עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהשויצריים הקרן הלאומית למדע ועל ידי המדינה של ז&#39;נבה.

ברגע שSCBA מורכב, הצמיחה של עוברים מנוטרת על פני כמה ימים. לכן, לפני הליך הזרע לנתיחה וההרכבה של SCBA, צריך לעקר זרעים כדי למנוע זיהומים בעתיד שיכול למנוע הערכה נכונה של ההשפעה של חומר מעיל זרע על צמיחה עוברית. 1. עיקור זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50-60 μl של זרעי ארבידופסיס בוגרים ויבשים בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל ולהכין פתרון אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 70% אתנול פתרון לצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים ולנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל&quot;ד בvortexer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון אתנול 70% באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים כדי לא<html> הוא צינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור microcentrifuge צנטריפוגות במשך 3 שניות ב4,000 XG להתרכז זרעים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מים מזוקקים מים סטריליים לצינור microcentrifuge עדיין מכיל את הזרעים. ודא כי זרימת המים homogenously משהה את הזרעים בתוך הצינור. המטרה כאן היא למנוע טלטול נוסף, כדי לשמור על שלמות הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הזרעים להתיישב על ידי כוח הכבידה בחלק התחתון של הצינור על ידי השארת הצינור עדיין ל30 שניות. לשאוב supernatant מים באמצעות קצה יניקת ואקום שעזב בזהירות את הזרעים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה ארבע פעמים על שלבים 1.8-1.9. בסך הכל הליך העיקור לוקח בערך 30 דקות. </li></ol> 2. זרעי ציפוי ontent &quot;&gt; כל הצעדים הבאים מבוצעים בתוך זרימה למינרית לשמור על תנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת צלחת פטרי (קוטר 100 מ&quot;מ, 20 גובה מ&quot;מ) המכיל 30 מיליליטר של מדיום נביטה שהוכן על ידי מעוקר תמיסה המכילה 4.3 g / L Murashige ובינוני Skoog ב2.5 מ&quot;מ 2 - (N-morpholino) חומצת ethanesulfonic (MES-KOH ; PH 5.7) ואגר 0.8 גר &#39;/ ליטר. תן הפתרון להתקרר באמבט מים 50 מעלות צלזיוס לפני ששופך אותה על צלחת צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מים מזוקקים סטריליים לצינור המכיל את הזרעים. Resuspend את הזרעים ולהעביר אותם על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות פיפטה סטנדרטית עם טיפ 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים המקיפים את הזרעים על פני השטח של מדיום הנביטה באמצעות קצה יניקת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צלחת פטרי המכילה את הזרעים בלי המכסה שלו בתוך הזרימה למינרית לשעה 2 לייבוש נוסף. סגור את צלחת פטרי עם המכסה ולתת לזה לעמוד מתחת למינריתזרימת ממשלה כ -90 דקות, כך שבערך 4 שעות חלפו מאז תחילתו של הליך עיקור זרעים (שלב 1.2). </li></ol> 3. Dissection הזרע השלבים הבאים מחייבים עבודה עם סטראו הונח בתוך ארון הזרימה למינרית. מלקחיים דומון # 5 עם טיפים קטומים (כלומר קהה) מקל באופן משמעותי את הטיפול בזרעים (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של שני מסמכים זה לצד זה מלבני הבינוני סטרילי Whatman 3MM (1.5 סנטימטר x 1.0 סנטימטר; איור 1, שלב 1). טמן 3MM נייר מעוקר ב החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזרעים על ניירות Whatman 3MM באמצעות מלקחיים סטריליים (איור 1, שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזיק זרע בודד נגד עיתון Whatman 3MM ידי הלחיצה בעדינות את הזרע באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים ( <strong&gt; איור 1, שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) של הזרע באמצעות מחט מזרק (מזרק מיליליטר למשל U100 אינסולין מזרק + 1, 0.33 מ&quot;מ (29 G) x 12.7 מ&quot;מ) (איור 1 ב, שלב 4). הצורה של זרעי ארבידופסיס היא ellipsoidal ומומלצת לחתוך את מעיל הזרע לאורך הציר למחצה העיקרי הארוך ביותר הקרוב ככל האפשר למקום שבו הפסיגים מצטרפים לradicle (כלומר הרחק בקצה הקיצוני). זה עוזר לשחרורו הבטוח של העובר בשלב הבא של הליך הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את הזרע נגד עיתון Whatman 3MM באמצעות טיפים בוטים לצד זה של המלקחיים הקטומים (איור 1, שלב 5). צעד זה משחרר את העובר מתוך מעיל הזרע דרך הפתח שנוצר בשלב 3.4 (איור 1 ב, שלב 6). מומלץ ליישם את הדחיפה בזרע שבו קצה הפסיגים נמצא בקרוב ביותר לקצה radicle (כלומר משם frאום הפתיחה). </li></ol> 4. הרכבה של מעיל זרע מצעים Assay (SCBA) ראה דיון לבחירה הנכונה של מספר שכבות זרע והעוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מנה חדשה פטרי המכילה 30 מיליליטר של מדיום נביטה. מקום על פני השטח של מדיום חתיכת סטרילי מלבנית (3.5 סנטימטר x 5.0 סנטימטר) של רשת ניילון (איור 2, שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע נזק, ניתן להעביר עוברים ומעילי זרע אל פני השטח של הקצוות המתכתיים של המלקחיים על ידי בעדינות דוחף אותם באמצעות מחט המזרק (איור 2, שלב 2). העברת עוברים ומעילי זרע על רשת ניילון (איור 2, שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע באמצעות המלקחיים הקהות ואת המחט ולוודא כי מעילי זרעים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר (איור 2, שלב 4). נסה לחשוף עד כמה שניתן את פתיחת מעיל הזרע שנוצרה על ידימחט כלפי מעלה. צעד זה לא נבדק באופן שיטתי. עם זאת, זה יכול להגביר את היעילות של SCBA מאז חומרי diffusible עיכוב הצמיחה של העובר צפויים לנטרל ישירות לכיוון את העובר ולא ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע שנאספה בשלב 4.3 (איור 2, שלב 5). להבטיח כי העוברים נמצאים בקרבה כהרבה יותר קרובה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה SCBAs תחת אור הרציף (40 μmol / m 2 של EC) בשעה 20-21 ° C. במקרה שבו דופק FR משמש לעצור את הנביטה, להרכיב SCBA תחת אור רגיל, להחיל את דופק FR כמתואר 9 ולהשאיר צלחת פטרי בחושך. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הליך assay מצעי מעיל הזרע (SCBA) שתואר כאן הוא בעיקרון חל על כל נסיבות שבי נביטת זרעי ארבידופסיס חסומה (או עיכוב) ושבו האנדוספרם חשד לביצוע המעצר הזה. יכול להיות שמעיד האחרון על ידי הסרת קליפת הזרע (Testa והאנדוספרם) והתבוננות שתמורת צמיחה עוברית מהר יותר ביחס לזה שנצפתה כאשר עוברים מוקפים בקליפת הזרע. נביטה עשויה להיחסם בתגובה לפרמטרים פיזיים סביבתיים מסוימים (לדוגמא: פוטנציאל מים או איכות אור) או ברקע גנטי ספציפי (למשל היעדר סינתזת GA כמו במוטציות ga1, ראה איור 3). אין כללים כלליים בדבר מספר מעילי זרע והעוברים שישמשו לSCBA. זה תלוי במנת הזרע (ובפרט הרעננות שלה) ואת הסוג של ניסוי שיבוצע. לכן זה קריטי לadjust כמות חומר גזור לכל מקרה ומקרה על ידי ניטור הצמיחה על העוברים על המיטה של ​​מעילי זרע על בסיס יומי. עם זאת, בדרך כלל כמה מעילי זרע נחוצים כאשר ecotypes ארבידופסיס הרדום מאוד נמצא בשימוש. מוצגים להלן כמויות אופייניות למעיילי זרע ועוברים שהיו בשימוש בהצלחה כאשר הרכבת SCBAs: SCBA עם חומר זרעים רדום 6: * טרי שנקטפו ecotype (כלומר רדום) קייפ ורדה איילנד (CVI): השתמש 10 עוברים ו20 מעילי זרע. * זרעים לנדסברג שנקטפו טרי (הימלר): השתמש 10 עוברים ו80 מעילי זרע. SCBA בהעדר ג&#39;יברלין (GA) ביוסינתזה (איור 3): * זרעים שעברו מוטציה ga1 (קולומביה - Col - ecotype): השתמש 10 עוברים ו80 מעילי זרע. * זרעי Col סוג פרוע עם 10 paclobutrazol מיקרומטר (מעכב של ביוסינתזה GA) במדיום הנביטה: שימוש 10 עוברים ו100 מעילי זרע. הוספת Paclobutrazol כאשר המדיום הוא התקרר ל50 מעלות צלזיוס לפני שנשפך לתוך צלחת פטרי. SCBA אחרי דופק של (FR) אור אדום רחוק 9: * השתמש 12 עוברים ו100 מעילי זרע. המגבלה היחידה של טכניקת SCBA היא שזה דורש סבלנות ומיומנות כדי להרכיב במהירות את חומרי זרע גזורים ואילו לא הורג את העוברים. חוקר מנוסה יכול לנתח 100 זרעים בתוך 20-30 דקות. עם זאת, משתמשים מנוסים פחות ייתכן שיצטרכו שעה 1 ומצפים לנזק עוברי. למיטב ידיעתנו יש כל כך הרבה אין טכניקות חלופיות כדי לחקור את תפקידה של האנדוספרם לבקרה של נביטת זרעים.

בזרעים בוגרים ארבידופסיס, מעיל הזרע מורכב מטסטה, שכבה חיצונית של רקמה מתה ממוצא אימהי, והאנדוספרם, שכבת תא בודדת של רקמה חי ישירות המקיפה את העובר 1. האנדוספרם והעובר נגזרים מאירועים נפרדים הפריה: האנדוספרם הוא רקמת triploid עם שתי אימהיים ואבהי גנום אחד ואילו העובר הוא רקמה דיפלואידי עם אימהי אחד והגנום אבהי אחד 2. הפונקציה העיקרית שהוקצתה באופן מסורתי להאנדוספרם היא זה של רקמה תזונתית. עם זאת, זה הופך ברור יותר ויותר שהאנדוספרם גם ממלא תפקיד מרכזי לשלוט נביטת זרעים. רעיון זה הפך ראשון נראית לעין במקרה של תרדמת, תכונה הוצגה על ידי זרעי הפיק חדש. זרעים רדומים מצליחים לנבוט למרות נוכחותם של תנאי נביטה חיוביים. זרעים מאבדים תרדמתם אחרי תקופת הבשלה והפכו nondormant, כלומר הם ינבטו כאשר הם נחשפים לתנאי נביטה חיוביים. במיני צמחים רבים, כוללים צמח מודל ארבידופסיס, מעיל הזרע דרוש לחלוטין כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים מאז הסרת מעיל זרע מעוררת צמיחה עוברית והורקת 3,4. בארבידופסיס, Bethke et al. ציין כי הנביטה נשארה מודחקת לאחר הסרת טסטה, תוך שמירה על האנדוספרם שמקיף את האנדוספרם 5. תצפיות אלו מצביעות על כך שמאוד האנדוספרם הוא הרקמה בתוך מעיל זרע הפעלת פעילות דיכוי בעובר. עם זאת, ניסויי הסרת מעיל זרע לא בהכרח יעזרו להבהיר את אופי פעילות דיכוי הנביטה הניתן על ידי מעיל הזרע ולא בזיהוי גנים הליישם אותה. לאחרונה הצגנו assay מצעי מעיל זרע (SCBA) שבו מעילי זרע ועוברים מופרדים פיזי אך המשיכו בקרבת proxiMity כך שפעילות דיכוי הנביטה הניתנת על ידי האנדוספרם נשמר 6. SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל זרע רדום, nondormant, ומהונדס גנטי וחומרים עובריים. כתוצאה מכך, יכולים להיות גזורים המסלולים הגנטיים השליטה נביטה ובמיוחד פועלים בהאנדוספרם והעובר. SCBA שימש בהקשר של תרדמת כדי להראות שהאנדוספרם משחרר חומצת phytohormone abscisic (ABA) לעובר להדחיק הצמיחה שלה 6. יתר על כן אנו יכולים להשתמש SCBA לזהות את מסלולי איתות הפועלים בהאנדוספרם ורקמות עובריים כדי לקדם תרדמת. התפקיד של האנדוספרם לשלוט נביטה התחזק עוד יותר על ידי בהתחשב המקרה של זרעי nondormant נחשפו לדופק של אור אדום רחוק (FR). מוקדם על שקי זרע דופק FR אור ידוע לעכב נביטה 7,8. כאשר מעילי זרע הוצאו מזרעי דופק של FR אורלא היה מסוגלת לעכב נביטה, חזק המצביע על כך האנדוספרם יכול גם לדכא את הנביטה של זרעי nondormant 9. למרבה הפלא, SCBA יכול לשמש גם כדי לסכם עיכוב FR תלוי של נביטה. זה אפשר להראות כי כי עיכוב FR תלוי של נביטת זרעים הוא גם תהליך כרוך שחרור ABA מהאנדוספרם 9. יתר על כן, SCBA אפשר זיהוי מסלולי אור איתות השונים הפועלים בהאנדוספרם והעובר לשלוט נביטת זרעי nondormant בתגובה לאותות אור 9,10. SCBA נראה אפוא להיות טכניקה אמינה לחקור את הפונקציה של האנדוספרם בהקשר של השליטה על נביטת זרעים. זהו גם כלי רב עוצמה על מנת להעריך במבחנה אם הגנים חשודים לשלוט נביטה לפעול בהאנדוספרם, העובר או שניהם הרקמות. כאן אנו פירוט הנדרש כדי להרכיב SCBA את השלבים השונים.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

האנדוספרם ארבידופסיס מורכב משכבה תא בודדת המקיפה את העובר הבוגר ומשחקת תפקיד חיוני כדי למנוע הנביטה של זרעים רדומים או שזרעי nondormant מוקרנים על ידי אדום רחוק (FR) דופק את אור. על מנת לקבל תובנות לגבי המנגנונים גנטיים המולקולריים שבבסיס פעילות דיכוי הנביטה המופעל על ידי האנדוספרם נוסף, assay &quot;מצעי מעיל זרע&quot; (SCBA) תוכנן. SCBA הוא הליך נתיחת מפרידה פיזית בין מעילי זרע ועוברים מן הזרעים, המאפשר ניטור הצמיחה של עוברים בשכבה בסיסית של מעילי זרע. למרבה הפלא, SCBA reconstitutes פעילות דיכוי הנביטה של ​​מעיל הזרע בהקשר של תרדמת זרעים ובקרת FR תלויה של נביטת זרעים. מאז SCBA מאפשר השימוש קומבינטורית של מעיל רדום, nondormant וזרעים מהונדסים גנטי וחומרים עובריים, המסלולים הגנטיים שליטה נביטה ובמיוחד אופעל דוושה בהאנדוספרם והעובר יכולה להיות גזור. כאן אנו מפרט את ההליך כדי להרכיב SCBA.

העבודות קודמות הראו כי זרעים שעברו מוטציה מסוגל לסנתז GA לא היו מסוגלים לנבוט כתוצאה מהצטברות הגבוהה ABA בזרעי 11,12. עם זאת, חוסר היכולת לנבוט דורשת מעיל הזרע מאז הסרתו מעוררת 13 צמיחה עוברית. זה מאוד הצביע על כך שהאנדוספרם של זרעים מסוגלים לסנתז GA מפרסם ABA לחסום צמיחה עוברית. לכן אנו מצפים מעילי זרעים מסוגלים לסנתז GA כדי לחסום את הצמיחה של עוברים בSCBA ניגוד מעילי זרע מסוגלים לסנתז GA וABA. כאן אנו משתמשים ga1-21 (קו הוספת סאלק Salk_109115) זרעים שעברו מוטציה שנשאו החדרת T-DNA לשבש את גן GA1 (הצטרפות AT4G02780) קידוד synthase דיפוספט ent-copalyl, שהוא חיוני לביוסינתזה GA 14 (קו הוספת SALK_109115 בGA1 (Col ecotype) הוא הפניה באתר 15 (סאלק אות <a href="http://signal.salk.edu/" target="_blank">http://signal.salk</a>. Edu /). עולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות 13, ga1-21 זרעים שעברו מוטציה לא יכולים לנבוט 80 שעות לאחר שקיה זרע (איור 3, 1 לוח). בניגוד לכך ועקבי יותר עם ​​תוצאות קודמות 13, הסרת קליפת זרע מופעלת ga1-21 צמיחת עובר (איור 3, לוח 2), אלא אם כן ABA היה נוכח במדיום (איור 3, לוח 3). לוח 4 באיור 3 נלקח 80 שעות לאחר שקיה זרע ומראה SCBA עם ga1-21 עוברים על מצע של 80 ga1-21 מעילי זרע. עולה בקנה אחד עם ההשערה שלנו, ga1-21 מעילי זרע מוטנטי חסמו את הצמיחה של ga1-21 עוברים. עבודות קודמות הראו כי בזרעים רדומים מעיל הזרע מסנתז ומשחרר ABA לעובר כתוצאה מביטוי המכונן של RGL2 גורם DELLA GA-התגובה, אשר מקדמת את הצטברות ABA בספגזרעים 6,11. בתנאים שבו סינתזת GA חסומה RGL2 גורם DELLA constitutively מצטבר ומקדם הצטברות ABA 11. היעדר RGL2 וסינתזת ABA בga1-21 מעילי זרע צפוי ולכן כדי לאפשר את הצמיחה של ga1-21 עוברים בSCBA. כדי לבדוק השערה זו השתמשנו באלל aba2-1 המוטציה (ecotype Col), חסר בסינתזת ABA כתוצאה ממוטציה נקודתית בגן המקודד דהידרוגנז Xanthosin (AT1G52340) וקו הוספת rgl2-14 T-DNA (Salk_027654, ecotype col) 16. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig1.jpg" /> איור 1. הליך לנתיחה זרע. א) תרשים המתאר איך לעשות מלקחיים קטומים לנתיחה זרע. יכולים להיות מקוצצים מלקחיים באמצעות מספריים או מלקחיים. כאשר המלקחיים סגור shou טיפים קטועים זה לצד זה. כיסוי ld משטח בערך בגודל של זרע ב &#39;) שלב 1: שני צד בניירות סטרילי מלבניים צד Whatman 3MM מונחים על צלחת צלחת פטרי המכילה בינוני מוצק טרשת נפוצה. שלב 2: זרעים מועברים על פני השטח של ניירות Whatman 4 שעות לאחר שקיה. שלב 3: ההליך לנתיחה דורש מחזיק הזרע נגד עיתון Whatman באמצעות המלקחיים הקטומים. שלב 4: מחט מזרק משמש לחיתוך מעיל הזרע כפי שמוצג. שלבים 5 ו -6: טיפים לצד זה של המלקחיים הסגורים המשמשים לדחוף בעדינות את העובר מחוץ למעיל הזרע דרך האתר של החתך. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig2.jpg" /> איור 2. . הליך להרכבה של assay מצעי מעיל זרע שלב 1: פיסת רשת ניילון מלבנית מונחת על צלחת צלחת פטרי המכילה בינוני מוצק טרשת נפוצה. שלב 2 ו -3: עוברים גזורים ומעילי זרע הם בעדינותעבר לקצות המלקחיים באמצעות מחט המזרק לפני העברתם על גבי רשת ניילון. שלב 4 ו -5: להרכיב שכבה מעגלית ובודדה של מעילי זרע ולהשליך את העוברים כשכבת אחת עגולה במרכז מיטת מעיל הזרע התאסף. <img alt="איור 3" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig3.jpg" /> איור 3. נציג תוצאות עם חומר זרע מסוגל לסנתז GA. מבחני מצעי מעיל זרע באמצעות מעילי זרע ועוברים גזורים מga1 זרעים (ga1-21) מוטציה, לא מסוגלים לסנתז GA. פנלים להראות חומר צמחי כמתואר באיור שעה 80 לאחר שקיה זרע.

Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.4K Views.  Université de Genève.  אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו ...

Video: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

השימוש מוטאנטים eceriferum ארבידופסיס לחקור לציפורן ביוסינתזה הצמח

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

ניתוח התנהגות גדילה תודרנית לבנה באיכויות שונות אור

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

שמירת עבודה והמשך המגע הכוח איתות פרוטוקול המסך מוטציה למחקר של Thigmomorphogenesis של צמח המודל Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

ניתוח ההשפעה של מתח מלח מורכב על נביטת זרעים וסובלנות מלח ניתוח של פלפל (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

חקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות הדמיה קונפוקלית

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Author Spotlight: שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...