ونشكر أعضاء شعبة العلوم الجينوم ومختبر لنظم علم الأحياء والطب، ركاست، جامعة طوكيو. لا سيما ونحن نشكر الدكتور H. أبوراتاني، كوداما ت. د.، (لسبم، ركاست، وجامعة طوكيو)، الدكتور ك. توميزوكا ويوشيدا ت. د. د. أ كونيساتو (هاكو كيووا كيرين Co., Ltd.) لإجراء مناقشات مفيدة والدعم. هذا العمل جزئيا وأيده معونات للشباب عالم (A) (26710005، ل)، معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (ح 01567، ل 26116711 و 16)، ومعونات للتحدي البحوث الاستكشافية (16 14605 ك، ل) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا من اليابان ومؤسسة العلوم وتاكيدا (ل)، ومؤسسة كوباياشي لأبحاث السرطان (ل) والمشروع لبحوث السرطان و تطور العلاجية (ف--إنشاء) والبحث العملي لمكافحة السرطان مبتكرة من وكالة اليابان للبحوث الطبية والتنمية، AMED (ل).

1-إعداد الحمضية الثقافة المتوسطة
<ol><li>
إعداد التحكم (درجة الحموضة 7.4) والمتوسطة الثقافة المنخفضة-الرقم الهيدروجيني (pH 6.8)
	<ol>
<li>حل ز 4.75 مسحوق دميم دون لام الجلوتامين في 500 مل الماء.</li>
		<li>إعداد الحل3 ناكو م 0.33 في زجاجة ضغط ضيق. تنبيه: من المهم استخدام زجاجة ضيق ضغط منذ ناكو3 تنبعث CO2 الغاز عند تسخينها وتتحلل حرارياً.</li>
		<li>اﻷوتوكﻻف المتوسطة والحل. تسمح هذه المخازن المؤقتة لتبريد إلى 25 درجة مئوية.</li>
		<li>إضافة 5 مل من 200 ملم ل الجلوتامين، 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين، و 50 مل مصل البقري الجنين إلى 500 مل دميم دون بيكربونات.</li>
		<li>للتحكم (درجة الحموضة 7.4) المتوسطة، إضافة 2.4 مل م 0.33 ناكو3 حل كل 100 مل دميم دون بيكربونات. للمتوسطة والمنخفضة-الرقم الهيدروجيني (pH 6.8)، إضافة 0.6 مل م 0.33 NaHCO3 حل كل 100 مل دميم دون بيكربونات.</li>
		<li>فحص درجة الحموضة المتوسطة بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2. ملاحظة: مقدار NaHCO3 الحل يحتاج إلى تعديلها اعتماداً على درجة الحموضة متوسطة الحجم، التي يمكن أن تختلف تبعاً لمحتوى2 CO حاضنة والضغط الجوي. ومن الناحية المثالية، للمرة الأولى، فمن الأفضل لقياس درجة الحموضة متوسطة مع تركيزات بيكربونات المختلفة لتحديد المبلغ المناسب لحل3 ناكو إضافة إلى دميم.<ol>
<li>جمع الثقافة المتوسطة فورا بعد إزالة الطبق الثقافة من حاضنة2 CO وقياس درجة الحموضة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. الحفاظ على درجة حرارة متوسطة في 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي إذا لزم الأمر. قياس درجة الحموضة متوسطة ثلاث مرات بشكل مستقل. ملاحظة: يجب أن يتم تخزين ناكو3 الحل عند 4 درجة مئوية وكل وسائل الإعلام ينبغي أن يكون طازج. يتم سرد المنتجات المتاحة تجارياً التي يمكن استخدامها في هذه الدراسة في الجدول للمواد.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد متوسطة الثقافة الحمضية الناجمة عن لاكتات أو بفعل HCl
	<ol>
<li>إضافة ميليلتر 74 من حل لاكتات أو 125 ميليلتر من 1 M HCl إلى 100 مل من التحكم المتوسطة (أعد الخطوة 1.1.5).</li>
		<li>فحص درجة الحموضة المتوسطة بعد 24 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2. ملاحظة: مقدار لاكتات أو حل HCl يحتاج أيضا إلى تعديلها وفقا لدرجة الحموضة متوسطة الحجم، التي يمكن أن تختلف تبعاً لمحتوى2 CO في حاضنة والضغط الجوي. ومن الناحية المثالية، فمن الأفضل لقياس pH متوسطة مع لاكتات المسلسل أو تركيزات HCl لتحديد المبلغ المناسب للتكيف مع درجة الحموضة المطلوبة من المتوسط.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-حصاد وعلاج الخلايا
<ol><li>البدء في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 1 أسبوع على الأقل قبل إجراء التجارب. ملاحظة: يتم سرد خطوط الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول للمواد.</li>
	<li>مرور الخلايا عندما تصل إلى كونفلوينسي 70-90%. لا تسمح للخلايا لتصبح متكدسة. تغيير في المتوسط كل 2-3 أيام أثناء زراعة اليومية.</li>
	<li>غسل الخلايا بإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني، وإضافة فصل الإنزيم مثل 1 مل التربسين.</li>
	<li>احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم تقريب الخلايا وبدء فصل.</li>
	<li>إضافة 5 مل من الثقافة المتوسطة إلى خلايا منفصلة وإلغاء تنشيط الإنزيم. نقل تعليق خلية الأنبوبة 15 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 300 x زاي Aspirate المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا مع الثقافة المتوسطة.</li>
	<li>عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق.</li>
	<li>بذور 5.0 × 105 خلايا/بئر طبق 10 سم في 10 مل متوسطة. احتضان الخلايا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.</li>
	<li>نضح المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مع 5 مل برنامج تلفزيوني، وإضافة 10 مل المتوسطة الثقافة الحمضية أعدت في الباب 1. احتضان الخلايا عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5% CO2.</li>
</ol>3. عزل الحمض النووي الريبي
<ol><li>نضح المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مع 5 مل برنامج تلفزيوني. تعطيل الخلايا بإضافة كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجداول من المواد).</li>
	<li>كشط الطبق بإيجاز، ثم إزالة الكاشف استخراج الحمض النووي الريبي مع ماصة وإيداع رنا الاستخراج الكاشف/الخلية في أنبوب 1.5 مل. تترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إضافة 250 ميليلتر كلوروفورم ويهز الأنبوب بقوة لترك حوالي 15 س. في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في إيه إيت، 000 x ز لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>بعناية إزالة المرحلة المائية باستخدام ماصة. تترك وراءها بعض المرحلة مائي. ضع في أنبوب 1.5 مل آخر.</li>
	<li>إضافة 550 ميليلتر الايزوبروبانول إلى مرحلة مائي وتخلط برفق. تترك في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي بالسرعة القصوى (إيه تو زيرو، 000 x ز) لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>صب قبالة الكحول وإضافة 1 مل 75 ٪ إيثانول في ديبك المياه المعالجة. المزيج بلطف. الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>"الماصة؛" قبالة الإيثانول واسمحوا أيردري الكريات.</li>
	<li>إضافة حوالي 15-25 ميليلتر (اعتماداً على حصيلة) من ديبك المياه المعالجة لبيليه الجيش الملكي النيبالي. مزيج دقيق.</li>
	<li>قياس تركيز الحمض النووي الريبي معزولة عن طريق قياس التوجيه التشغيلي في 260 نيوتن متر باستخدام جهاز المطياف الضوئي.</li>
</ol>4-كدنا التوليف
<ol><li>الجمع بين المكونات التالية في أنبوب تفاعل PCR: يصل إلى 5 ميكروغرام مجموع الجيش الملكي النيبالي، 1 ميليلتر اليغو ديناراً (50 ميكرومتر) أو "عشوائي التمهيدي مزيج" (60 ميكرومتر)، 1 دنتب ملم 10 ميليلتر، والمياه خالية من نوكلاس إلى إجمالي حجم 14 ميليلتر.</li>
	<li>خلط وإيجاز الطرد المركزي المكونات باستخدام الطرد مركزي benchtop صغيرة (~ 5 s). تؤذي العينة من الحمض النووي الريبي/التمهيدي لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. تدور بإيجاز (~ 5 s) من benchtop صغيرة باستخدام الطرد المركزي ووضع العينة على الفور على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.</li>
	<li>أضف المكونات التالية: ميليلتر 4 5 x "عكس النسخ" الاحتياطي، 1 ميليلتر المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر)، 1 ميليلتر "رناسي المانع" (40 ش/ميليلتر). ملاحظة: يتم عرض أمثلة لمجموعات المتاحة تجارياً في الجدول للمواد
</li>
	<li>كاب الأنبوب، مزيج، وثم الطرد المركزي بإيجاز محتويات الطرد مركزي benchtop صغيرة استخدام (~ 5 s). احتضان الخليط رد فعل مجتمعة في 50-55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إلغاء تنشيط رد الفعل التي تفرخ في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
</ol>5-قياس التعبير الجيني المراعية لحمض باستخدام PCR الوقت الحقيقي
<ol><li>الجمع بين المكونات التالية في لوحة رد فعل جيدا 384: 1 ميليلتر قالب كدنا، 0.75 ميليلتر 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine، 0.3 ميليلتر 50 ميكرون إلى الأمام التمهيدي، عكس ميليلتر 0.3 50 ميكرومتر التمهيدي، 1 ميليلتر [تق] [بولمرس]، 2.5 ميليلتر 10 x [تق] [بولمرس] المخزن المؤقت، 2.5 دنتب مم 20 ميليلتر، المياه 16.65 ميليلتر. ملاحظة: يبين الجدول للموادمثال لمجموعات المتاحة تجارياً. ويرد في الجدول 1قائمة بأجهزة الإشعال. يمكن استخدام لوحة رد 96-جيدا أيضا في هذه الخطوة. يمكن أيضا استخدام المجسات الأخرى (مثلاً، مسبار Taqman).</li>
	<li>قم بإعداد التجربة والبرنامج بكر التالية على "نظام PCR الوقت الحقيقي": 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، دورة 1؛ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورة 1؛ 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، دورات 40؛ 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، دورة 1؛ 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، دورة 1؛ 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 1 دورة.</li>
	<li>ضع اللوحة في الصك qPCR. بدء تشغيل البرنامج. ملاحظة: أن Upregulation الجينات استجابة الأس الهيدروجيني MSMO1و INSIG1و IDI1 يمكن أن يقاس بمستويات البروتين.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

صاحب البلاغ Ayano كوندو موظف كيووا هاكو كيرين المحدودة

هنا، يمكننا وصف نظام ثقافة الأس الهيدروجيني حمضية بسيطة وعملية التقييم. أن الجمع بين الطرق الثلاث تحمض المتوسط، أي، بيكربونات انخفاض التركيز وإضافة لاكتات، وإضافة HCl، أتاح لنا للتحقيق الدقيق في إليه الاستجابة للأس الهيدروجيني ومقارنة الاستجابة الخلوية للورم الأخرى ميكرونفيرونمين?...

وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم وسرطان الخلية الأيض1،،من23. الخلايا السرطانية غالباً ما يتعرضون لظروف مثل نقص والحرمان المغذيات، ودرجة الحموضة خارج الخلية الحمضية (pHe). ومع ذلك، دور الفنيل ألانين في تطور الورم لم يتضح على نطاق واسع كما هو الحال في المجاعة نقص أو المغذيات. يمكن أن تصبح pHe في أنسجة الورم الحمضية، تصل إلى حوالي الأس الهيدروجيني 6.84،5. ينبع الهيدروجيني الحمضية من إفراز جليكوليتيك الهوائية واللاهوائية للبروتونات (H+) ولاكتات بالسرطان تكاثر الخلايا5،6.
وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن هستون الحمضية الناجمة عن الفنيل ألانين ديسيتيليشن، وأكسدة الأحماض الدهنية، والرقابة من lysosomes الحمضية للتكيف للبيئة الحمضية الشديدة7،،من89،10. ومع ذلك، يؤثر الآليات عن طريق التي تحمض خارج الخلية سلوك السرطان وهوية مفتاح المنظمين في الأس الهيدروجيني الحمضية وورم المكروية لم تحدد تماما. وعلاوة على ذلك، وصفت عدة تقارير مختلف وسائل الإعلام الأس الهيدروجيني الحمضية باستخدام تركيزات غير واضحة بيكربونات والمخزن المؤقت تريس، والأنابيب، وحبيس أو لاكتات و HCl، ولكن هناك تقارير قليلة تثبت استقرار المعدل المتوسط ولا شاملة مقارنة بين عدة وسائط الثقافة الحمضية متميزة7،،8،9،10
لتوضيح أن المنظمين الرئيسيين والتغيرات الأيضية في الخلايا السرطانية في سياق تحمض خارج الخلية، إنشاء نموذج ثقافة بسيطة في المختبر للحفاظ على الفنيل ألانين حمضية، وبحث دور الفنيل ألانين في خلايا السرطان11. باستخدام هذا الأسلوب، حافظنا على وسيط الثقافة حمضية مع pHe 6.8 في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2، استخدام بيكربونات خفض تركيزات في الأجلين المتوسط والثقافة. الأس الهيدروجيني 7.4 استخدمت كالمعتاد والتحكم في المتوسط. تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل درجة الحموضة المتوسطة وانخفضت تدريجيا من ح 72 خلال ثقافة خلايا سرطان البنكرياس PANC-1 و AsPC-1. نظراً لتسارع تحلل تعزيز إفراز البروتونات ليس فقط ولكن أيضا لاكتات7،،من89، أنشأنا أيضا ثقافة أسلوب محاكاة الحماض لاكتات المستحثة بإضافة لاكتات بدلاً من خفض تركيز بيكربونات. بالإضافة إلى ذلك، pHe الحمضية الناجمة عن HCl على المديين المتوسط ويسمح لنا باستبعاد إمكانية أن الاستجابات الخلوية للأس الهيدروجيني الحمضية الثقافة المتوسطة ليست نتيجة لانخفاض تركيز بيكربونات. وعلاوة على ذلك، باستخدام وسائل الإعلام المختلفة مع الرقم الهيدروجيني من 6.4 إلى 7.4 مع تركيز بيكربونات مختلفة، يمكننا تقييم مدى الآثار الفنيل ألانين في الاستجابات الخلوية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

شروط وورم المكروية، مثل نقص أو المجاعة المغذيات، تلعب أدواراً حاسمة في تطور السرطان والأورام الخبيثة. ومع ذلك، دور الأس الهيدروجيني خارج الخلية الحمضية في عدوانية الورم وآليتها الأساسية لا على نطاق واسع درست مقارنة بظروف المجاعة التاكسج أو المغذيات. وبالإضافة إلى ذلك، لم تبلغ تماما أسلوب ثقافة محددة تحديداً جيدا لتقليد خارج الخلية الحمضية وورم المكروية.
نقدم هنا طريقة بسيطة في المختبر ثقافة للحفاظ على درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية باستخدام تخفيض بيكربونات وزيادة لاكتات أو تركيزات HCl على المديين المتوسط والثقافة. الهيدروجيني المتوسط تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل وتدريجيا بنسبة 72 ح أثر الثقافة PANC-1 و AsPC-1 خلايا سرطان البنكرياس. ثلاثة شروط متميزة الوسائط الحمضية في هذه الدراسة العالية upregulated الجينات المراعية للحموضة مثل MSMO1، INSIG1، و IDI1 مقارنة بنقص أو المجاعة المغذيات. يمكن استخدام أوبريجوليشن لهذه الجينات كعلامة على درجة الحموضة الحمضية. هذه التقنيات البسيطة مفيدة توضيح الآليات الكامنة للورم الخبيث تحت الحمضية وورم المكروية. ولذلك، يمكن اكتشاف الاستجابات الخلوية الأس الهيدروجيني الحمضية ليس فقط في الخلايا السرطانية ولكن أيضا في الخلايا الأولية مثل الخلايا الأنبوبي الكلوي، بالنسبة حمضية الاضطرابات الأخرى بما في ذلك، ketoacidosis السكري، من نظامنا الثقافة الأس الهيدروجيني الحمضية خارج الخلية الحماض اللبن والحماض الأنبوبي الكلوي الحماض التنفسي.

لتحديد تركيز بيكربونات المناسبة، أعد دميم في النطاق من 0-8 مم NaHCO3 (تركيز النهائي في الأجلين المتوسط والثقافة)، ونجح في إعداد وسائط الثقافة مع الأس الهيدروجيني يتراوح من 6.4-7.4 (الشكل 1). ونحن على استعداد دميم مع 8 مم ناكو3 (الرقم الهيدروجيني 7.4) كعنصر...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System at JoVE.com

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

الحمضية وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم. لتقييم آثار حمضية pH خارج الخلية في سرطان الخلايا في المختبر، قمنا بإنشاء نظم الثقافة حمضية بسيطة.

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

SCIENTISTS IN ACTION

14.5K Views.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. الحمضية وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم. لتقييم آثار حمضية pH خارج الخلية في سرطان الخلايا في المختبر، قمنا بإنشاء نظم الثقافة حمضية بسيطة.

Video: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The plant hormone auxin rapidly stimulates cell elongation in young stems and similar tissues at least in part by an acid-growth mechanism 2, 3. Auxin activates a H+ pump in the plasma membrane, causing acidification of the cell wall solution. Wall acidification activates expansins, which are endogenous cell wall-loosening proteins 4, causing the cell wall to yield to the wall tensions created by cell turgor pressure. As a result, the cell begins to enlarge rapidly. This 'acid growth' phenomenon is readily measured in isolated (nonliving) cell wall specimens. The ability of cell walls to undergo acid-induced extension is not simply the result of the structural arrangement of the cell wall polysaccharides (e.g. pectins), but depends on the activity of expansins 5. Expansins do not have any known enzymatic activity and the only way to assay for expansin activity is to measure their induction of cell wall extension. This video report details the sources and preparation techniques for obtaining suitable wall materials for expansin assays and goes on to show acid-induced extension and expansin-induced extension of wall samples prepared from growing cucumber hypocotyls.
 To obtain suitable cell wall samples, cucumber seedlings are grown in the dark, the hypocotyls are cut and frozen at -80 &deg;C. Frozen hypocotyls are abraded, flattened, and then clamped at constant tension in a special cuvette for extensometer measurements. To measure acid-induced extension, the walls are initially buffered at neutral pH, resulting in low activity of expansins that are components of the native cell walls. Upon buffer exchange to acidic pH, expansins are activated and the cell walls extend rapidly. We also demonstrate expansin activity in a reconstitution assay. For this part, we use a brief heat treatment to denature the native expansins in the cell wall samples. These inactivated cell walls do not extend even in acidic buffer, but addition of expansins to the cell walls rapidly restores their ability to extend.

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

We demonstrate the use of a constant-force extensometer to measure long-term extension (creep) of plant cell wall specimens induced by acidic buffers and expansin protein.

قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

و السابقين البيضة الثقافة الأجنة النظام الدجاج مناسبة للتطبيقات التصوير والجراحة المجهرية

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

الطريقة الثقافة القوارض باستخدام الأجنة الجامع للثقافة الدوار زجاجة من نوع النظام

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

و<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

إنشاء ثقافة الاستنساخ من الطحالب التصريف أحادي الخلية

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

قياس التقاء iPSCs باستخدام نظام التصوير الآلي.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

تعزيز عزل الحويصلات البكتيرية خارج الخلية للميكروبات متعددة الأوميكس

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

تسليط الضوء على المؤلف: تسريع البحث حول فصل الحويصلات البكتيرية خارج الخلية وعدم التجانس 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.