تم دعم M.Z. و K.S.F. وهذا العمل من خلال منحة تم تقديمها في إطار تحدي الابتكار في بيت (PInCh) ، من خلال معهد العلوم السريرية والترجمة في جامعة بيتسبرغ ، ومنحة NHLBI R01 HL153407 ، التي تم منحها إلى M.Z.

وافقت لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها التابعة لجامعة بيتسبرغ على جميع البروتوكولات الحيوانية المحددة في هذا المنشور قبل إجراء أي من هذه التجارب الحيوانية.
ملاحظة: هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تنفيذ في دراسات إزالة المخاطية الجسمية باستخدام التصوير النويدية المشعة مع جهاز مزدوج الطرائق SPECT / CT الماسح الضوئي. التقنيات التي أظهرت هي معايرة النظام تشغيل، الفئران تخدير، التنبيب القصبي من الفئران، غرس النظائر في الرئتين، والتصوير مزدوجة الطريقة، والتسجيل المشترك لهذه الصور، والتحليل.
1. SPECT / CT نظام الإعداد
<ol><li>تصميم سير عمل مناسب وإعداد قبل تشغيل التجارب باستخدام الحيوانات الحية.<ol>
<li>استخدام اقتناء SPECT يتكون من 60 إسقاطاً بحجم خطوة 6س بين الإسقاطات مع دائرة نصف قطرها 40 سم من الدوران. وتتألف عملية اقتناء التصوير المقطعي من 220 إسقاطات بزاوية 1.6س بين الإسقاطات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تأكد من أن النظام يحتوي على التكريمات MWB الصحيحة للفئران والتصوير SPECT في المكان. إذا تم تثبيت collimators غير مناسب استخدام معالج الcollimator لتثبيت تلك الصحيحة.</li>
	<li>قم بتشغيل معايرات النظام الضرورية لإعداد النظام للاستخدام. ملاحظة: تحتاج مكونات SPECT و CT الخاصة بالماسح الضوئي إلى المعايرة. معايرة مكونات التصوير المقطعي باستخدام تكييف المصدر ومعايرة الظلام/ الضوء (D/L) مرة واحدة في اليوم، معايرة إزاحة المركز (COS) كل أسبوعين، وتقييم أجهزة الأشعة السينية كل شهر. مكونات SPECT تحتاج إلى معايرة مرة واحدة في السنة.<ol>
<li>لتقييم أجهزة الأشعة السينية، تحقق من مربع تقييم أجهزة الأشعة السينية أثناء معايرات الأشعة المقطعية(قائمة معايرة CT تكميلية).</li>
		<li>لتنفيذ تكييف المصدر، تحقق من مربع تهيئة المصدر "تنفيذ" أثناء معايرات CT(قائمة معايرة CT تكميلية).</li>
		<li>لإجراء معايرة D/L، تحقق من المربع D/L بجوار بروتوكول اقتناء الأشعة المقطعية المستخدم أثناء التجارب أثناء معايرة الأشعة المقطعية. ألغ تحديد جميع البروتوكولات الأخرى(قائمة معايرة CT تكميلية).</li>
		<li>لإجراء معايرة COS، استبدل السرير بأداة حلقة المعايرة، واضبط إعدادات نوع السرير لتطابق إعدادات التحكم في الحركة، وتحقق من مربع COS بجوار بروتوكول اقتناء الأشعة المقطعية المستخدم أثناء التجارب أثناء معايرات الأشعة المقطعية. ألغِ تحديد جميع البروتوكولات الأخرى(قائمة معايرة CT التكميلية، حلقة المعايرة التكميلية).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. الزرع الماوس وتقطير
<ol><li>وزن الفئران ليتم مسحها ضوئيا. إذا كان المسح الضوئي ماوس متعددة، والعناية لوضع علامة على الفئران لأغراض تحديد الهوية باستخدام أساليب مثل لكم الأذن أو وضع علامات على الذيل.</li>
	<li>تخدير الماوس باستخدام 1.5٪ isoflurane مع تدفق الغاز من 2 L / min O2 في غرفة الغاز لمدة 5 دقائق لإنتاج التخدير من عمق كاف، حتى التنفس يبطئ إلى ~ 55-65 نفسا في الدقيقة 16 (الشكل 1A).</li>
	<li>إزالة الماوس من الغرفة وتعليق من قبل القناطع الأمامية على موقف الاحتضان في 45س المنحدر. تجهيز موقف الاحتضان مع مخروط الأنف لضمان تخدير الماوس أثناء النوبات (الشكل 1B).</li>
	<li>ربط نهاية واحدة من سلك الألياف البصرية 50 ميكرومتر إلى مصدر الضوء والخيط 20- قياس كانينولا أكثر من ذلك باستخدام الأسلاك لتكون بمثابة دليل (الشكل 1C).</li>
	<li>افتح فم الفأر واسحب اللسان إلى الأمام باستخدام ملقط حادة. إلقاء الضوء على سلك دليل واستخدامها لتصور الحبال الصوتية (الشكل 1D).</li>
	<li>تمرير سلك دليل من خلال الحبال الصوتية بحيث السلك هو فقط وراء الحبال الصوتية ويستريح في القصبة الهوائية العليا. حرك 1 بوصة cannula إلى الأمام على طول السلك لntubate الماوس، وتمرير القنية عميقة بما فيه الكفاية بحيث محور منه هو ضد القطاعات الحيوانية (الشكل 1E). إزالة السلك ترك القنية في مكانها.</li>
	<li>اختبار النوبلة عن طريق توصيل لفترة وجيزة كانولا مع إصبع والتحقق من وجود تغييرات في التنفس. توقف التنفس أو التنفس المتوتر أثناء توصيل والسرعة في التنفس عند الإفراج هي علامات على النوبات القصبية المناسبة. إذا لم يكن هناك أي تغيير في أنماط الجهاز التنفسي عند سد القنية، فإن هذا الأخير من المرجح في المريء.</li>
	<li>إعداد 0.2 mCi من 99mالكنيتيوم الكبريت الغروانية(99mTc-Sc) في حجم 10 ميكرولتر، والميصة في القنية. السماح للماوس إلى استنشاقه تلقائيا في الرئتين أكثر من 1-2 دقيقة (الشكل 1F). إزالة كانولا قبل نقل الماوس إلى منصة الماسح الضوئي. ملاحظة: أعد النويدات المشعة وتصفيةها الكاردينال هيلث.</li>
</ol>3. SPECT / التصوير المقطعي
<ol><li>نقل الماوس إلى البليت 25 مم مع مخروط الأنف وآمنة مع الشريط، مع الحرص على عدم الشريط الصدر والبطن بإحكام جدا لتجنب إضعاف التنفس. الحرص على إزالة أي علامات الأذن المعدنية المرفقة الماوس.</li>
	<li>إعداد شبح مشع يتكون من 0.05 mCi في 200 ميكرولتر ووضع هذه الكمية في أنبوب PCR 0.2 مل. ضع الأنبوب عن طريق التسجيل على البليت تحت أسفل البطن من الماوس ، وتجنب التداخل مع الرئتين. ملاحظة: يستخدم الشبح لغرض المشاركة في تسجيل الصور CT وSPECT، فضلا عن التحكم السلبي لإزالة.</li>
	<li>أدخل الماوس في نظام SPECT/CT، وحدد سير عمل التصوير، وقم بتشغيل الإعداد.</li>
	<li>قم بإعداد تحديد موضع أجهزة الكشف على الماوس، وتشغيل سير عمل التصوير.</li>
	<li>إعداد قفص للفئران التي تلقت النشاط الإشعاعي بعد العملية، مع وصول غير مقيد إلى الغذاء والماء، ووضع علامات واضحة باستخدام ملصق أمان الإشعاع.</li>
	<li>عند الانتهاء من سير العمل، وإزالة الماوس من منصة التصوير، والسماح لها لاسترداد في القفص المعد لمدة 6 ساعات بين عمليات المسح (نهاية المسح 1 إلى بداية المسح 2) مع الإعلان libitum الوصول إلى الطعام والماء. 6 ح تم اختياره لأنه يتوافق مع الفترة الزمنية التي إزالة الخطية اعتمادا على وظيفة أهداب يجري مع إزالة القليل جدا من السنخية.</li>
	<li>بعد 6 ساعات، إعادة تخدير الماوس والمسح الضوئي، جنبا إلى جنب مع الوهمية، وذلك باستخدام نفس سير العمل لقياس كمية النظائر مسح من الشعب الهوائية. ملاحظة: من الأهمية بمكان السماح للماوس بالتعافي كتخدير غير متقطع مع isoflurane لمدة 6 ساعات سيؤدي إلى تأثير كبير للإهداب الاكتئاب، مما يؤدي إلى ما يقرب من الصفر التصاريح المخاطية.</li>
</ol>4- التحليل
<ol><li>بعد التصوير، قم بإجراء المعالجة اللاحقة لإعادة إنشاء صور مكدس ثلاثية الأبعاد كاملة.<ol>
<li>مخطط الرسم البياني الصور SPECT باستخدام إعدادات المصنع القياسية ل99mTc، ومن ثم إعادة بناء باستخدام خوارزمية MAP3D ووظيفة انتشار نقطة (PSF) إعادة الإعمار. ملاحظة: إعادة إنشاء تم تنفيذ باستخدام 8 التكرارات و 6 مجموعات فرعية. وتحتاج عملية إعادة البناء الفعالة إلى نسبة من المجموعات الفرعية إلى الإسقاطات عند 1:10 أو أن تقسم بالتساوي إلى عدد الإسقاطات، لذلك تم استخدام 6 مجموعات فرعية بسبب الاقتناء باستخدام 60 إسقاطات.</li>
		<li>إعادة بناء الصور CT باستخدام خوارزمية Feldkamp و Filter Shepp-Logan. ملاحظة: إعادة إنشاء تم تنفيذ باستخدام 4 التكرارات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>معالجة الصور CT و SPECT في FIJI ImageJ21 باستخدام أداة إعادة النسخ لإنشاء صور عرض الإكليلي من الصور المحورية الافتراضية. ثم قم بإجراء إسقاط مجموع الرصينات z على صورة SPECT لإضافة بيانات العد من كل شريحة وإنشاء صورة واحدة لتسهيل التحليل.</li>
	<li>تغيير حجم وشارك في تسجيل الصور CT وSPECT باستخدام أنبوب Eppendorf الوهمية كمرجع(الشكل 2A, B). تتبع واستخدام القياسات تغيير الحجم متسقة عبر جميع العينات.</li>
	<li>Binarize صورة CT باستخدام العتبة التلقائية، تليها عكس المكدس، وتنفيذ إسقاط مجموع z-المكدس لتوليد مخطط تفصيلي للرئتين للتحليل (الشكل 2C).</li>
	<li>قم بتدوير صور CT وSPECT ودمج الصورة باستخدام أدوات القناة. حساب مؤسسة تحدي الألفية عن طريق رسم عائد الاستثمار حول الرئة اليمنى وقياس (الشكل 2D). ملاحظة: سيكون هذا القياس من إجمالي عدد في الرئة اليمنى لنقاط الوقت 0 و 6 ساعات، مع تصحيح الصور لمدة 6 ساعات للتحلل الإشعاعي باستخدام الصيغة: N(t)= N0e−t. 99 متر Tc-Sc لديه ثابت اضمحلال 3.21e−5 في الثانية مع نصف عمر من ~ 6 ساعات. يمكن استخدام هذه القيم ثم لحساب إزالة النسبة المئوية. ملاحظة: يتم اختيار الرئة اليمنى لرسم العائد على الاستثمار وقياس التهم كما إزالة المخاطية سوف تنقل النظائر المشعة من الرئتين إلى البلعوم من حيث سيتم ابتلاعها وينتهي في المعدة. في كثير من الأحيان ، يمكن رؤية العد في المعدة التي قد تتداخل مع الرئة اليسرى وبالتالي تنتج تعدادات خاطئة. ويمكن تجنب هذا الخلط من خلال قياس عدد في الرئة اليمنى فقط.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution:+Tracing+the+origins+of+centrioles,+cilia,+and+flagella.">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li><li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=University+of+North+Carolina+Virtual+Lung,+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health.">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li><li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+in+the+airways.">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li><li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries.">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).</li><li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction:+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients.">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li><li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease.">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li><li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction.">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li><li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia/Kartagener+syndrome.">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR.">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li><li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research.">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li><li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil.">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li><li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour.">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).</li><li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia.">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction.">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model.">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).</li><li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig:+Role+of+Bitter+Taste+Agonists.">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography.">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).</li><li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy.">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li><li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs.">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs:+a+study+in+a+chronic+preparation.">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li><li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+SPECT+collimator+selection,+optimization,+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging.">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li></ol>

ولا علاقة لأي منها بهذا العمل.

دور الأهداب التنفسية في كل من المرض والتنمية لا يزال يتطور ويقدر بشكل أفضل. متزامن، الضرب الميتاكرونا من العديد من الكره المتحركة على السطح apical من الخلايا بطانة شجرة tracheobronchial توليد تدفق cephalad إنتاج إزالة المخاطية أو MCC. هو للخطر MCC في سيليوباثيس مثل PCD22, المكتسبة من الأمراض مثل مرض الانسداد الرئوي والإيدز18, ويجري الاعتراف أهميتها في أمراض القلب والأمراض المنقولة عن طريق الامراض, لا تعتبر تقليديا أن ciliopathies. وقد أظهرت البيانات الأخيرة ضعف الجهاز التنفسي في كل من CHD مع heterotaxy23 ودون heterotaxy7. وقد تبين أن هذا الخلل في الإداب المتحركة يترجم إلى أعراض تنفسية أكبر9 بالإضافة إلى اعتلال أكبر بعد الجراحة8. معظم، إن لم يكن كل، من هذه الأمراض، ونماذج الماوس المتاحة وبروتوكولنا لقياس MCC في الفئران هو أداة قيمة التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المحتملة.
توفر النماذج الحيوانية فائدة لفهم الأمراض وتطوير العلاجات. في التصوير الحيواني في الجسم الحي يوفر فائدة إضافية مع القدرة على الحصول على نقاط بيانات متعددة من الحيوانات نفسها، دون الحاجة إلى التضحية بالحيوانات، مما يسمح للمحققين لمتابعة مسار طولي للمرض، فضلا عن دراسة مدة العلاج الآثار. وقد تم تطوير نموذج الماوس من مؤسسة تحدي الألفية على مدى عقود من قبل العديد من المحققين، ويجري في البداية على الكلاب beagle باستخدام scintigraphy planar، وتقنية التصوير النووي24الأبعاد ثنائية الأبعاد . تم تكييف هذه التقنية للاستخدام في الفئران بعد عقد من الزمان ، تليها التكيف مع التصوير SPECT بعد عقد من الزمان25،26. وكان تطوير هذه التقنية في نماذج الماوس تطورا رئيسيا في أهمية هذه التقنية، نظرا لتوافر نماذج متعددة من الماوس من الأمراض البشرية مثل PCD التي يتم فيها تغيير وظيفة الهدبي بشكل كبير. وقد تم تقييم مؤسسة تحدي الألفية في نماذج الماوس من denervation الرئة والمناعة، ولديه القدرة على أن تستخدم جنبا إلى جنب مع نماذج أخرى19،26. وقد أجريت دراسات القياس MCC في المرضى الذين يعانون من أمراض مجرى الهواء مثل CF, الربو, PCD, وciliopathies المرتبطة CHD, وقد أسفرت عن نتائج أن هذه التقنية يمكن أن تساعد على حد سواء دراسات فيزيولوجيا الرئة والفعالية العلاجية13.
جزء مهم من هذا البروتوكول هو إعداد عمليات الاستحواذ مع المعلمات التصوير الصحيح للحصول على صور دقيقة لتحديد كم. وهناك عدد من العوامل الرئيسية عند تصميم إعدادات اقتناء SPECT ، بما في ذلك التكريمات التي تستخدم ، وعدد التوقعات للحصول على كل ثورة ، وحجم الخطوة التناوب. اختيار ال Collimator هو عامل رئيسي في حساسية ودقة الاقتناء ، وقد تحتاج إعدادات الاكتساب إلى أن تكون مصممة خصيصًا للcollimator المستخدم27. بالتناوب، عند استخدام الحيوانات أكبر مثل الفئران، سوف تحتاج إلى تعديل collimators. الكولماتورس متعددة الثقب على سبيل المثال هي أكثر حساسية، ولكن ينبغي توخي الحذر عند اختيار حجم خطوة من أجل تجنب تداخل الإسقاطات والتسبب في تعدد غير مرغوب فيه، والتي يمكن أن تزيد من زيادة حساسية اقتناء على حساب بعض الغموض صورة التي يمكن أن تسبب القطع الأثرية إعادة الإعمار25. يعد إعداد إعادة الإعمار أيضًا مفتاحًا لإنشاء صور قابلة للقياس الكمي. MAP3D هو خوارزمية إعادة بناء متكررة شائعة الاستخدام، و PSF هو نموذج إعادة الإعمار الشائعة. كلاهما موثوق به لإعادة بناء الصور، ولكن يجب توخي الحذر عند تعيين عدد التكرارات و المجموعات الفرعية. زيادة عدد التكرارات زيادة الوقت الحسابي المطلوب لإعادة الإعمار، وزيادة نوعية إعادة الإعمار مع تناقص العوائد عند زيادة أخرى.
من أجل قياس الصور في ImageJ ، أداة القياس المثالية لاستخدام RawIntDen ، الذي يخرج قيمة مجموع بكسل في التحديد. عند قياس بيانات SPECT عبر مختلف أحجام الرئة ROIs، واستخدام RawIntDen يوفر مقياسا مطلقا من عدد ويتجنب ضبط القياس إلى منطقة العائد على الاستثمار، مثل القياس المتوسط من شأنهأن 21.
هذه التقنية لديها عدد من مصادر الخطأ المرتبطة التي ينبغي أن يكون المحقق على علم عند تطبيق هذه التقنية. ومن الحيرة البارزة هو استخدام وكلاء التخدير. ايزوفلوران هو سريع التمثيل، استنشاق مخدر أن الفئران استرداد من بسرعة بعد الانتهاء من عملية الاستحواذ. ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر لتزويد الفئران مع متسع من الوقت للتعافي في أقفاصها ، وليس أبقى تخدير أي أطول من اللازم. في تجربتنا الشخصية (البيانات غير المنشورة) الفئران التي تم الاحتفاظ بها تخدير مستمر باستخدام ايزوفلوران المستنشق بين 0 و 6 ساعة الوقت نقطة أظهرت إزالة لا تذكر. وبالمثل، فإن جرعة من المخدر خاضعة للرقابة ضرورية أيضا لضمان الشفاء السريع. عند تأمين الحيوان إلى البليت للتصوير، ينبغي أن تبقى أنبوب وهمية تستخدم للتسجيل المشترك منخفضة على المعدة لتجنب القطع الأثرية من تداخل مع الرئتين. وبالمثل، لضمان جودة صورة CT، الحرص على إزالة أي علامات معدنية من الماوس لتجنب القطع الأثرية من تشتت الأشعة السينية.
يمكن تطبيق بروتوكول مؤسسة تحدي الألفية الحالي على عدد لا يحصى من النماذج الحيوانية. هذه التقنية لها تأثير لا يذكر على صحة الحيوان الممسوحة ضوئيا، ويتم تحمل جيد من قبل الفئران، وبسبب هذا يمكن استخدامه مع نماذج المرض دون المخاطرة بصحة الفئران الحساسة بالفعل. قوة هذه المنهجية يأتي من كونها تقنية في vivo، والذي يسمح للحصول على قياسات متسقة وقابلة للتكرار من وظيفة مجرى الهواء دون التضحية من الحيوانات لاستخراج القصبات الهوائية لتصوير الفيديو المجهري، أن نماذج الجسم الحي السابق تتطلب26. إن اتساق هذه التقنية في إنتاج قياسات قابلة للتكرار عبر عمليات مسح متعددة لنفس الحيوانات، يسمح بمعاملة نفس الحيوان بعوامل مختلفة أو علاجات محتملة، ومقارنات إحصائية بين نفس الحيوان للحد من التقلبات البيولوجية الكامنة في أي نموذج حيواني، وبالتالي تقليل حجم العينة اللازم لإظهار الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية.
يمكن تعديل تقييم وظيفة مجرى الهواء باستخدام تقنية MCC وفقًا لمجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية وتطبيقه على العديد من النماذج المختلفة لصحة مجرى الهواء ، بالإضافة إلى اختبار علاجات جديدة. يمكن تقييم الخطوط الجوية لنماذج الماوس من PCD باستخدام هذه التقنية، وكذلك نماذج من الانسداد الرئوي الرئوي. ويمكن أيضا استخدام طريقتنا لدراسة الآثار التفاضلية لمختلف التخدير على MCC التي هي في الاستخدام السريري المشترك. وأخيراً، يمكن أيضاً تقييم آثار العوامل العلاجية على مجرى الهواء باستخدام هذا النموذج. كما ذكر سابقا ولكن يحمل التكرار، كما هو قياس في الجسم الحي فإنه يسمح لتكرار تقييمات MCC على مدى المرض، فضلا عن فوائد الاختبار من التدخلات العلاجية على مر الزمن. بالإضافة إلى ذلك، الفئران هي المختبر الأكثر شيوعا المستخدمة لتقليد / دراسة الأمراض البشرية، مع، في بعض الحالات، نماذج متعددة الماوس المعدلة وراثيا من الأمراض البشرية المتاحة للاختيار من بينها.

أهدا هي microtubule القائم على الأجهزة الخلوية المحفوظة عبر التاريخ التطوري من الطحالب إلى البشر. وهي تنبثق من أسطح الخلايا ولها عدد من الوظائف1، تتراوح من التعرف على الإشارات الحسية البيئية المحلية إلى الحركة ، والوظائف التي يمكن إرجاعها من البشر إلى الكائنات أحادية الخلية أحادية الخلية2،3. ويمكن أن تكون الإهداب غير مُلَلَّة وفردية تعمل كهوائي متخصص في الخلية لمعالجة الإشارات البيئية؛ أو العليل ومتعدد، الضرب في موجات متزامنة، ميتاكرونال لتوليد تدفق السوائل، مثل بطانة قناة فالوب والسلال العلوية والسفلية، باستثناء القصبات الطرفية المؤدية إلى الحويصلات الهوائية1،2.
يتعرض السطح الظهاري الواسع لجهاز التنفس لوابل مستمر من التلوث في شكل مجموعة متنوعة من الملوثات والمسببات المسببة للعدوى التي يمكن أن تكون خطرة، مما يستلزم الدفاع. آلية الدفاع الرئيسية هي الجهاز المخاطي لشجرة القصبة الهوائية ، حيث يتم نقل تدفق مستمر للمخاط المفرز ميكانيكيًا من مجرى الهواء عن طريق ضرب الإهداب المتحركة المتعددة التي تبطن الأسطح الطلية للخلايا الظهارية القصبية. هذه الوظيفة إلى الملوثات المستنشقة استنشاق، ومن خلال استمرارها، والضرب المتزامن، ونقلها cephalad4،5.
وقد ثبت أن الإهداب لها أدوار رئيسية مثل في تطوير النقش بين اليسار واليمين في تطوير الأجنة، حيث الأهداب في العقدة الجنينية كسر التماثل6. وقد تم ربط الطفرات في الجينات المرتبطة أهداب لأمراض مثل أمراض القلب الخلقية (CHD) بسبب الهيكل غير المتماثل للقلب6. وقد أفادت الدراسات الحديثة وجود نسبة عالية من الخلل في الجهاز التنفسي في الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من أمراض القلب و العقوبة القلبية، فضلا عن زيادة انتشار مضاعفات الجهاز التنفسي بعد العملية والأعراض المزمنة في الجهاز التنفسي في الشعب الهوائية العليا والسفلى7,8,9,10. المرضى الذين يعانون من مرض الاضطرابات التنفسية الحادة والخلل الوظيفي، مع أو بدون heterotaxy، وقد ثبت أن لديها زيادة خطر مضاعفات الجهاز التنفسي والنتائج السلبية في الجهاز التنفسي بعد العمليةالجراحية 5,8,10. وإلى جانب أدوارها في الإشارات والتنمية، فإن أهمية أهداب الهواء قد تجلت من خلال اعتلالات الطرق الهوائية، التي من الأمثلة الرئيسية على ذلك خلل التنسيل الأولي. PCD هو اضطراب خلقي ناتج عن عدد من الطفرات التي تؤثر على أهداب الجهاز التنفسي المتحرك ، مما يؤدي إلى التهابات الرئة المتكررة ، والتهاب القصبات ، وربما الحاجة إلى زرع الرئة11. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن أهداب طبيعية في التليف الكيسي (CF)، الاضطرابات الخلقية الأكثر شيوعا في السكان القوقازيين، MCC هو ضعف بسبب سميكة، والمخاط اللزج الناتجة عن الطفرات في الجينات CFTR12. هناك نماذج متعددة من الماوس من PCD وCF، فضلا عن عدد متزايد من نماذج CHD. في نهاية المطاف أهداب هي هياكل متعددة مع العديد من الأدوار الرئيسية، وطريقة لتقييم وظيفة الأهداب الجهاز التنفسي في الجسم الحي يمكن أن تكون ذات قيمة للدراسة قبل السريرية، وتقييم آثار الطفرات وكذلك الأدوية على إزالة المخاطية (MCC)13. وستكون هذه الطريقة أيضاً قيّمة في تقييم آثار الأدوية الجديدة أو العلاج الجيني أو التدخلات على مركز تحدي الألفية في نماذج الماوس هذه.
هناك العديد من النماذج المختلفة التي تم استخدامها لتقييم مؤسسة تحدي الألفية. أحد الطرق البارزة ينطوي على استخدام الصبغة الزرقاء الميثيلين التي تم غرسها في قصبات، مع إزالة تقاس قياس الألياف لحركةصبغ 14. هذه الطريقة محدودة من خلال القدرة على مراقبة حركة الصبغة ، والتي هي أكثر روتينية في البشر مما كانت عليه في نماذج الماوس قبل السريرية. طريقة بارزة أخرى هي التصوير بالأشعة السينية على النقيض من الطور السنكروترون (PCXI) ، والتي يمكن استخدامها لتتبع الجسيمات الفردية في مجرى الهواء. هذا الأسلوب هو جديد نسبيا وليس من الممكن الوصول15. هناك العديد من الطرق السابقة vivo لتقييم مجرى الهواء عن طريق استئصال القصبة الهوائية لتصوير الفيديو، ولكن هذه النماذج توفر فائدة تذكر في المرضى الإنسان16. تقنيات عالية الدقة للتصوير أهداب مثل التصوير المقطعي التناسق البصري محدودة بنفس الطريقة17.
في هذه المقالة، نقدم طريقة استنساخها لقياس MCC في الجسم الحي الذي تم استخدامه لقياس عمليات إزالة الرئة في نماذج حيوانية لا تعد ولا تحصى، وكذلك دراسة مؤسسة تحدي الألفية في مرض الانسداد الرئوي المزمن وتقييم آثار الأدوية المثبطة للمناعة18،19. هذه الطريقة تتعقب إزالة المستحضرات الصيدلانية الإشعاعية 99mالتكنيتيوم والكبريت الغروانية(99mTc-Sc)، وهو جهاز جسيمات غير قابل للذوبان، بعد تقطير في الرئتين. ويمكن بعد ذلك تعقب النويدات المشعة باستخدام الفوتون واحد الانبعاثات التصوير المقطعي المحسوبة (SPECT)18،20. لقد قمنا بزيادة صقل هذه التقنية لقياس MCC باستخدام تقنية مزدوجة SPECT والتصوير المقطعي المحوسب (CT) مع التعريب المشترك لأحصاء النظائر المشعة إلى الرئتين وقياس الانخفاض في هذه العد على مدى 6 ساعات. التصوير المزدوج الطريقة، مع التسجيل المشترك للصور CT وSPECT يسمح بتعريب دقيق من تعداد الإشعاع إلى منطقتنا من الاهتمام، الرئتين. على الرغم من أننا وصفنا بالتفصيل طريقة قياس MCC في الفئران ، يمكن تعديل البروتوكول لدراسة MCC في الفئران. سوف تحتاج إلى تعديل collimators فضلا عن جرعة الإشعاع. في رأينا ، فإن مسح الماوس MCC أكثر صعوبة من الناحية الفنية بسبب صغر حجم الحيوان ، ولكنه أكثر فائدة من الفئران بسبب العدد الكبير من نماذج الماوس الراسخة لعدد من الاضطرابات البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لانخفاض تكلفتها وتكلفة صيانتها في مستعمرات الحيوانات ، فإن حجم العينة الأكبر هو أكثر جدوى في الفئران.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

الأهداب المتحركة التنفسية، العضيات المتخصصة في الخلية، خط سطح الظهارية للخلايا الظهارية بطانة الجهاز التنفسي. من خلال الضرب بطريقة الميثاكرونا، المتزامن، هذه العضيات المتعددة، المتحركة، القائمة على actin تولد تدفق سائل سيبالاد تطهير الجهاز التنفسي من الملوثات المستنشقة ومسببات الأمراض. مع زيادة التلوث البيئي، ومسببات الأمراض الفيروسية الجديدة والبكتيريا الناشئة المقاومة للأدوية المتعددة، أهداب ولدت إزالة المخاطية (MCC) أمر ضروري للحفاظ على صحة الرئة. كما تعاني مؤسسة تحدي الألفية من الاكتئاب في العديد من الاضطرابات الخلقية مثل خلل التنسج الأولي والتليف الكيسي وكذلك الاضطرابات المكتسبة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن. وقد أنشأت كل هذه الاضطرابات، في بعض الحالات نماذج متعددة، الماوس. في هذا المنشور، نحن بالتفصيل طريقة باستخدام كمية صغيرة من النشاط الإشعاعي والطرائق المزدوجة SPECT / التصوير المقطعي لقياس بدقة وتكرار قياس MCC في الفئران في الجسم الحي. تسمح هذه الطريقة باسترداد الفئران بعد التصوير ، مما يجعل القياسات التسلسلية ممكنة ، واختبار العلاجات المحتملة طولياً مع مرور الوقت. وتوضح البيانات في الفئران البرية إمكانية استنساخ قياس مؤسسة تحدي الألفية ما دام يتم إيلاء الاهتمام الكافي بالتفاصيل، والالتزام الصارم بالبروتوكول.

باستخدام هذا البروتوكول، نحن الفئران تخدير في غرفة isoflurane (الشكل 1A). بعد تحقيق مستوى كاف من التخدير، وضعت الفئران على دعامات عمودية (الشكل 1B) وتخيلت الحبال الصوتية باستخدام سلك دليل مضيئة (الشكل 1C-1D). تم تقطير الفئران وغرست مع 0.2 mCi 99mTC-Sc في مجلدات من 10 ميكرولتر من خلال قنية والفئران يسمح لها بالاستنشاق تلقائيا في الرئتين (الشكل 1E-1F). بعد الحصول على الصور ومعالجتها ، تم كولوكاليد الصور CT و SPECT (الشكل 2A) باستخدام أنبوب وهمي كمعلم (الشكل 2B). تم توليد أقنعة الرئتين من صورة CT(الشكل 2C)واستخدمت لرسم ROIs حول الرئة اليمنى للتحليل في 0 (الشكل 2D) و 6 ساعات (الشكل 2E-2F). لاختبار إعادة إنتاج البروتوكول، تم مسح ما مجموعه 8 فئران مرتين في أيام مختلفة مع ظروف تجريبية متطابقة، مع تحليل باستخدام اختبار t الاقتران تظهر لا فرق كبير بين عمليات المسح المتكرر (p-value=0.9904) (الشكل 3A). تم مسح 2 ماوس إضافية ثلاث مرات في أيام مختلفة مع ظروف تجريبية متطابقة ، مع تحليل باستخدام ANOVA في اتجاه واحد يظهر مطابقة كبيرة بين عمليات المسح المتكرر (قيمة p 0.0041) (الشكل 3B). تم مسح ما مجموعه 8 فئران وتم عرض صورتين تمثيليتين(الشكل 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> الشكل 1: الزرع الماوس وغرس النظائر. صور للخطوات اللازمة لتلقين النظائر وغرسها في مجرى الهواء. A)يتم تخدير الماوس في غرفة. ب) يتم وضع الماوس المُجَدَّد على دعم رأسي، معلّق من قِبل المُقَدّر الأمامي. ج) يتم إعداد سلك ألياف ضوئية مضاءة 0.5 مم بمثابة سلك دليل من خلال تشغيله من خلال قنية 20 غ. D)يتم فتح فم الماوس باستخدام ملقط ومضاءة باستخدام أسلاك المرشد المضاءة لتصور الحبال الصوتية. E)يتم دفع القنية عبر الحبال الصوتية ويتم إزالة سلك الدليل. و) يتم غرس النظائر القابلة للذوبان في القنية باستخدام ماصة والفأر المسموح به لاستنشاق النظائر تلقائياً في الرئتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> الشكل 2: صور SPECT/CT لمسح MCC. A)صورة SPECT تم ترجمتها بشكل مشترك مع صورة CT. ب) صورة CT مع أنبوب وهمي مرئي تم استخدامه للتوطين المشترك. C) قناع مجرى الهواء مشتق من خلال تحجيم صورة CT وإجراء إسقاط مجموع الرزمة z. D)قناع CT شارك في ترجمة مع صورة SPECT. وقد تم رسم عائد الاستثمار للتحليل حول الرئة اليمنى. ه) قناع مجرى الهواء في 6 ساعات. F)صورة مقطعية مقطعية وSPECT مترجمة مشتركًا للمجرى الهوائي في 6 ساعات مع عائد الاستثمار للتحليل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> الشكل 3: قياسات إزالة نفس الفئران عبر عمليات مسح متعددة. A)تم قياس اثنين من إزالة تكرار الفردية ل 8 فئران مع عدم وجود تغييرات في الظروف التجريبية. وأظهر اختبار t المقترن أنه لم يكن هناك فرق كبير بين عمليات المسح المتكررة بقيمة p 0.9904. ب) تم قياس ثلاثة مقاصات تكرار فردية لاثنين من الفئران دون أي تغييرات في الظروف التجريبية. وأظهر ANOVA ذات اتجاه واحد أن هناك تطابق كبير بين عمليات المسح المتكررة بقيمة p 0.0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> الشكل 4: صور SPECT/CT ذات الطابع المحلي المشترك للمجرى الهوائي لمدة 0 و 6 ساعات في 2 فئران مع ROIs مرسومة في 0 و 6 ساعات تحدد الرئة اليمنى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تكميلية الشكل 1: شريط فيديو من الحبال الصوتية مضيئة بواسطة سلك الألياف البصرية مع تأثير التنفس تصور. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
ملفات تكميلية. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice at JoVE.com

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

في هذا المنشور، نحن وصف بروتوكولات لتقييم إزالة مخاطية مجرى الهواء (MCC) في الفئران في الجسم الحي باستخدام طريقة مزدوجة النويدات المشعة التصوير. تم تصميم هذا البروتوكول لانبعاثات الفوتون واحد التصوير المقطعي (SPECT) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) بروتوكول اقتناء باستخدام الماوس كله الجسم (MWB) collimators في نظام مزدوج SPECT / CT.

في تقييم vivo من إزالة المخاطية في الفئران

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.2K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. في هذا المنشور، نحن وصف بروتوكولات لتقييم إزالة مخاطية مجرى الهواء (MCC) في الفئران في الجسم الحي باستخدام طريقة مزدوجة النويدات المشعة التصوير. تم تصميم هذا البروتوكول لانبعاثات الفوتون واحد التصوير المقطعي (SPECT) والتصوير المقطعي المحوسب (CT) بروتوكول اقتناء باست...

Video: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

أداء الغسل المهبلي، كريستال تلوين بنفسجي، والتقييم النسيجية المهبلية لتحديد دورة دقي الماوس التدريج

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

تقييم ميكانيكا الجهاز التنفسي في الفئران باستخدام تقنية التذبذب القسري

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

تقييم وظيفة عضلة من العضلات الباسطة لأصابع الطويلة<em&gt; خارج الجسم</em&gt; العضلات الظنبوبي الأمامي و<em&gt; في الموقع</em&gt; في الفئران

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...