يساهم البروتوكول الحالي في دراسة آليات الدماغ الكامنة وراء السلوك الحركي الماهر. يسمح علم البصريات اللاسلكي بالتلاعب بخلايا عصبية محددة بينما يؤدي الأشخاص مهمة في حرية الحركة. بالاقتران مع تصوير الفيديو عالي السرعة ، من الممكن إجراء تحليل مفصل للسلوك الحركي الدقيق.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم المشاكل الحركية في اضطرابات النمو العصبي والتنكس العصبي. يمكن استخدام هذه التقنيات لدراسة وظائف الدماغ في النماذج السلوكية الأخرى أيضا. وستساعد ديانا رودريغيز مونوز، وهي طالبة جامعية من مختبري، في إجراء التجارب.
بالنسبة للعمليات الجراحية ، ابدأ بإعداد قنية LED بالطول المطلوب وفقا للإحداثيات الظهرية البطنية لهيكل الاهتمام. للقيام بذلك ، قم بقطع الألياف الزجاجية إلى طول أطول من الحجم النهائي المطلوب وطحن طرف الألياف إلى الطول المستهدف باستخدام ورق صنفرة خشن. ثم ، قم بتلميع طرف الألياف بورق صنفرة ناعم.
بالنسبة للحقن المجهري ، املأ ماصة بالزيت المعدني وضع الماصة في الحاقن الدقيق. تأكد من أن الحاقن الدقيق يعمل بشكل صحيح عن طريق حقن بعض الزيوت المعدنية. بعد ذلك ، قم بإعداد الفأر المخدر للجراحة عن طريق تطبيق مرهم للعيون وإزالة الشعر من فروة الرأس باستخدام أداة تشذيب الشعر وكريم إزالة الشعر.
ثم ، امسح فروة الرأس بمسحات قطنية تحتوي على 8٪ من يود البوفيدون و 70٪ من الإيثانول بالتناوب ثلاث مرات لكل منهما. بعد التعقيم ، ضع الماوس في الجهاز المجسمة وقم بتأمين الرأس ، مما يضمن تسوية الجمجمة في المحاور الإنسية الجانبية والأمامية الخلفية. استخدم مشرطا لعمل شق طوله سنتيمتر واحد عبر فروة الرأس على مستوى العينين على طول المحور السهمي.
ثم ، قم بسحب الجلد لفضح الجمجمة وتنظيف السمحاق باستخدام مسحات القطن. نظف سطح الجمجمة بمحلول ملحي ومسحات قطنية وقم بحل أي نزيف على السطح باستخدام رماح العين الماصة المعقمة. بعد ذلك ، ضع قطرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 2.5٪ باستخدام قطعة قطن واتركها تعمل لبضع ثوان لجعل خيوط الجمجمة مرئية والحصول على مرجع أفضل.
بعد بضع ثوان ، نظف المنطقة جيدا باستخدام قطعة قطن نظيفة. باستخدام ماصة زجاجية يبلغ قطرها النهائي 15 ميكرون ، حدد موقع bregma و lambda للتحقق من تسوية الجمجمة في المحور الأمامي الخلفي. بعد ذلك، قم بطلاء نقطة مرجعية في فروة الرأس فوق الإحداثيات المحددة باستخدام علامة.
في النقطة المرجعية ، قم بإجراء بضع القحف قطره ملليمتر واحد مع تطبيق ضغط لطيف على الجمجمة باستخدام أداة دوارة بسرعة منخفضة إلى متوسطة مع مثقاب أسنان صغير مستدير. بمجرد الانتهاء من ذلك ، حرك الشعيرات الدموية نحو الإحداثيات الأمامية والخلفية المحددة ، أو AP ، والإحداثيات الإنسية الجانبية أو ML. قم بتحميل الشعيرات الدموية ب 300 إلى 400 نانولتر من الفيروس المرتبط بالأدينو المعتمد على CreE ، أو AAV ، مثل AAV1 ، D-flox channelrhodopsin mCherry للتعبير عن channelrhodopsin في المنطقة ذات الاهتمام.
يمكن استخدام AAV كعنصر تحكم للتعبير عن بروتين المراسل. بعد التأكد من عدم انسداد الطرف ، أدخل الماصة الزجاجية في الدماغ عند الإحداثيات الظهرية البطنية ناقص 3.35 ملم في المخطط الظهري الجانبي وحقن 200 نانولتر من الفيروس باستخدام حاقن أوتوماتيكي بمعدل 23 نانولتر في الثانية. انتظر لمدة 10 دقائق بعد الحقن قبل سحب الماصة الزجاجية ببطء لتجنب الانسكاب.
ثم ، قم بتنظيف وتجفيف أي بقايا باستخدام مسحات القطن. بعد ذلك ، قم بتوصيل قنية LED الزجاجية بالذراع المجسمة ومعايرة الإحداثيات باستخدام bregma كمرجع. ثم أدخل القنية ببطء لتجنب تلف الأنسجة وضعها على بعد 100 ميكرومتر فوق موقع الحقن.
بمجرد وضع قنية LED في مكانها ، أضف قطرة من 100 ميكرولتر من لاصق الأنسجة على حافة بضع القحف. استخدم فرشاة معقمة لتطبيق خليط من أسمنت الأسنان الطازج حول موصل القنية شيئا فشيئا ، وبناء طبقات حتى يتم تغطية الجمجمة ويتم توصيل الموصل بإحكام بالجمجمة ، تاركا المسامير خالية تماما. عندما يجف الأسمنت تماما ، أغلق الجلد حول الغرسة باستخدام لاصق الأنسجة.
ثم ضع الماوس في قفص الاسترداد فوق وسادة التدفئة عند 33 درجة مئوية أثناء مراقبة علامات الانزعاج أو الألم. سجل سلوك الحيوان بكاميرا عادية والتقط 30 إلى 60 إطارا في الثانية من مقدمة الغرفة. يمكن وضع مرآة تحت غرفة التدريب بزاوية 45 درجة لمراقبة وضع الحيوان.
عندما تبدأ الفئران في الوصول إلى الكريات ، أدر قنية LED يدويا باستخدام وحدة التحكم عن بعد للحصول على تحفيز مستمر للوقت الذي يتم فيه تنفيذ السلوك لمدة لا تزيد عن ثانيتين. يقوم جهاز التحفيز بتشغيل مؤشر LED يبلغ 470 نانومتر بكثافة عند طرف مللي واط واحد لكل ملليمتر مربع. تمت دراسة السلوك الحركي الدقيق للحيوان تحت التلاعب البصري الوراثي مع مهمة الوصول إلى الفهم.
تعلمت الفئران تنفيذ المهمة في غضون يومين وحققت دقة تزيد عن 55٪ ، ووصلت إلى هضبة بعد خمسة أيام من التدريب. تم تتبع مسار الحركات باستخدام تصوير فيديو عالي السرعة ، مما يجعل من الممكن تحليل علم الحركة. تم إجراء تقييم قابل للقياس الكمي للمعلمات مثل المسافة المقطوعة والسرعة والتسارع ونقطة النهاية والمسار.
في التجارب الفائتة ، بدأت الفئران حركة الإمساك بعيدا عن الكريات أكثر من التجارب الضاربة. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبطت الأخطاء بشكل كبير بوضعية الماوس ، والتي أظهرتها الاختلافات في زاوية الجسم أثناء التجارب التي تم ضربها وتفويتها. التنشيط المقابل للدوبامين D1 الذي يعبر عن الخلايا العصبية الشوكية الإسقاط ، أو SPNs ، قلل من نجاح الإمساك مقارنة بظروف التحكم.
أثناء التحفيز البصري الوراثي ، زاد مسار المخلب في مسافة السفر ، مما أدى إلى عدم القدرة على استهداف الكريات وزيادة في نوع الخطأ الأولي الأول. أظهر تحليل المكون الرئيسي ، أو PCA ، أن جميع مسارات التجارب أثناء تنشيط D1 SPNs المقابل منفصلة في مجموعة لا يوجد بها أي تداخل تقريبا مع مجموعة التحكم ، مما يشير إلى وجود تشابه منخفض. أدى تنشيط DSPNs في الجانب الجانبي إلى زيادة في تشتت المسار الذي أظهره تحليل PCA.
وبالتالي ، قام تنشيط D1 SPNs الجانبي بتعديل مسار الوصول دون تغيير النتيجة السلوكية. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، احرص على وضع القنية بشكل صحيح حتى لا تنفصل أثناء جلسات التدريب. يمكن استخدام هذه الطريقة في النماذج السلوكية الأخرى لدراسة السلوك الحركي والمعالجة الحسية والتعلم والذاكرة.
سيسمح علم البصريات اللاسلكي بدراسة السلوك الطبيعي وأسسه العصبية البيولوجية في مواضيع حرة الحركة حقا.
