA+from+soil.">Extraction of mRNA from soil.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76, 5995-6000 (2010).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+two+ribosomal+RNA+removal+methods+for+microbial+metatranscriptomics.">Validation of two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics.</a> Nat. Meth. 7, 807-812 (2010).</li><li>Pang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+mRNA+purification+by+magnetic+capture-hybridization+method.">Bacterial mRNA purification by magnetic capture-hybridization method.</a> Microbiol. Immunol. 48, 91-96 (2004).</li><li>Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+quantitative+analyses+of+a+universal+rRNA-subtraction+protocol+for+microbial+metatranscriptomics.">Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics.</a> ISME J. 4, 896-907 (2010).</li><li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya.">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PLoS One. 6, e24767 (2011).</li><li>Su, C., Sordillo, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+enrich+mRNA+from+total+prokaryotic+RNA.">A simple method to enrich mRNA from total prokaryotic RNA.</a> Mol. Biotechnol. 10, 83-85 (1998).</li><li>Gusmao, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-dependent+and+culture-independent+characterization+of+microorganisms+associated+with+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+(L.)+and+dynamics+of+bacterial+colonization+in+the+midgut.">Culture-dependent and culture-independent characterization of microorganisms associated with Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) (L.) and dynamics of bacterial colonization in the midgut.</a> Acta Trop. 115, 275-281 (2010).</li><li>Lindh, J. M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts.">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li><li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses:+past+and+future+trends.">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li><li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies.">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401 (2009).</li><li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity.">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

A المجتمع الميكروبية المعقدة تكمن في النظام البيئي الأمعاء البعوض 14،16،17. يمكن Metatranscriptomic التسلسل (RNA-يليها) تكشف عن المعلومات الفنية التي تعتمد السياق استجواب من قبل الجراثيم كامل transcriptome 4،18. من الناحية الفنية، بنسبة ضئيلة من د (T) تخصيب بوساطة من بروكاريوت?...

وقد تقدمت الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل إلى حد كبير من خلال السماح metagenomics دراسة لتقييم التكوين التصنيفي وظائف الجيني للتجمع الجراثيم. يمكن RNA في رسم التسلسل (RNA-تسلسل) 1 تجاوز الثقافة القائمة على أساليب التحقيق metatranscriptomes الميكروبية في 2-5 سياقات مختلفة. عقبة رئيسية أمام الميكروبية RNA-يليها هو صعوبة في إثراء مرنا، لأنها لا الأنواع مرنا بروكاريوتيك مذيل بعديد الأدينيلات ثابت. ولذلك، بنسبة ضئيلة د رسول بوساطة (T) لا ينطبق تخصيب. إزالة الرنا الريباسي وفيرة، وهو نهج بديل لتخصيب مرنا. وقد استخدمت التجارية مجموعات استنفاد الرنا الريباسي، مثل Microexpress الجرثومي مرنا عدة التخصيب (Ambion)، RiboMinus Transcriptome كيت عزل (بكتيريا) (لايف تكنولوجيز)، ومرنا-ONLY عزل مرنا بروكاريوتيك مجموعة (EPICENTRE) التي تحط تفضيلي الرنا الريباسي مع نوكلياز خارجية، لإزالة الرنا الريباسي 6-8. ومع ذلك، فإن تحقيقات في التقاط Microexpressأو RiboMinus جيدة لإزالة الرنا الريباسي المعروفة من نموذجي الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام (انظر مواصفات الصانعين)، ولكن أقل متوافقة مع الرنا الريباسي من الميكروبات غير معروف. ونتيجة لذلك، قد تكون إزالة أقل كفاءة لمدة 8-10 عينات metagenomic. الى جانب ذلك، كان الإخلاص وفرة مرنا مشكوك عندما تم تطبيق العلاج نوكلياز خارجية 11. وعموما، كان الطرح القائم على استنزاف الرنا الريباسي أقل انحيازا وأكثر فعالية في تخصيب مرنا في إعدادات metagenomic 10-13. القناة الهضمية البعوض تستوعب المجتمع الميكروبية الحيوية 14. ونحن مهتمون في وصف وظيفة القناة الهضمية microbiome البعوض باستخدام RNA-SEQ. في عينة الحمض النووي الريبي معزولة عن الشجاعة البعوض، سواء RNA البعوض والجراثيم موجودة. هنا، نحن تصف بروتوكول تعديل لاستخدام الرنا الريباسي المجتمع تحقيقات محددة في استنزاف بكفاءة الرنا الريباسي البعوض والجراثيم عن طريق التهجين مطروح. ومرنا الناتجةعينات المخصب المناسبة لRNA-SEQ. ويصور سير العمل الكلي في الشكل 1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Meta-G-Nome 				DNA isolation kit</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>MGN0910</td>
 <td>Metagenomic 				DNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TriPure </td>
 <td>Roche</td>
 <td>11667165001</td>
 <td>Mdetagenomic 				RNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEGAscript 				T7 kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1334</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA probes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaseZap</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9780</td>
 <td>RNase 				free working area </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-16-UTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11388908910</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-11-CTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4739205001</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin 				magnetic beads</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1420S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic 				separation rack</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1506S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy 				mini kit</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>74104</td>
 <td>Purification 				of subtracted RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free 				DNase Set</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>79254</td>
 <td>Removal 				DNA contamination </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 				RNA 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Gen 				PRO200 				Homogenizer</td>
 <td>PRO 				Scientific</td>
 <td>01-01200</td>
 <td>Mosquito 				gut tissue homogenization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 				1000 Spectrophotometer</td>
 <td>Thermo 				Scientific</td>
 <td></td>
 <td>DNA 				&amp; RNA quantitation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2100 				Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>G2940CA</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq

القناة الهضمية البعوض يستوعب المجتمعات الميكروبية الحيوية عبر مراحل مختلفة من دورة حياة الحشرة. وتوصيف الوظائف والقدرات الوراثية للمجتمع الأمعاء توفير نظرة ثاقبة على آثار مجهريات البقعة الأمعاء على الصفات الحياة البعوض. Metagenomic أصبح RNA-تسلسل أداة مهمة لتحليل transcriptomes من الميكروبات المختلفة موجودة في المجتمع الميكروبي. RNA الرسول يتألف عادة٪ فقط 1-3 من الحمض النووي الريبي مجموع، بينما الرنا الريباسي يشكل حوالي 90٪. أنه يمثل تحديا لتخصيب رسول RNA من عينة الحمض النووي الريبي metagenomic الميكروبية لأن معظم الأنواع مرنا بروكاريوتيك تفتقر مستقرة بولي (A) ذيول. هذا يمنع بنسبة ضئيلة د مرنا بوساطة (T) العزلة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يستخدم عينة مشتقة الرنا الريباسي التقاط تحقيقات لإزالة الرنا الريباسي من عينة الحمض النووي الريبي مجموع metagenomic. لتبدأ، وتتضخم كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي الوحيدات شظايا صغيرة وكبيرة من عينة DNA metagenomic المجتمع. ثم، وcommuوقد تم تجميع بيئتهم الخاصة العقاقير المعقدة البيروكسيديز الريباسي تحقيقات RNA T7 في المختبر باستخدام الحمض النووي الريبي بوليميراز. والمهجنة للتحقيقات المعقدة البيروكسيديز الرنا الريباسي الحمض النووي الريبي مجموع ل. يتم التقاط الهجينة من streptavidin المغلفة الخرز وإزالتها من الحمض النووي الريبي مجموع. هذا البروتوكول على أساس الطرح يزيل بكفاءة كل من البعوض والجراثيم الرنا الريباسي من العينة RNA الكلي. تتم معالجة مزيد من العينة المخصب مرنا لتضخيم الحمض النووي الريبي RNA وتسلسل.

أن البروتوكول تضمن ثلاثة أقسام: (1) إعداد قوالب DNA PCR metagenomic لالرنا الريباسي، (2) إنشاء عينة محددة تحقيقات الرنا الريباسي القبض، (3) استنزاف الرنا الريباسي من الحمض النووي الريبي مجموع بواسطة التهجين مطروح. عزل جودة عالية DNA RNA metagenomic وضروري في العملية برمتها. وتعديل عزل ال...

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq at JoVE.com

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

وتم وضع بروتوكول نضوب RNA الريباسي (الرنا الريباسي) لتخصيب رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) لRNA-يليها من metatranscriptome الأمعاء البعوض. تم إنشاء نموذج الرنا الريباسي تحقيقات محددة، والتي كانت تستخدم لإزالة الرنا الريباسي عبر الطرح، من البعوض والميكروبات الوتر. يمكن أداء بروتوكول يؤدي إلى إزالة ما يقرب من 90-99٪ من الرنا الريباسي.

استنزاف الحمض النووي الريبي الريباسي لMetagenomic الوتر البعوض RNA-يليها

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

depletion-of-ribosomal-rna-for-mosquito-gut-metagenomic-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

19.5K Views.  New Mexico State University. وتم وضع بروتوكول نضوب RNA الريباسي (الرنا الريباسي) لتخصيب رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) لRNA-يليها من metatranscriptome الأمعاء البعوض. تم إنشاء نموذج الرنا الريباسي تحقيقات محددة، والتي كانت تستخدم لإزالة الرنا الريباسي عبر الطرح، من البعوض والميكروبات الوتر. يمكن أدا?...

Video: Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

بروتوكول للتربية البعوض (A. الغامبية)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em&gt; الزاعجة المصرية</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;