وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية ودولة جنيف.

مرة واحدة يتم تجميعها في SCBA، ويتم رصد نمو الأجنة على مدى عدة أيام. لذلك، قبل إجراء تشريح البذور والتجمع من SCBA، ويحتاج المرء لتعقيم البذور لتجنب التلوث المستقبلية التي يمكن أن تحول دون التقييم السليم لتأثير المواد معطف البذور على النمو الجنيني. 1. تعقيم البذور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 50-60 ميكرولتر من البذور نبات الأرابيدوبسيس ناضجة وجافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإعداد محلول الإيثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الايثانول 70٪ الحل في أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على البذور ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 1،200 دورة في الدقيقة في vortexer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي أنبوب microcentrifuge لمدة 3 ثانية في 4000 x ج لتركيز البذور في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل الايثانول 70٪ باستخدام فراغ شفط غيض ترك بعناية البذور في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الماء المقطر المعقم لر<html> وقال انه لا يزال أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 1،200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي أنبوب microcentrifuge لمدة 3 ثانية في 4000 x ج لتركيز البذور في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح طاف المياه باستخدام فراغ شفط غيض ترك بعناية البذور في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الماء المقطر الماء المعقم إلى أنبوب microcentrifuge لا تزال تحتوي على البذور. ضمان تدفق المياه تعلق متجانس البذور داخل الأنبوب. والهدف هنا هو لتجنب المزيد من الهز وذلك للحفاظ على سلامة البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لندع البذور يستقر عن طريق الجاذبية في الجزء السفلي من الأنبوب من خلال ترك الأنبوب لا يزال لمدة 30 ثانية. نضح طاف المياه باستخدام فراغ شفط غيض ترك بعناية البذور في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من أربع مرات 1،8-1،9. عموما إجراء التعقيم يستغرق حوالي 30 دقيقة. </li></ol> 2. البذور تصفيح ontent &quot;&gt; يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي للحفاظ على ظروف معقمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة طبق بتري (100 مم، 20 مم الارتفاع) تحتوي على 30 مل من الإنبات المتوسطة بواسطة التعقيم محلول يحتوي على 4.3 غرام / لتر Murashige وسكوغ المتوسطة في 2.5 ملم 2 إعداد - (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES-KOH ؛ درجة الحموضة 5.7) و 0.8 غرام / لتر أجار. السماح للحل يبرد في حمام مائي 50 ° C قبل صب على لوحة طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى الأنبوب الذي يحتوي على البذور. resuspend والبذور ونقلها على سطح متوسطة الإنبات باستخدام ماصة القياسية مع تلميح 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المياه المحيطة البذور على سطح متوسطة الإنبات باستخدام تلميح شفط فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مغادرة طبق بتري تحتوي البذور دون غطاء لها داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي لمدة 2 ساعة لمزيد من التجفيف. إغلاق طبق بتري مع غطاء والسماح لها الوقوف تحت الصفحيتتدفق مجلس الوزراء لمدة 90 دقيقة بحيث مرت حوالي 4 ساعة منذ الشروع في إجراء التعقيم البذور (الخطوة 1.2). </li></ol> 3. تشريح البذور الخطوات التالية تتطلب العمل مع stereomicroscope وضعت داخل مجلس الوزراء غطاء تدفق الصفحي. A دومون ملقط # 5 مع اقتطاع (أي حادة) نصائح يسهل كثيرا التعامل مع بذور (الشكل 1A). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق بيتري لوحة جديدة تحتوي على 30 مل من الإنبات المتوسطة. مكان على سطح المتوسطة اثنين جنبا إلى جنب العقيمة أوراق WHATMAN 3MM مستطيلة (1.5 سم × 1.0 سم؛ 1B الشكل، الخطوة 1). يتم تعقيمها WHATMAN 3MM رقة في الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البذور على أوراق WHATMAN 3MM باستخدام ملقط معقم (1B الشكل، الخطوة 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد البذور الفردية ضد الصحيفة WHATMAN 3MM عن طريق الضغط بلطف البذور باستخدام النصائح حادة جنبا إلى جنب من ملقط اقتطاع ( <stرونغ&gt; الشكل 1B، الخطوة 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غلاف البذرة (تيستا والسويداء) من البذور باستخدام إبرة حقنة (مثل U100 الأنسولين حقنة + 1 مل حقنة، 0.33 ملم (29 G) × 12.7 مم) (الشكل 1B، الخطوة 4). شكل بذور نبات الأرابيدوبسيس هو بيضاوي وينصح لخفض معطف البذور على طول أطول محور شبه الرئيسي أقرب ما يمكن إلى المكان حيث انضم إلى النبتات الجذير (أي بعيدا عن الطرف المتطرف). وهذا يساعد على إطلاق سراح آمن للجنين في الخطوة التالية من إجراء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع البذور ضد الصحيفة WHATMAN 3MM باستخدام النصائح حادة جنبا إلى جنب من ملقط اقتطاع (1B الشكل، الخطوة 5). هذه الخطوة يطلق الجنين من معطف البذور من خلال افتتاح بإنشائه في الخطوة 3.4 (1B الشكل، الخطوة 6). فمن المستحسن لتطبيق الضغط على البذور حيث غيض من النبتات هي في الأقرب إلى غيض من الجذير (أي بعيدا الابام افتتاح). </li></ol> 4. التجمع من معطف البذور الفراش الفحص (SCBA) انظر المناقشة لاختيار المناسب من عدد من المعاطف البذور والأجنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق بيتري لوحة جديدة تحتوي على 30 مل من الإنبات المتوسطة. مكان على سطح المتوسطة قطعة مستطيلة معقم (3.5 سم × 5.0 سم) من شبكة نايلون (الشكل 2، الخطوة 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الضرر والأجنة والمعاطف البذور يمكن نقلها إلى سطح حواف معدنية من ملقط من قبل دفعهم برفق باستخدام إبرة حقنة (الشكل 2، الخطوة 2). نقل الأجنة والمعاطف البذور على شبكة نايلون (الشكل 2، الخطوة 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع طبقة دائرية واحدة من المعاطف البذور باستخدام ملقط اضعافها والإبرة التأكد من أن البذور المعاطف هي في القرب كما أقرب وقت ممكن (الشكل 2، الخطوة 4). محاولة لكشف أكبر قدر ممكن من افتتاح معطف البذور الناتجة عنإبرة صعودا. لم يختبر هذه الخطوة بشكل منهجي. ومع ذلك، فإنه يمكن أن تزيد من كفاءة SCBA منذ يتوقع أن ينتشر مباشرة من نحو الجنين بدلا من ذلك بعيدا عن المواد إنتشاري تثبيط نمو الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة كما طبقة واحدة دائرية في وسط السرير معطف البذور تجميعها في الخطوة 4.3 (الشكل 2، الخطوة 5). ضمان أن الأجنة في القرب كما أقرب وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان SCBAs تحت ضوء مستمر (40 ميكرومول / م 2 ق EC) في 20-21 درجة مئوية. في حالة حيث يتم استخدام نبضة FR لاعتقال إنبات، تجميع SCBA تحت الضوء الطبيعي، وتطبيق نبض FR كما هو موضح 9 وترك طبق بتري في الظلام. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) الإجراء الموضح هنا هو من حيث المبدأ ينطبق على أي ظرف من الظروف حيث يتم حظر إنبات البذور نبات الأرابيدوبسيس (أو تأخر) والتي يشتبه السويداء لتنفيذ هذا الاعتقال. هذا الأخير يمكن أن يتضح من إزالة غلاف البذرة (تيستا والسويداء) وملاحظا أن ?...

في نبات الأرابيدوبسيس البذور الناضجة، ويتكون غلاف البذرة من تيستا، وهي الطبقة الخارجية من النسيج الميت من أصل الأمهات، والسويداء، وطبقة وحيدة الخلية من الأنسجة الحية التي تحيط مباشرة الجنين 1. وتستمد السويداء والجنين من الأحداث الإخصاب منفصلين: السويداء هو نسيج ثلاثي الصيغة الصبغية مع اثنين من الأم والأب واحد الجينوم في حين أن الجنين هو نسيج مضاعفا مع الأمهات واحدة واحدة الجينوم الأب 2. وتتمثل المهمة الرئيسية المسندة تقليديا إلى السويداء هو أن الأنسجة الغذائية. ومع ذلك، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن السويداء أيضا يلعب دورا مركزيا للسيطرة على إنبات البذور. أصبحت هذه الفكرة على ما يبدو لأول مرة في حالة السكون، وهي سمة التي أظهرتها البذور المنتجة حديثا. تفشل البذور لتنبت في سبات عميق رغم وجود ظروف إنبات مواتية. البذور تفقد السكون بهم بعد فترة النضوج وأصبحت nondormanر، أي أنها سوف تنبت عندما تتعرض لظروف إنبات مواتية. في كثير من الأنواع النباتية، بما في ذلك النباتات نبات الأرابيدوبسيس النموذج، يلزم معطف البذور على الاطلاق لمنع إنبات البذور نائمة منذ إزالة غلاف البذرة يؤدي النمو الجنيني وتخضير 3،4. في نبات الأرابيدوبسيس، بثك وآخرون. احظت أن الإنبات ظلت مكبوتة بعد إزالة تيستا مع الحفاظ على السويداء المحيطة السويداء 5. وأشارت هذه الملاحظات بشدة أن السويداء هو الأنسجة داخل غلاف البذرة تمارس النشاط القمعية على الجنين. ومع ذلك، وبذور التجارب إزالة معطف لا تساعد بالضرورة توضيح طبيعة النشاط القمعية التي تقدمها إنبات البذور معطف ولا تحديد الجينات التي تنفيذه. قدمنا ​​مؤخرا فحص البذور الفراش معطف (SCBA) حيث يتم فصل المعاطف البذور والأجنة جسديا لكنها أبقت في الدنو وثيقميتي بحيث يتم الحفاظ على النشاط القمعية الإنبات التي تقدمها السويداء 6. وSCBA يسمح باستخدام اندماجي من سبات، nondormant، والبذور المعدلة وراثيا معطف والمواد الجنينية. ونتيجة لذلك، فإن مسارات الوراثية السيطرة على الإنبات وتعمل تحديدا في السويداء والجنين يمكن تشريح. تم استخدام SCBA في سياق السكون لإظهار أن السويداء تطلق حمض الأبسيسيك هرمون نباتي (ABA) نحو الجنين لقمع نموها 6. وعلاوة على ذلك يمكن أن نستخدمها في SCBA لتحديد مسارات الإشارات التي تعمل في السويداء والأنسجة الجنينية لتعزيز السكون. وتم تعزيز دور السويداء للسيطرة على إنبات المزيد من خلال النظر في حالة البذور nondormant تتعرض لنبض أحمر بكثير (FR) الخفيفة. في وقت مبكر عند تشرب البذور يعرف نبضة الضوء FR لمنع إنبات 7،8. عندما أزيلت المعاطف البذور من بذور نبضة الضوء FRلم يستطع أن يمنع إنبات، يشير بقوة إلى أن السويداء ويمكن أيضا قمع إنبات البذور nondormant 9. بشكل ملحوظ، ويمكن أيضا أن تستخدم SCBA أن ألخص التي تعتمد على تثبيط إنبات FR. يسمح هذا لإظهار أن ذلك يعتمد-FR تثبيط إنبات البذور هو أيضا عملية تنطوي على الإفراج ABA من السويداء 9. وعلاوة على ذلك، سمحت SCBA تحديد مسارات مختلفة ضوء يشير الحكومية العاملة في السويداء والجنين للسيطرة على إنبات البذور nondormant استجابة لمنبهات ضوء 9،10. وبالتالي فإن SCBA يبدو أن تقنية موثوقة لاستكشاف وظيفة السويداء في سياق السيطرة على إنبات البذور. بل هو أيضا أداة قوية لتقييم ما إذا كانت الجينات في المختبر يشتبه في السيطرة على إنبات تعمل في السويداء، والجنين أو كليهما الأنسجة. نحن هنا بالتفصيل الخطوات المختلفة اللازمة لتجميع SCBA.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

يتكون السويداء نبات الأرابيدوبسيس من طبقة وحيدة الخلية المحيطة الجنين ناضجة ويلعب دورا أساسيا لمنع إنبات البذور نائمة أو أن البذور nondormant المشع من قبل الحمراء بعيدة (FR) نبض الضوء. من أجل مزيد من التبصر في الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء النشاط القمعية الإنبات بواسطة السويداء المبذولة، وقد وضعت &quot;البذور الفراش معطف&quot; مقايسة (SCBA). وSCBA هو إجراء تشريح فصل جسديا معاطف البذور والأجنة من البذور، والتي تسمح بمراقبة نمو الأجنة على طبقة الأساسية من المعاطف البذور. بشكل ملحوظ، وSCBA reconstitutes الأنشطة القمعية إنبات البذور معطف في سياق سكون البذور والسيطرة FR-تعتمد على إنبات البذور. منذ SCBA يسمح باستخدام اندماجي من سبات، وnondormant المعدلة وراثيا معطف البذور والمواد الجنينية، مسارات الجينية السيطرة على الإنبات وتحديدا المرجعيمكن تشريح بتوليد في السويداء والجنين. نحن هنا التفاصيل الإجراء لتجميع SCBA.

وأظهرت الأعمال السابقة أن بذور متحولة غير قادر على تجميع GA كانوا غير قادرين على الإنبات نتيجة لتراكم عالية ABA في البذور 11،12. ومع ذلك، وعدم القدرة على الإنبات يتطلب معطف البذور منذ زواله يؤدي النمو الجنيني 13. هذا وأشارت بقوة إلى أن السويداء من البذور غير قا?...

Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

نقدم الإجراء لتجميع البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) من بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana. وقد أظهرت SCBA أن تكون أداة قوية لاستكشاف وراثيا في المختبر وكيفية إنبات البذور الضوابط السويداء في البذور نائمة واستجابة لمنبهات الضوء. وSCBA هو من حيث المبدأ المعمول بها تحت أي الحالة التي يشتبه السويداء على التأثير في النمو الجنيني.

معطفا البذور الفراش الفحص لاستكشاف وراثيا<em&gt; في المختبر</em&gt; كيف إنبات البذور في الضوابط السويداء<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.2K Views.  Université de Genève.  نقدم الإجراء لتجميع البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) من بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana. وقد أظهرت SCBA أن تكون أداة قوية لاستكشاف وراثيا في المختبر وكيفية إنبات البذور الضوابط السويداء في البذور نائمة واستجابة لمنبهات الضوء. وSCBA هو من ?...

Video: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

استخدام متحولات eceriferum Arabidopsis لاستكشاف النبات البناء الحيوي البشرة

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

تحليل "سلوك نمو" نبات التمويل في "نوعيات مختلفة من الضوء"

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

طريقة بسيطة للقطع الجاف للحصول على قسم الراتنج الكامل الحجم للبذر وتطبيقاته

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

تحليل تأثير إجهاد الملح المركب على إنبات البذور وتحمل الملح تحليل الفلفل (الفليفلة السنوية L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

التحقيق الزماني المكاني لديناميكيات ERL1 عبر التصوير البؤري

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

تسليط الضوء على المؤلف: الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

الطرق القائمة على الصور لدراسة أحداث الاتجار بالغشاء في خلايا سلالة الثغور

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

التحقيق في آلية نقل الزنك في خلايا الثدييات باستخدام مقايسة FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تنظيم الزنك الخلوي من خلال وظائف ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...