Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından hibe ve Cenevre Devlet tarafından desteklenmiştir.

SCBA monte sonra, embriyoların büyümesi birkaç gün boyunca izlenir. Bu nedenle, SCBA&#39;daki tohum diseksiyon işlemi ve montaj önce, bir embriyo gelişimi üzerinde tohum kaplama malzemesinin etkisine uygun bir değerlendirme engelleyebilir gelecek kirletmesini önlemek için tohum sterilize etmek gerekmektedir. 1.. Tohum Sterilizasyon <ol><li> Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, olgun ve kuru Arabidopsis tohum 50-60 ul dökün ve% 70 etanol solüsyon hazırlanır. </li><li> Tohum içeren mikrosantrifüj tüpüne% 70 etanol çözeltisi içinde 1 ml ilave edilir ve bir vortexer 1.200 rpm&#39;de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalanır. </li><li> 3 saniye santrifüj Mikrosantrifüj tüpü 4,000 xg&#39;de tüpün altındaki tohum konsantre. </li><li> Dikkatli bir mikrosantrifüj tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu ile,% 70 etanol solüsyonu aspire. </li><li> T için steril damıtılmış su ile 1 ml ilave edilir<html> O mikrosantrifüj tüp hala tohum içeren. </li><li> 1,200 rpm&#39;de 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayın. </li><li> 3 saniye santrifüj Mikrosantrifüj tüpü 4,000 xg&#39;de tüpün altındaki tohum konsantre. Dikkatli bir şekilde tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu kullanılarak süpernatan aspire su. </li><li> Hala tohum içeren mikrosantrifüj tüpüne steril su, damıtılmış suyun 1 ml ilave edilir. Suyun akışı homojen tüp içindeki tohum askıya emin olun. Burada amaç tohumların bütünlüğünü korumak üzere daha fazla sallayarak kaçınmaktır. </li><li> Tohumlar 30 saniye boyunca yine tüp bırakarak tüpün altındaki yerçekimiyle yerleşmek olsun. Dikkatli bir şekilde tüpün altındaki tohum bırakarak vakum emme ucu kullanılarak süpernatan aspire su. </li><li> 1,8-1,9 adımları dört kez tekrarlayın. Genel sterilizasyon prosedürü yaklaşık 30 dakika sürer. </li></ol> 2. Tohum Kaplama &quot;ontent&gt; Tüm sonraki basamaklar steril koşullarda korumak için bir laminer akış kabini içinde yapılır. <ol><li> (N-morfolino) etansülfonik asit (MES-KOH - bir Petri tabağı 2.5 mM 2 4.3 g / L Murashige ve Skoog ortamını ihtiva eden bir çözelti otoklav ile hazırlanabilir çimlenme ortamının 30 ml ihtiva eden (100 mm çapında, 20 mm yükseklik) hazırlanması , pH 5.7) ve 0.8 g / L agar. Çözüm Petri plaka üzerine dökülmeden önce 50 ° C su banyosunda soğumaya bırakın. </li><li> Tohumları ihtiva eden tüpe steril damıtılmış su 200 ul ekleyin. Tohum yeniden süspanse edin ve 1 ml ucu ile standart bir pipet kullanarak çimlenme ortamının yüzeyi üzerine transfer edin. </li><li> Bir vakum emme ucunu kullanarak çimlenme ortamının yüzeyinde tohumları çevreleyen su çıkarın. </li><li> Başka bir kurutma işlemi 2 saat boyunca laminer akış kabini içine Kapağın olmaksızın tohum içeren Petri kabı bırakın. Kapaklı Petri kabı kapatın ve laminer altında bekletinyaklaşık 4 saat, tohum sterilizasyon işlemi (adım 1.2) de başlatılmasından bu yana geçen, böylece yaklaşık 90 dakika boyunca kabine akar. </li></ol> 3. Tohum Diseksiyon Aşağıdaki adımlar laminer akış kaputu dolap içinde yerleştirilen bir stereo çalışma gerektirir. A Dumont forseps 5. kesik (yani künt) ipuçları ile büyük ölçüde tohumların kullanımı (Şekil 1A) kolaylaştırır. <ol><li> Çimlenme ortamının 30 ml içeren bir Petri kabı, yeni levha hazırlayın. Ortam, iki yan yana dikdörtgen steril Whatman 3MM kağıt (• Şekil 1 B, aşama 1, 1,5 cm x 1.0 cm) yüzeyinde bir yer. Whatman 3MM kağıt bir otoklav içinde sterilize edilir. </li><li> Steril forseps (Şekil 1B, adım 2) kullanılarak Whatman 3MM kağıtlara tohumları aktarın. </li><li> Yavaşça kesik forseps yan yana küt uçları (kullanılarak tohum basarak Whatman 3MM kağıt karşı tek bir tohum tutun <stRong&gt; Şekil 1B, 3. adım). </li><li> (12.7 mm x, örneğin U100 insülin şırınga + 1 ml şırınga içinde, 0.33 mm (29 g)), bir şırınga iğnesi kullanılarak tohum, tohum kabuğunu (testa ve endosperm) kesme (Şekil 1B, aşama 4). Arabidopsis tohum şekli elipsoidal olup, kotiledonlar (yani uzak kök ucundan) radikula birleştirilir yere mümkün olduğunca yakın en uzun yarı-ana ekseni boyunca, tohum kabuğunu kesmek için tavsiye edilir. Bu diseksiyon prosedürünün sonraki aşamada embriyonun güvenli serbest yardımcı olur. </li><li> Kesik forseps (Şekil 1B, adım 5) yan yana künt ipuçlarını kullanarak Whatman 3MM kağıt karşı tohum itin. Bu adım adım, 3,4 (Şekil 1B, aşama 6) oluşturulan açıklıktan dışarı tohum kabuğu embriyo serbest bırakır. Bu kotiledon ucu Kökçüğün ucuna en yakın olan tohum (yani, uzak fr itme uygulanması önerilirom açılması). </li></ol> 4. Meclis Tohum Portmanto Yatak Deneyi (SCBA) Tohum kat ve embriyo sayısı uygun seçimi için açıklamalara bakın. <ol><li> Çimlenme ortamının 30 ml içeren bir Petri kabı, yeni levha hazırlayın. Ortamının yüzeyi üzerine yerleştirin, naylon elekten bir steril dikdörtgen parça (3.5 cm x 5.0 cm) (Şekil 2, adım 1). </li><li> Zarar görmesini önlemek için, embriyo ve tohum kat yavaşça şırınga iğnesi (Şekil 2, adım 2) kullanarak onları iterek forseps metalik kenarlarının yüzeyine taşınmış olabilir. Embriyo transferi ve Naylon örgü (Şekil 2, 3. adım) üzerine tohum kat. </li><li> Tohumlar kat mümkün olduğunca çok yaklaştırdı (Şekil 2, adım 4) olduğundan emin köreltilmiş forseps ve iğne kullanarak tohum kat dairesel ve tek bir katman birleştirin. Mümkün olduğunca maruz deneyin tarafından üretilen tohum kabuğu açılışyukarı iğne. Bu adım sistematik test değildi. Embriyonun gelişimini inhibe yayılabilir maddeler doğrudan ondan embriyo dışarı doğru difüze yerine beklenmektedir Bununla beraber, bu SCBA&#39;daki verimliliğini artırabilir. </li><li> Adım 4.3 &#39;de monte edilmiş tohum kabuğu yatak ortasına, yuvarlak tek bir tabaka (Şekil 2, adım 5) halinde embriyolar yerleştirin. Embriyoların mümkün olduğu kadar yakın yakınlık içinde olduğundan emin olun. </li><li> 20-21 ° C&#39;de sürekli ışık (40 mol / m 2 s ec) altında SCBAs inkübe FR bir darbe, çimlenme tutuklama normal ışık altında SCBA&#39;yı monte tarif edildiği gibi FR nabız 9 uygulamak ve karanlıkta Petri çanağı bırakmak için kullanılan durumunda. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan çiğit yatak deneyi (SCBA) prosedürü prensip olarak Arabidopsis tohum çimlenme bloke (ya da sonra) ve endosperm, bu tutuklama uygulamaya şüphelenilen herhangi bir durum için geçerlidir. İkincisi, tohum kabuğunu (testa ve endosperm) kaldırılması ve embriyolar, tohum kaplama ile çevrili zaman bu göre daha hızlı bir büyüme embriyonik ilerler gözlemlenen gözlemleyerek kanıtlanabilir. Çimlenme özellikle çevresel, fiziksel parametrelere (örneğin su ya da potansiyel ışık kalitesi) veya belirli genetik geçmişleri içinde (GA1 mutantlar gibi GA sentez örneğin olmaması, bakınız Şekil 3) karşılık olarak bloke edilebilir. Tohum mont ve bir SCBA&#39;daki için kullanılacak embriyo sayısına ilişkin genel bir kural vardır. Bu tohum parti (ve özellikle de tazelik) bağlıdır ve deney türü için gerçekleştirilebilir. Bu adjus kritiktirgünlük olarak tohum kat yatağa embriyo üzerinde büyümesini izleyerek her bir özel durum için parçalanmış malzemenin miktarını t. Çok uyuyan Arabidopsis ekotipler kullanıldığında Ancak, genellikle birkaç tohum kat gereklidir. SCBAs montaj sırasında başarıyla kullanıldı tohum mont ve embriyoların tipik miktarları aşağıda gösterilmiştir: Uyuyan tohum malzeme 6 ile SCBA: Kullanım 10 embriyo ve 20 tohum kat: * Taze (yani uykuda) Cape Verde Adası ekotipinde (KVY) hasat. * Taze hasat Landsberg (Ler) tohumları: Use 10 embriyo ve 80 tohum kat. Gibberellin (GA) biyosentez (Şekil 3) yokluğunda SCBA: * GA1 mutant tohumlar (Columbia - Col - ekotipinde): Kullanımı 10 embriyo ve 80 tohum kat. Kullanım 10 embriyo: 10 uM Paclobutrazolun çimlenme ortam içinde (GA biyosentezinin bir inhibitörü) ile * Yabani tip Col tohumlarıs ve 100 tohum kat. Ortam Petri kabı içine dökülmeden önce 50 ° C&#39;ye kadar soğutulur, zaman paklobutrazol ekleyin. SCBA uzak kırmızı (FR) ışık 9 bir darbe sonrası: * 12 embriyo ve 100 tohum kat kullanın. SCBA tekniğin tek sınırlama embriyolar öldürme değil iken hızla disseke tohum malzemeleri bir araya şekilde sabır ve maharet gerektirir. Deneyimli bir araştırmacı 20-30 dakika içinde 100 tohumları incelemek olabilir. Ancak, daha az deneyimli kullanıcılar 1 saat ihtiyaç ve embriyonik zarar beklenebilir. Bildiğimiz kadarıyla tohum çimlenme kontrolü için endosperm rolünü araştırmak için bir alternatif teknikler kadar bulunmaktadır.

Arabidopsis olgun tohumlarda, tohum kabuğu testa, maternal kökenli ölü doku bir dış tabaka, ve endosperm, embriyo doğrudan 1 çevredeki canlı doku tek bir hücre tabakası oluşmaktadır. Endosperm ve embriyo ayrı fertilizasyon olaylardan türetilmiştir: embriyo, bir anne ve bir baba genomu 2 ile diploid doku ise endosperm anne ve bir baba genom iki ile bir triploid dokudur. Geleneksel olarak endosperm atanan ana işlevi bir besleyici doku olmasıdır. Bununla birlikte, aynı zamanda endosperm tohum çimlenmesi kontrol etmek için merkezi bir rol oynadığını giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bu kavram, uyuşukluk durumunda yeni üretilen tohumlar tarafından sergilenen bir özellik birinci belli oldu. Uyuyan tohumlar çimlenme elverişli koşulların varlığına rağmen çimlenmeye başarısız. Tohumlar bir olgunlaşma döneminden sonra kendi uyuşukluğuna kaybeder ve nondorman halineuygun çimlenme koşullarına maruz kaldığında t, yani çimlenir. Model bitki Arabidopsis dahil olmak üzere birçok bitki türünün içinde, tohum kabuğu kesinlikle çiğit kaldırma embriyonik büyüme ve 3,4 yeşillendirme tetikler beri uykuda tohumların çimlenmesini önlemek için gereklidir. Arabidopsis&#39;te, Bethke et al. Çimlenme endosperm 5 çevreleyen endosperm korurken testa çıkardıktan sonra bastırılmış kaldığı görülmektedir. Bu gözlemler, güçlü endosperm, embriyo üzerinde baskı uygulayarak aktivitesi tohum kabuğu içindeki doku olduğunu belirtti. Ancak, tohum kabuğu kaldırma deneyleri zorunlu tohum kat tarafından sağlanan çimlenme baskıcı faaliyetin doğasını açıklığa kavuşturulması ne de bunu uygulamak genlerin belirlenmesi yardım yok. Biz son zamanlarda tohum kabukları ve embriyolar fiziksel olarak ayrılmış ama yakın proxi tutulur bir tohum kat yatak tahlili (SCBA) tanıttımity endosperm sağladığı çimlenme baskıcı aktivitesi 6 korunur, böylece. SCBA, uyuyan nondormant ve genetiği değiştirilmiş tohum ceket ve embriyonik malzemelerin birleştirici kullanımına izin verir. Bunun bir sonucu olarak, çimlenme ve özellikle endosperm ve embriyoda işletim kontrol genetik yolları çıkarılmasına olanak sağlar. SCBA endosperm 6 büyümesini bastırmak için embriyo doğru fitohormon absisik asit (ABA) serbest bırakır göstermek için uyuşukluk bağlamında kullanılmıştır. Ayrıca biz Dormantlığı tanıtmak için sinyal endosperminde faaliyet yollar ve embriyonik doku tanımlamak için SCBA&#39;yı kullanabilirsiniz. Çimlenme kontrol endospermin rolü daha çok kırmızı (FR) ışık darbesine maruz nondormant tohumların davayı dikkate alarak güçlendi. Erken tohumun çekilmesi üzerine bir FR ışık palsı çimlenme 7,8 inhibe ettiği bilinmektedir. Tohum kat tohumlardan FR bir ışık nabız kaldırıldığındaşiddetle endosperm de nondormant tohumların 9 çimlenmesini ezemez düşündüren, çimlenme inhibe edemedi. Dikkate değer olarak, bağımsız solunum aparatı da çimlenme FR-bağımlı inhibisyonu özetlemek için kullanılabilir. Bu tohum çimlenme bu FR-bağımlı inhibisyonu da endosperm 9 ABA salınmasını içeren bir süreç olduğunu göstermektedir bırakıldı. Ayrıca, bağımsız solunum aparatı endosperm ve hafif ipuçları 9,10 cevaben nondormant tohum çimlenmesi kontrol etmek için embriyo faaliyet gösteren farklı ışıklı sinyal yollarını tespit izin verdi. SCBA tohum çimlenme kontrolü bağlamında endosperm işlevini keşfetmek için güvenilir bir teknik olduğu, bu nedenle görünüyor. Ayrıca, çimlenme kontrol şüphelenilen genler endosperm, embriyo ya da her ikisi dokularda faaliyet olup olmadığını değerlendirmek için in vitro güçlü bir araçtır. Burada bir ayrıntı SCBA&#39;yı birleştirmek için gereken çeşitli adımları biz.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

Arabidopsis endosperm olgun embriyoyu çevreleyen ve uyuyan tohumların çimlenmesini veya (FR) uzak kırmızı ışık atımı ile ışınlanmış nondormant tohumların bunu önlemek için önemli bir rol oynayan bir tek hücre tabakası oluşur. Ayrıca endosperm tarafından uygulanan çimlenme baskıcı aktivitesi altında yatan moleküler genetik mekanizmaları anlamak için, bir &quot;tohum kat yatak&quot; deneyi (SCBA) icat edildi. SCBA fiziksel tohum kat altta yatan bir katman üzerinde embriyo gelişimini izleme sağlar tohumlardan tohum mont ve embriyolar ayıran bir diseksiyon işlemdir. Dikkate değer, SCBA tohum dinlenmesi ve tohum çimlenme FR-bağımlı kontrolü bağlamında tohum kat çimlenme baskıcı faaliyetlerini yeniden oluşturulmasını. SCBA, atıl nondormant ve genetik olarak değiştirilmiş tohum kabuğu ve embriyo malzemeleri, çimlenme kontrol genetik yollarının kombinasyon kullanımına izin verir ve özel olarak op yanaendosperm ve embriyo aşmayınız disseke edilebilir. Burada bir ayrıntı SCBA&#39;yı monte prosedürü biz.

Önceki iş GA sentezlemek mümkün mutant tohum tohum 11,12 yüksek ABA birikiminin bir sonucu olarak çimlenme koyamadık olduğunu gösterdi. Onun kaldırma embriyonik büyüme 13 tetikler Ancak, çimlenmeye yetersizlik tohum kat gerektirir. Bu durum kuvvetle GA sentezlenmesi için mümkün tohumların endosperm embriyonik büyümesini bloke etmek ABA serbest olduğunu göstermiştir. Bu nedenle GA ve ABA sentezlemek mümkün tohum kat aksine SCBA&#39;daki embriyoların gelişimini engellemek için GA sentezlemek için tohumlar kat edemiyoruz bekliyoruz. Burada kullandığımız GA1-21 (Saik ekleme hattı Salk_109115) GA biyosentezi 14 GA1 in (SALK_109115 ekleme hattı için (gerekli olan ent-copalyl difosfat sentaz kodlayan GA1 geninin (erişim AT4G02780) bozan bir T-DNA sokulmasını taşıyan mutant tohumları Col ekotipinde) SALK sinyal veritabanında 15 (başvurulan <a href="http://signal.salk.edu/" target="_blank">http://signal.salk</a>. Edu /). Önceki sonuçlarla 13 ile tutarlı, GA1-21 mutant tohumları tohum massedilmesi sonra 80 saat (Şekil 3, Panel 1) çimlenme olamazdı. ABA (Şekil 3 Panel 3) ortamda mevcut olduğu sürece kontrast ve önceki sonuçları 13 ile daha fazla uyumlu olarak, çiğit temizleme GA1-21 embriyo büyüme (Şekil 3 Panel 2) tetiklenir. Şekil 3 Panel 4 tohum massedilmesi sonra 80 saat alınmış ve 80 GA1-21 tohum kat bir yatakta GA1-21 embriyolar ile bir SCBA&#39;yı gösterir oldu. Bizim hipotezi ile uyumlu, GA1-21 mutant tohum kat GA1-21 embriyoların büyümesini engelledi. Önceki çalışma atıl tohumlarda tohum kabuğu içinde emilen ABA birikimi teşvik GA-tepki DELLA faktör RGL2, yapısal ifadesi sonucu embriyo karşı ABA sentezini ve serbest bırakır gösterditohumlar 6,11. GA sentez engellenir koşullar altında DELLA faktör RGL2 yapısal olarak birikir ve ABA birikimi 11 destekler. RGL2 olmaması ve GA1-21 tohum kat ABA sentezi bu nedenle bir SCBA&#39;daki içinde GA1-21 embriyoların büyüme izin bekleniyor. Böylece, bu genin kodlayan Xanthosin dehidrojenaz (AT1G52340) bir nokta mutasyonu ile rgl2-14 T-DNA sokma hattı (Salk_027654 bir sonucu olarak ABA sentezde eksik olan aba2-1 mutant aleli (Col ekotipinde), el Bu hipotezi test etmek için, Col ekotipinde) 16. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig1.jpg" /> Şekil 1. Tohum diseksiyon için prosedür. A) Diyagram tohum diseksiyon için kesilmiş forseps nasıl açıklayan. Forseps makas veya kerpeten kullanılarak kesilebilir. Forseps yanyana kesik uçları Shou&#39;yu kapatıldığında. ld kapağı tohum büyüklüğünde bir yüzey B) 1. Adım: Yan dikdörtgen steril Whatman 3MM kağıtları iki yan MS katı ortamı içeren bir Petri kabı plaka üzerine serilir. Aşama 2: 4 saat tohumları emilmesiyle sonra Whatman kağıt yüzeyine aktarılır. Adım 3: diseksiyon prosedür kesik forseps kullanılarak Whatman kağıt karşı tohum tutma gerektirir. Adım 4: bir şırınga iğnesi gösterildiği gibi, tohum kabuğunu kesmek için kullanılır. Adım 5 ve 6: Kapalı forseps yan yana uçları hafifçe kesilmiş sitesi aracılığıyla tohum ceket dışında embriyo itmek için kullanılır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig2.jpg" /> Şekil 2. . Tohum kat yatak tahlil montaj Prosedürü Adım 1: Naylon örgü bir dikdörtgen parça MS katı ortamı içeren bir Petri kabı plaka üzerine serilir. Adım 2 ve 3: Dissected embriyolar ve tohum kat yavaşça vardırNaylon örgü üzerine aktarmak için önce şırınga iğnesi kullanılarak forseps kenarlarına taşındı. Adım 4 ve 5: tohum kat dairesel ve tek bir katman birleştirin ve monte tohum kat yatağın ortasına yuvarlak bir tek kat olarak embriyolar imha. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50732/50732fig3.jpg" /> Şekil 3,. GA sentezlemek mümkün tohum malzeme ile Temsilcisi sonuçları. GA sentezlemek mümkün GA1 (GA1-21) mutant tohumları disseke tohum kat ve embriyoları kullanılarak Tohum örtüsü yatak deneyleri. Tohum massedilmesi sonra rakam 80 saat açıklandığı gibi Paneller bitki materyali göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.4K Görüntüleme.  Université de Genève.  Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak. 

Video: A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Biyoloji

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

Bir model tesisi Arabidopsis thaliana Thigmomorphogenesis çalışması Için bir işgücü tasarrufu ve tekrarlanabilen dokunma-Force sinyalizasyon mutant ekran Protokolü

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Histokimyasal boyama

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Bir model tesisi Arabidopsis thaliana Thigmomorphogenesis çalışması Için bir işgücü tasarrufu ve tekrarlanabilen dokunma-Force sinyalizasyon mutant ekran Protokolü

Tam Tohum Lu Reişin Elde Edilmesinde Basit Bir Kuru Kesit Yöntemi ve Uygulamaları