이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 교부금에 의해 제네바의 국가에 의해 지원되었다.

SCBA가 조립되면, 배아의 성장은 며칠에 걸쳐 모니터링된다. 따라서 SCBA의 시드 절개 과정과 조립하기 전에, 하나는 배아 성장 종피 물질의 효과의 적절한 평가를 방지 할 수있는 미래의 오염을 피하기 위하여 종자를 살균 할 필요가있다. 1. 종자 소독 <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 성숙하고 건조 애기 씨의 50 μl를 넣고 70 % 에탄올 용액을 제조. </li><li> 종자를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에 70 % 에탄올 용액 1 ㎖를 추가하고 vortexer를 1,200 rpm에서 10 분 동안 실온에서 흔들. </li><li> 3 초 동안 원심 분리기의 microcentrifuge 관은 4,000 XG에서 튜브의 바닥에 씨앗을 집중한다. </li><li> 정중 microcentrifuge 관의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 이용하여 70 % 에탄올 용액을 대기음. </li><li> t에 멸균 증류수 1 ㎖를 추가<html> 그는 microcentrifuge 관은 여전히​​ 씨앗을 포함. </li><li> 1,200 rpm에서 10 분 동안 상온에서 흔들어. </li><li> 3 초 동안 원심 분리기의 microcentrifuge 관은 4,000 XG에서 튜브의 바닥에 씨앗을 집중한다. 조심스럽게 튜브의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 사용하여 물에 뜨는 기음. </li><li> 아직도 씨앗을 포함하는 microcentrifuge 관에 멸균 증류수 1 ㎖를 추가합니다. 물의 흐름을 균일하게 튜브 안에 씨앗을 일시 중단되었는지 확인합니다. 여기서의 목표는 씨앗의 무결성을 보존하도록 상기 흔들림이다. </li><li> 씨앗은 30 초 동안 계속 튜브를 남겨 튜브의 바닥에 중력에 의해 아래로 정착하자. 조심스럽게 튜브의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 사용하여 물에 뜨는 기음. </li><li> 1.9 - 1.8 단계를 네 번 반복합니다. 전체 살균하는 데 약 30 분 소요됩니다. </li></ol> 2. 씨 도금 &quot;ontent&gt; 모든 후속 단계는 멸균 조건을 보존하기 위해 층류 캐비닛 내부에서 수행된다. <ol><li> (N-모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES-KOH - 페트리 접시 플레이트 2.5 mM의 2에서 8.6 g / L 무라 시게 및 스쿡 배지를 함유하는 용액을 오토 클레이브에 의해 제조 발아 배지 30 ㎖를 함유하는 (100mm 직경, 20mm의 높이)를 준비 , 산도 5.7) 및 0.8 g / L 한천. 이 솔루션은 페트리 접시 접시에 붓는 전에 50 ° C의 물을 욕조에 진정하자. </li><li> 씨앗이 들어있는 튜브에 멸균 증류수 200 μl를 추가합니다. 씨앗을 재현 탁하고 1 ㎖ 팁과 표준 피펫을 이용하여 발아 매체의 표면에 그들을 전송. </li><li> 진공 흡인 팁을 이용하여 발아 매체의 표면에 씨앗을 둘러싼 물을 제거한다. </li><li> 추가 건조를 위해 2 시간 동안 층류 캐비닛 내부의 뚜껑없이 씨앗을 포함하는 페트리 접시를 남겨주세요. 뚜껑을 페트리 접시를 닫고이 층류에서 서있게약 4 시간이 종자 소독 절차 (단계 1.2)의 개시 이후 통과되도록 약 90 분 동안 캐비닛 흐름. </li></ol> 3. 종자 해부 다음 단계는 층류 후드 캐비닛 내부에 배치 실체 작업 필요로. 뒤몽의 포셉 # 5립니다 (즉, 무딘) 팁을 크게 씨앗의 처리 (그림 1A)을 용이하게한다. <ol><li> 발아 배지 30 ㎖를 포함하는 새로운 배양 접시 접시를 준비합니다. 매체에 두 개의 병렬 직사각형 멸균 왓트 3MM 논문 (; 그림 1B, 1 단계 1.5 cm × 1.0 cm)의 표면에 장소. 와트 만 3MM 종이는 오토 클레이브 멸균된다. </li><li> 멸균 포셉 (그림 1B, 2 단계)를 사용하여 와트 만 3MM 논문에 씨앗을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 절단 집게의 병렬 뭉툭한 팁을 (사용하여 종자를 눌러 와트 만 3MM 종이에 대한 개별 씨앗을 잡고 <st룽&gt; 그림 1B, 3 단계). </li><li> (12.7 mm하기 x 예 : U100 인슐린 주사기 + 1 ML의 주사기, 0.33 mm (29 G)) 주사기 바늘을 사용하여 종자의 종피 (종피와 배유를) 잘라 (그림 1B, 4 단계). 애기 장대 종자의 모양은 타원형이며 그것은 자엽 (즉 멀리 급진적 끝에서) 작은 뿌리에 가입하는 장소에 가능한 한 가까운 긴 반 주축을 따라 종피를 절단하는 것이 좋습니다. 이는 절개 과정의 다음 단계에서 배아의 안전 방출을 돕는다. </li><li> 절단 집게 (그림 1B, 5 단계)의 병렬 무딘 팁을 사용하여 와트 만 3MM 종이에 씨앗을 밀어 넣습니다. 이 단계는 3.4 단계 (그림 1B, 6 단계)에서 만든 구멍을 통해 종피 밖으로 배아를 해제합니다. 그것은 자엽의 끝이 작은 뿌리의 끝 부분에 가까운있는 씨앗 (즉, 멀리 FR의 강요를 적용하는 것이 좋습니다톰 개방). </li></ol> 4. 조립 종피 침구 분석 (SCBA) 종자 코트와 배아의 수의 적절한 선택을위한 설명을 참조하십시오. <ol><li> 발아 배지 30 ㎖를 포함하는 새로운 배양 접시 접시를 준비합니다. 매체의 표면에 놓으 나일론 메쉬의 멸균 사각형 조각 (3.5 cm x 5.0 cm) (그림 2, 1 단계). </li><li> 손상을 피하기 위하여, 태아와 시드 코트 부드럽게 주사기 바늘 (도 2, 단계 2)를 사용하여 밀어 포셉 금속 가장자리의 표면으로 이동 될 수있다. 이식란과 나일론 메쉬 (그림 2, 3 단계)에 씨앗 코트. </li><li> 씨앗 코트 최대한 근접하여 (그림 2, 4 단계)에 있는지 확인하고 무딘 집게와 바늘을 사용하여 종자 코트의 원형 단일 층을 조립합니다. 가능한 한 많이 노출하는 시​​도에 의해 생성 종피 개구위쪽 바늘. 이 단계는 체계적으로 테스트되지 않았습니다. 배아의 성장을 억제하는 확산 성 물질이 직접적으로 멀리에서 배아를 향해 확산 아닌 것으로 예상되기 때문에 그러나, SCBA의 효율을 높일 수있다. </li><li> 4.3 단계에서 조립 종피 침대의 중앙에 원형의 단일 층 (그림 2, 5 단계)로 배아를 놓습니다. 배아 최대한 근접하게되어 있는지 확인합니다. </li><li> 20 ~ 21 ℃에서 연속 광 (40 μmol / ㎡의 EC)에서 SCBAs을 품어 FR 펄스, 발아 체포 일반 조명 아래 SCBA 조립 한 바와 같이 FR 펄스 (9)을 적용하고 어둠 속에서 배양 접시를두고하는 데 사용되는 경우. </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 설명 된 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA) 절차는 원칙적으로 애기 장대 종자 발아가 차단 (또는 지연)와 배젖이 체포를 구현하기 위해 의심되는 모든 상황에 적용 할 수있다. 후자 종피 (종피 및 배유)를 제거하고 배아 종피 둘러싸여 때 상대 속도 배아 성장이 진행이 관찰한다는 관찰에 의해 입증 될 수있다. 발아는 특정 환경 물리적 매개 변수 (예를 들면 물 전위 또는 가벼운 질) 또...

애기 성숙한 종자, 종피가 종피, 산모 원 죽은 조직의 외부 층과, 배유, 직접 한 배아를 둘러싸고 살아있는 조직의 단일 셀 층으로 구성된다. 배유 및 배아는 별도의 수정 이벤트에서 파생 된 : 배아는 하나의 임산부와 한 아버지의 게놈 2 배체 조직 반면 배유는 임산부와 한 아버지의 게놈 2 개 배체 조직이다. 전통적 배유에 할당 된 주 기능은 영양 조직의 점이다. 그러나, 배유 또한 종자 발아를 제어하기위한 중심적인 역할을하는 것이 점차 명백 해지고있다. 이 개념은, 수면의 경우 새로 생성 된 씨앗에 의해 전시 특성 첫 번째 명백하게되었다. 휴면 종자 발아 유리한 조건의 존재에도 불​​구하고 발아하지 못한다. 씨앗은 숙성 기간 후 자신의 수면을 잃고 nondorman가유리한 발아 조건에 노출되었을 때 t, 즉, 그들은 발아합니다. 이 모델 식물 애기 장대를 포함한 많은 식물 종에서, 종피는 절대적으로 종피 제거 배아의 성장과 3,4 녹색화를 트리거 이후 휴면 종자의 발아를 방지하기 위해 필요합니다. 애기 장대에서 Bethke는 외. 발아 배유 5를 둘러싼 배젖을 유지하면서 종피를 제거한 후 남아 억압 된 것을 관찰했다. 이러한 관측은 강하게 배유 배아에 억압적인 활동을 발휘 종피 내에서 조직이라고 지적했다. 그러나, 시드 코트 제거 실험 반드시 종피 제공 발아 억압 활동의 본질을 명확히 않으며 구현 유전자를 식별하는 데 도움이되지 않는다. 우리는 최근에 씨앗 코트와 태아가 물리적으로 분리하지만 가까운 proxi에 보관 종피 침구 분석 (SCBA)를 도입Science AG로서는 배유 제공 억압 발아 활성은 6 유지되도록. SCBA는 휴면 nondormant 및 유전자 변형 종자 코트와 배아 재료의 조합 사용할 수 있습니다. 그 결과, 발아 구체적 배유 및 배아에서 동작을 제어하는​​ 유전자 경로는 해부 될 수있다. SCBA는 배유 6의 성장을 억제하기 위해 배아으로 식물 호르몬 아브 산 (ABA)를 출시 것을 보여주기 위해 수면 상태의 맥락에서 사용되었다. 또한 우리는 수면을 촉진하는 신호 배유에서 작동 경로와 배아 조직을 식별 할 SCBA를 사용할 수 있습니다. 발아를 제어하는​​ 배유의 역할은 더욱 작게 레드 (FR) 광의 펄스에 노출 nondormant 씨의 경우를 고려하여 강화 하였다. 초기 시드 imbibition에 FR 광 펄스는 발아 7,8을 억제하는 것으로 알려져있다. 종자 코트는 씨앗에서 FR 빛의 펄스를 제거 할 때강하게 배유도 nondormant 씨 (9)의 발아를 억제 할 수있는 제안, 발아를 억제 할 수 없습니다. 현저하게, SCBA는 발아의 FR-의존적 억제를 요점을 되풀이하는 데 사용할 수 있습니다. 이 종자 발아의 FR 의존 억제는 또한 배유 9 ABA 자료를 포함하는 과정입니다 것을 보여주기 위해 허용했다. 또한, SCBA는 배유 및 광 신호 9,10에 응답 nondormant 종자 발아를 제어하는 배아에서 동작 다른 광 신호 전달 경로를 식별 허용. SCBA 종자 발아의 제어의 맥락에서 배유의 기능을 탐구 확실한 기술 할 수에 따라서 나타난다. 또한 발아를 제어하기 위해 의심되는 유전자가 배유, 배아 또는 두 조직에서 작동 여부를 시험 관내에서 평가하는 강력한 도구입니다. 여기에 디테일이 SCBA를 조립하는 데 필요한 여러 단계를 우리는.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

애기 장대의 배유는 성숙한 배아를 둘러싸고 휴면 종자의 발아 또는 (FR)까지 붉은 빛 펄스에 의해 조사 nondormant 씨의 방지에 필수적인 역할을하는 하나의 세포 층으로 구성되어 있습니다. 더 배유에 의해 가해지는 발아 억압적인 활동의 기초가되는 분자 유전 학적 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해, &quot;종피 침구&quot;분석 (SCBA)를 고안했다. SCBA 물리적 씨앗 코트의 기본 레이어에 태아의 성장을 확인할 수 있도록 해줍니다 씨앗에서 씨앗 코트와 배아를 분리하는 절개 절차입니다. 현저하게, SCBA 종자 휴면 종자 발아의 FR 의존 제어의 맥락에서 종피의 발아 억압 활동을 재구성한다. SCBA는 휴면 nondormant 및 유전자 변형 종자 코트와 배아 재료, 발아를 제어하는​​ 유전자 경로의 조합 사용이 가능하며 특히 영업 이익 때문에배유 및 배아 erating 해부 할 수 있습니다. 여기서 세부 SCBA 조립 절차를 우리.

이전 작업은 GA를 합성 할 수없는 돌연변이 종자 씨앗 (11, 12)에서 높은 ABA 축적의 결과로 발아 할 수 없음을 보여 주었다. 그것의 제거가 배아의 성장 (13)을 트리거하기 때문에, 발아 할 수없는이 씨 외투가 필요합니다. 이 강력 GA를 합성 할 수없는 종자의 배유가 배아의 성장을 차단하는 ABA를 발표합니다 지적했다. 따라서 우리는 GA와 ABA를 합성 할 수없는 씨앗 코트와 달리 SCBA에서...

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A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다.

유전자 탐구하는 종피 침구 분석<em&gt; 체외</em&gt; 어떻게 배젖 컨트롤 종자 발아에<em&gt; 애기 장대</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

a-seed-coat-bedding-assay-to-genetically-explore-vitro-how-endosperm

Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.2K 조회수.  Université de Genève.  우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다. 

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Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

식물 표피의 생합성을 탐구 Arabidopsis eceriferum 돌연변이의 이용

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

연구

생물학

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

전체 종자 크기의 수지 섹션 및 응용 프로그램을 얻기위한 간단한 건조 단면 방법

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

복합 염분 응력이 종자 발아 및 내염성에 미치는 영향 분석 후추 분석 (고추 연감 L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

컨포칼 이미징을 통한 ERL1 동역학의 시공간 조사

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

저자 스포트라이트: 기공 계통 세포에서 막 이동 이벤트를 연구하기 위한 이미지 기반 방법  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay(FluoZin-3 분석을 통한 포유류 세포의 아연 수송 메커니즘 조사)

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

저자 스포트라이트: ZnT1 기능을 통한 세포 아연 조절 탐구 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...