עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהשויצריים הקרן הלאומית למדע ועל ידי המדינה של ז&#39;נבה.

ברגע שSCBA מורכב, הצמיחה של עוברים מנוטרת על פני כמה ימים. לכן, לפני הליך הזרע לנתיחה וההרכבה של SCBA, צריך לעקר זרעים כדי למנוע זיהומים בעתיד שיכול למנוע הערכה נכונה של ההשפעה של חומר מעיל זרע על צמיחה עוברית. 1. עיקור זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50-60 μl של זרעי ארבידופסיס בוגרים ויבשים בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהכין פתרון אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול פתרון לצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים ולנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל&quot;ד בvortexer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון אתנול 70% באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים כדי לא<html> הוא צינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים מים סטריליים לצינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. ודא כי זרימת המים homogenously משהה את הזרעים בתוך הצינור. המטרה כאן היא למנוע טלטול נוסף, כדי לשמור על שלמות הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הזרעים להתיישב על ידי כוח הכבידה בחלק התחתון של הצינור על ידי השארת הצינור עדיין ל30 שניות. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה ארבע פעמים על שלבים 1.8-1.9. בסך הכל הליך העיקור לוקח בערך 30 דקות. </li></ol> 2. זרעי ציפוי ontent &quot;&gt; כל הצעדים הבאים מבוצעים בתוך זרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת צלחת פטרי (קוטר 100 מ&quot;מ, 20 גובה מ&quot;מ) המכיל 30 מיליליטר של מדיום נביטה שהוכן על ידי מעוקר תמיסה המכילה 4.3 g / L Murashige ובינוני Skoog ב2.5 מ&quot;מ 2 - (N-morpholino) חומצת ethanesulfonic (MES-KOH ; PH 5.7) ואגר 0.8 גר &#39;/ ליטר. תן הפתרון להתקרר באמבט מים 50 מעלות צלזיוס לפני ששופך אותה על צלחת צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מים מזוקקים סטריליים לצינור המכיל את הזרעים. Resuspend את הזרעים ולהעביר אותם על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות פיפטה סטנדרטית עם טיפ 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים המקיפים את הזרעים על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות קצה יניקת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צלחת פטרי המכילה את הזרעים בלי המכסה שלו בתוך הזרימה למינרית לשעה 2 לייבוש נוסף. סגור את צלחת פטרי עם המכסה ולתת לזה לעמוד מתחת למינריתזרימת ממשלה כ -90 דקות, כך שבערך 4 שעות חלפו מאז תחילתו של הליך עיקור זרעים (שלב 1.2). </li></ol> 3. Dissection הזרע השלבים הבאים מחייבים עבודה עם סטראו הונח בתוך ארון הזרימה למינרית. מלקחיים דומון # 5 עם טיפים קטומים (כלומר קהה) מקל באופן משמעותי את הטיפול בזרעים (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של שני מסמכים זה לצד זה מלבני הבינוני סטרילי Whatman 3MM (1.5 סנטימטר x 1.0 סנטימטר; איור 1, שלב 1). טמן 3MM נייר מעוקר ב החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזרעים על ניירות Whatman 3MM באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 1, שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזיק זרע בודד נגד עיתון Whatman 3MM ידי הלחיצה בעדינות את הזרע באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים ( <strong&gt; איור 1, שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) של הזרע באמצעות מחט מזרק (מזרק מיליליטר למשל U100 אינסולין מזרק + 1, 0.33 מ&quot;מ (29 G) x 12.7 מ&quot;מ) (איור 1 ב, שלב 4). הצורה של זרעי ארבידופסיס היא ellipsoidal ומומלצת לחתוך את מעיל הזרע לאורך הציר למחצה העיקרי הארוך ביותר הקרוב ככל האפשר למקום שבו הפסיגים מצטרפים לradicle (כלומר הרחק בקצה הקיצוני). זה עוזר לשחרורו הבטוח של העובר בשלב הבא של הליך הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את הזרע נגד עיתון Whatman 3MM באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים (איור 1, שלב 5). צעד זה משחרר את העובר מתוך מעיל הזרע דרך הפתח שנוצר בשלב 3.4 (איור 1 ב, שלב 6). מומלץ ליישם את הדחיפה בזרע שבו קצה הפסיגים נמצא בקרוב ביותר לקצה radicle (כלומר משם frאום הפתיחה). </li></ol> 4. הרכבה של מעיל זרע מצעים Assay (SCBA) ראה דיון לבחירה הנכונה של מספר שכבות זרע והעוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של מדיום חתיכת סטרילי מלבנית (3.5 סנטימטר x 5.0 סנטימטר) של רשת ניילון (איור 2, שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע נזק, ניתן להעביר עוברים ומעילי זרע אל פני השטח של הקצוות המתכתיים של המלקחיים על ידי בעדינות דוחף אותם באמצעות מחט המזרק (איור 2, שלב 2). העברת עוברים ומעילי זרע על רשת ניילון (איור 2, שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע באמצעות המלקחיים הקהות ואת המחט ולוודא כי מעילי זרעים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר (איור 2, שלב 4). נסה לחשוף עד כמה שניתן את פתיחת מעיל הזרע שנוצרה על ידימחט כלפי מעלה. צעד זה לא נבדק באופן שיטתי. עם זאת, זה יכול להגביר את היעילות של SCBA מאז חומרי diffusible עיכוב הצמיחה של העובר צפויים לנטרל ישירות לכיוון את העובר ולא ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע שנאספה בשלב 4.3 (איור 2, שלב 5). להבטיח כי העוברים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה SCBAs תחת אור הרציף (40 μmol / m 2 של EC) בשעה 20-21 ° C. במקרה שבו דופק FR משמש לעצור את הנביטה, להרכיב SCBA תחת אור רגיל, להחיל את דופק FR כמתואר 9 ולהשאיר צלחת פטרי בחושך. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הליך assay מצעי מעיל הזרע (SCBA) שתואר כאן הוא בעיקרון חל על כל נסיבות שבי נביטת זרעי ארבידופסיס חסומה (או עיכוב) ושבו האנדוספרם חשד לביצוע המעצר הזה. יכול להיות שמעיד האחרון על ידי הסרת קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) והתבוננות שתמורת צמיחה עוברית מהר יותר ביחס לזה שנצפתה ...

בזרעים בוגרים ארבידופסיס, מעיל הזרע מורכב מטסטה, שכבה חיצונית של רקמה מתה ממוצא אימהי, והאנדוספרם, שכבת תא בודדת של רקמה חי ישירות המקיפה את העובר 1. האנדוספרם והעובר נגזרים מאירועים נפרדים הפריה: האנדוספרם הוא רקמת triploid עם שתי אימהיים ואבהי גנום אחד ואילו העובר הוא רקמה דיפלואידי עם אימהי אחד והגנום אבהי אחד 2. הפונקציה העיקרית שהוקצתה באופן מסורתי להאנדוספרם היא זה של רקמה תזונתית. עם זאת, זה הופך ברור יותר ויותר שהאנדוספרם גם ממלא תפקיד מרכזי לשלוט נביטת זרעים. רעיון זה הפך ראשון נראית לעין במקרה של תרדמת, תכונה הוצגה על ידי זרעי הפיק חדש. זרעים רדומים מצליחים לנבוט למרות נוכחותם של תנאי נביטה חיוביים. זרעים מאבדים תרדמתם אחרי תקופת הבשלה והפכו nondormant, כלומר הם ינבטו כאשר הם נחשפים לתנאי נביטה חיוביים. במיני צמחים רבים, כוללים צמח מודל ארבידופסיס, מעיל הזרע דרוש לחלוטין כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים מאז הסרת מעיל זרע מעוררת צמיחה עוברית והורקת 3,4. בארבידופסיס, Bethke et al. ציין כי הנביטה נשארה מודחקת לאחר הסרת טסטה, תוך שמירה על האנדוספרם שמקיף את האנדוספרם 5. תצפיות אלו מצביעות על כך שמאוד האנדוספרם הוא הרקמה בתוך מעיל זרע הפעלת פעילות דיכוי בעובר. עם זאת, ניסויי הסרת מעיל זרע לא בהכרח יעזרו להבהיר את אופי פעילות דיכוי הנביטה הניתן על ידי מעיל הזרע ולא בזיהוי גנים הליישם אותה. לאחרונה הצגנו assay מצעי מעיל זרע (SCBA) שבו מעילי זרע ועוברים מופרדים פיזי אך המשיכו בקרבת proxiMity כך שפעילות דיכוי הנביטה הניתנת על ידי האנדוספרם נשמר 6. SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל זרע רדום, nondormant, ומהונדס גנטי וחומרים עובריים. כתוצאה מכך, יכולים להיות גזורים המסלולים הגנטיים השליטה נביטה ובמיוחד פועלים בהאנדוספרם והעובר. SCBA שימש בהקשר של תרדמת כדי להראות שהאנדוספרם משחרר חומצת phytohormone abscisic (ABA) לעובר להדחיק הצמיחה שלה 6. יתר על כן אנו יכולים להשתמש SCBA לזהות את מסלולי איתות הפועלים בהאנדוספרם ורקמות עובריים כדי לקדם תרדמת. התפקיד של האנדוספרם לשלוט נביטה התחזק עוד יותר על ידי בהתחשב המקרה של זרעי nondormant נחשפו לדופק של אור אדום רחוק (FR). מוקדם על שקי זרע דופק FR אור ידוע לעכב נביטה 7,8. כאשר מעילי זרע הוצאו מזרעי דופק של FR אורלא היה מסוגלת לעכב נביטה, חזק המצביע על כך האנדוספרם יכול גם לדכא את הנביטה של זרעי nondormant 9. למרבה הפלא, SCBA יכול לשמש גם כדי לסכם עיכוב FR תלוי של נביטה. זה אפשר להראות כי כי עיכוב FR תלוי של נביטת זרעים הוא גם תהליך כרוך שחרור ABA מהאנדוספרם 9. יתר על כן, SCBA אפשר זיהוי מסלולי אור איתות השונים הפועלים בהאנדוספרם והעובר לשלוט נביטת זרעי nondormant בתגובה לאותות אור 9,10. SCBA נראה אפוא להיות טכניקה אמינה לחקור את הפונקציה של האנדוספרם בהקשר של השליטה על נביטת זרעים. זהו גם כלי רב עוצמה על מנת להעריך במבחנה אם הגנים חשודים לשלוט נביטה לפעול בהאנדוספרם, העובר או שניהם הרקמות. כאן אנו פירוט הנדרש כדי להרכיב SCBA את השלבים השונים.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer Comfort</td><td>Eppendorf AG</td><td>5355 000.011</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td></tr><tr><td>Vacusafe Comfort</td><td>INTEGRA Biosciences AG</td><td>158 310</td><td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td></tr><tr><td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>664 102</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>Agar (plant agar)</td><td>Duchefa Biochemie B.V.</td><td>P1001</td><td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td></tr><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11251-10</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>BD Micro-Fine</td><td>324827</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td></tr><tr><td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td><td>SEFAR AG</td><td>03-50/31</td><td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF Plant Climatics</td><td>Percival I-30BLLX</td><td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td></tr><tr><td>Paclobutrazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46046</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td></tr></tbody></table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

האנדוספרם ארבידופסיס מורכב משכבה תא בודדת המקיפה את העובר הבוגר ומשחקת תפקיד חיוני כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים או שזרעי nondormant מוקרנים על ידי אדום רחוק (FR) דופק את אור. על מנת לקבל תובנות לגבי המנגנונים גנטיים המולקולריים שבבסיס פעילות דיכוי הנביטה המופעל על ידי האנדוספרם נוסף, assay &quot;מצעי מעיל זרע&quot; (SCBA) תוכנן. SCBA הוא הליך נתיחת מפרידה פיזית בין מעילי זרע ועוברים מן הזרעים, המאפשר ניטור הצמיחה של עוברים בשכבה בסיסית של מעילי זרע. למרבה הפלא, SCBA reconstitutes פעילות דיכוי הנביטה של ​​מעיל הזרע בהקשר של תרדמת זרעים ובקרת FR תלויה של נביטת זרעים. מאז SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל רדום, nondormant וזרעים מהונדסים גנטי וחומרים עובריים, המסלולים הגנטיים שליטה נביטה ובמיוחד אופעל דוושה בהאנדוספרם והעובר יכולה להיות גזור. כאן אנו מפרט את ההליך כדי להרכיב SCBA.

העבודות קודמות הראו כי זרעים שעברו מוטציה מסוגל לסנתז GA לא היו מסוגלים לנבוט כתוצאה מהצטברות הגבוהה ABA בזרעי 11,12. עם זאת, חוסר היכולת לנבוט דורשת מעיל הזרע מאז הסרתו מעוררת 13 צמיחה עוברית. זה מאוד הצביע על כך שהאנדוספרם של זרעים מסוגלים לסנתז GA מפרסם ABA לחסו...

Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.4K Views.  Université de Genève.  אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו ...

Video: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

דרך אמין להערכת זרע נביטה, תרדמת, ותמותה בתנאי שדה

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Environment

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Developmental Biology

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

מיקרוסקופיית כוח אטומי לחקר התכונות הפיזיקליות של תאי אפידרמיס של שורשי ערבידופסיס חיים

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Immunology and Infection

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

שמירת עבודה והמשך המגע הכוח איתות פרוטוקול המסך מוטציה למחקר של Thigmomorphogenesis של צמח המודל Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

שיטה חזקה וגמישה מאוד לעיקור פני השטח של זרעי ערבידופסיס

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video