この作品は、スイス国立科学財団からの補助金によって、ジュネーブ州によってサポートされていました。

SCBAが組み立てられると、胚の成長は、数日間にわたって監視される。したがって、SCBAのシード切開手順および組立前、人は、胚成長に対する種皮物質の効果の適切な評価を防ぐことができる将来の汚染を避けるために、種子を殺菌する必要がある。 1。種子消毒<ol><li> 1.5ミリリットルの微量遠心管に成熟し、乾燥したシロイヌナズナの種子の50〜60μLを注ぎ、70％エタノール溶液を調製する。 </li><li>種子を含有するマイクロ遠心チューブに70％エタノール溶液1mlを添加し、ボルテックスミキサーで1,200 rpmで10分間室温で振盪する。 </li><li>チューブの底に種を集中する4000×gで3秒間遠心マイクロチューブ。 </li><li>慎重に微量遠心チューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて70％エタノール溶液を吸引する。 </li><li> tまでの滅菌蒸留水1ミリリットルを追加<html>彼は、マイクロチューブは、まだ種を含む。 </li><li> 1,200 rpmで10分間室温で振盪する。 </li><li>チューブの底に種を集中する4000×gで3秒間遠心マイクロチューブ。慎重にチューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて水上清を吸引除去する。 </li><li>まだ種を含むマイクロ遠心チューブに滅菌水1mlの蒸留水を加える。水の流れが均一に管内の種を一時停止していることを確認してください。ここでの目標は、種子の整合性を維持するために、さらに揺れないようにすることです。 </li><li>種子は30秒間、まだチューブを残すことによって、チューブの底に重力によって落ち着くましょう。慎重にチューブの底に種子を残して真空吸引チップを用いて水上清を吸引除去する。 </li><li> 1.9 - 1.8ステップ4回繰り返します。全体的な滅菌処理には約30分かかります。 </li></ol> 2。シードメッキ「ontent&gt;その後の工程は、無菌状態を維持するために、層流キャビネット内で実行されています。 <ol><li> （N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES-KOH - ペトリ皿プレート2.5mMの2 4.3 g / Lのムラシゲとスコーグ培地を含む溶液をオートクレーブ処理することによって調製発芽培地30mlを含有する（直径100mm、高さ20mm）を準備; pHは5.7）と0.8グラム/ L寒天。溶液をペトリ皿プレート上に注ぐ前に、50℃の水浴で冷やす。 </li><li>種を含むチューブに滅菌蒸留水を200μlを加える。種を再懸濁し、1ミリリットルの先端で、標準的なピペットを用いて発芽培地の表面に転送します。 </li><li>真空吸引チップを用いて発芽培地の表面上に種子を周囲の水を除去する。 </li><li>さらなる乾燥のための2時間、層流キャビネット内の蓋なしで種を含むペトリ皿にしておきます。蓋をペトリ皿を閉じて、それが層流の下に放置約4時間後には種子消毒手順（ステップ1.2）の開始から経過したように、約90分間のキャビネット流れ。 </li></ol> 3。シード解剖次の手順は、層流フードキャビネット内部に配置された実体顕微鏡を扱う必要とする。切り捨てられた（ すなわち鈍）チップを備えたデュモンの鉗子＃5が大幅に種子（ 図1A）の対応が容易に行えます。 <ol><li>発芽培地の30ミリリットルを含む新しいペトリ皿プレートを準備します。ミディアム2並置長方形の無菌ワットマン3MMペーパー（; 図1B、ステップ1〜1.5センチメートル×1.0センチメートル）の表面に配置します。ワットマン3MM紙はオートクレーブ滅菌されています。 </li><li>滅菌ピンセット（ 図1B、ステップ2）を使用して、ワットマン3MMの紙に種を転送します。 </li><li>優しく切り捨て鉗子（の並置鈍チップを使用して、シードを押して、ワットマン3MM紙に対して個体の種子を開催<st栄&gt;図1B、ステップ3）。 </li><li> （12.7ミリメートルのX 例：U100インスリン注射器+ 1ミリリットルの注射器、0.33ミリメートル（29 G））注射針を使用した種子の種皮（種皮や胚乳）をカットし（ 図1B、ステップ4）。 シロイヌナズナ種子の形状は楕円形であり、それは子葉（ すなわち離れてラジカル先端から）幼根に接合されている場所にできるだけ近い最長半主軸に沿って種皮をカットすることをお勧めします。これは解剖手順の次の段階で胚の安全な解放を支援します。 </li><li>切り捨てられた鉗子（ 図1B、ステップ5）の並置鈍チップを使用してワットマン3MM紙に対する種子を押してください。このステップは、ステップ3.4（ 図1B、ステップ6）で作成された開口部を介して、種皮から胚を解放します。これは、子葉の先端が幼根の先端に最も近い内にあるシード（ すなわち離れてFR上のプッシュを適用することをお勧めしますOM開口部）。 </li></ol> 4。種皮寝具アッセイのアセンブリ（SCBA） 種皮と胚の数を適切に選択するための説明を参照してください。 <ol><li>発芽培地の30ミリリットルを含む新しいペトリ皿プレートを準備します。媒体の表面の上に置いて、ナイロンメッシュの無菌矩形 ​​片（3.5センチ×5.0センチメートル）（ 図2、ステップ1）。 </li><li>損傷を避けるために、胚および種皮を穏やかに注射針（ 図2、ステップ2）を用いてそれらを押すことによって、鉗子の金属縁部の表面に移動させることができる。ナイロンメッシュ（ 図2、ステップ3）に移植胚と種皮。 </li><li>シードコートは、可能な限り接近されます（ 図2、ステップ4）であることを確認して平滑化鉗子や針を用いて種皮の円形単層を組み立てます。可能な限り公開しようとすることで生成された種皮口上向きに針。このステップは、体系的にテストされていません。胚の増殖を阻害する拡散性物質が直接離れてから胚向かって拡散するよりもむしろことが予想されるので、それはSCBAの効率を高めることができる。 </li><li>ステップ4.3で組み立て種皮ベッド（ 図2、ステップ5）の中央に円形の単一層として胚を置きます。胚は可能な限り接近していることを確認してください。 </li><li> 20〜21℃での連続光（40μモル/ m 2の S EC）の下でSCBAsインキュベートFRパルスは、発芽を逮捕、通常の光の下でSCBAを組み立て、説明したように、FRパルス9を適用し、暗闇の中でシャーレを残すために使用されている場合には。 </li></ol>

<ol>
	<li>Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+testa+on+seed+dormancy,+germination,+and+longevity+in+Arabidopsis.">Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).</li><li>Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+the+endosperm+in+flowering+plants.">Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants.</a> Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).</li><li>Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).</li><li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+dormancy+and+the+control+of+germination.">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li><li>Bethke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+aleurone+layer+responds+to+nitric+oxide,+gibberellin,+and+abscisic+acid+and+is+sufficient+and+necessary+for+seed+dormancy.">The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy.</a> Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).</li><li>Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+seed+coat+bedding+assay+shows+that+RGL2-dependent+release+of+abscisic+acid+by+the+endosperm+controls+embryo+growth+in+Arabidopsis+dormant+seeds.">A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).</li><li>Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+A+and+Phytochrome+B+Have+Overlapping+but+Distinct+Functions+in+Arabidopsis+Development.">Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development.</a> Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).</li><li>Shinomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+spectra+for+phytochrome+A-+and+B-specific+photoinduction+of+seed+germination+in+Arabidopsis+thaliana.">Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+genetically+distinct+control+of+seed+germination+by+phytochromes+A+and+B.">Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B.</a> Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).</li><li>Lee, K. P., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+seed+germination+in+the+shade.">Control of seed germination in the shade.</a> Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+light+inhibits+germination+through+DELLA-dependent+stimulation+of+ABA+synthesis+and+ABI3+activity.">Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity.</a> EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).</li><li>Debeaujon, I., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin+requirement+for+Arabidopsis+seed+germination+is+determined+both+by+testa+characteristics+and+embryonic+abscisic+acid.">Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid.</a> Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).</li><li>Sun, T. P., Kamiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+GA1+locus+encodes+the+cyclase+ent-kaurene+synthetase+A+of+gibberellin+biosynthesis.">The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis.</a> Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).</li><li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+insertional+mutagenesis+of+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana.</a> Science. 301, 653-657 (2003).</li><li>Rook, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+sucrose-induction+mutants+reveal+the+modulation+of+sugar-induced+starch+biosynthetic+gene+expression+by+abscisic+acid+signalling.">Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling.</a> Plant J. 26, 421-433 (2001).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明する種皮寝具アッセイ（SCBA）手続きは、原則として、 シロイヌナズナ種子の発芽がブロック（または遅延）と胚乳がこの逮捕を実装するために疑われているどのような状況にも適用可能である。後者は、種皮（種皮や胚乳）を除去し、胚は種皮に囲まれているときと比較してより高速な胚成長が進行が認められていることを観察することによって証明することができます?...

シロイヌナズナ成熟種子において、種皮は種皮、母体起源の死んだ組織の外部層と、胚乳、胚芽、直接1を取り巻く生きている組織の単一細胞層から構成されている。胚乳および胚は、別々の受精イベントから派生されています。胚が1妊産婦と1父方ゲノム2と二倍体組織であるのに対し、胚乳は母親の2と1父方ゲノムと三倍体組織である。 伝統的に胚乳に割り当てられた主な機能は、栄養組織のものである。しかしながら、胚乳はまた、種子の発芽を制御するための中心的な役割を果たしていることがますます明らかになってきている。この概念は、休眠の場合には新たに生産、種子が示す特性最初に明らかになった。休眠種子は、良好な発芽条件が存在するにもかかわらず、発芽していない。種子は熟成期間後に休眠を失い、nondormanなる良好な発芽条件にさらされたときtは、 すなわち 、それらは発芽する。種皮の除去は、胚の成長と緑化3,4をトリガーするため、モデル植物シロイヌナズナを含む多くの植物種では、種皮が絶対的に休眠種子の発芽を防止するために必要とされる。 シロイヌナズナにおいて、Bethke らは、発芽が胚乳5を囲む胚乳を維持しながら種皮を除去した後に抑圧されたままであることを観察した。これらの観​​察は、胚乳が胚に対して抑制活性を発揮種皮内の組織であることを示した。しかし、種皮除去実験は必ずしも種皮が提供する発芽抑制活性の性質を明らかにしたり、それを実装する遺伝子を同定する助けていない。 我々は最近、種皮と胚を物理的に分離されますが、近いproxiに保存されてい種皮寝具アッセイ（SCBA）を導入公正妥当胚乳によって提供発芽抑制活性を6に維持されるようになっている。 SCBAは、休眠非休眠の、そして遺伝子組み換え種子コートおよび胚性材料の組み合わせを使用することができます。その結果、遺伝的経路の発芽を制御し、特に胚乳及び胚において動作を解剖することができる。 SCBAは胚乳6はその成長を抑制するために、胚に向かって植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）を放出することを示すために休眠の文脈で使用した。さらに私たちは、休眠を促進するため、胚乳や胚組織で動作してシグナル伝達経路を特定するためにSCBAを使用することができます。 発芽を制御するために、胚乳の役割は、（FR）遠赤色光のパルスにさらされる非休眠の種子の場合を考慮することによって強化された。初期の種子吸水時のFR光パルスは7,8発芽を阻害することが知られている。種皮は種子からのFR光のパルスを取り出した際に強く胚乳はまた、非休眠の種子の9の発芽を抑制することができることを示唆し、発芽を抑制することができませんでした。注目すべきことに、SCBAはまた、発芽のFR-依存性阻害を再現するために用いることができる。これは種子発芽のFR依存性阻害にも胚乳9からのABAの放出を伴うプロセスであることを示すことができました。さらに、SCBAは、胚乳と光の合図9,10に対応して非休眠の種子の発芽を制御するために、胚で動作し、異なる光シグナル伝達経路を特定することができました。 SCBAは、種子発芽の制御のコンテキストで胚乳の機能を探索するために信頼性の高い技術であることがありますので。また、発芽を制御するために疑われる遺伝子は胚乳、胚または両方の組織で動作するかどうかをin vitroで評価する強力なツールです。ここでは詳細はSCBAを組み立てるために必要な様々なステップを、私たち。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>To refer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusafe Comfort</td>
			<td>INTEGRA Biosciences AG</td>
			<td>158 310</td>
			<td>Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish plate (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH</td>
			<td>664 102</td>
			<td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5524</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (plant agar)</td>
			<td>Duchefa Biochemie B.V.</td>
			<td>P1001</td>
			<td>Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>BD Micro-Fine</td>
			<td>324827</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh (SEFAR NYTEX)</td>
			<td>SEFAR AG</td>
			<td>03-50/31</td>
			<td>Sefar AG, Heiden, Switzerland</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>CLF Plant Climatics</td>
			<td>Percival I-30BLLX</td>
			<td>CLF plant Climatics, Wertingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclobutrazol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46046</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seed coat bedding assay to genetically explore in vitro how the endosperm controls seed germination in arabidopsis thaliana

シロイヌナズナ胚乳は、成熟した胚を囲むと休眠種子の発芽や（FR）遠赤色光パルスで照射非休眠の種子のことを防止するための重要な役割を果たして、単一の細胞層から構成されています。さらに胚乳によって発揮される発芽抑制活性の基礎となる分子遺伝的メカニズムへの洞察を得るために、「種皮の寝具」アッセイ（SCBA）を考案した。 SCBAは種皮の下地層の上に胚の成長を監視することができ、物理的に種子から種皮と胚を分離する解剖手順です。驚くべきことに、SCBAは、種子休眠と種子発芽のFR-依存制御のコンテキストで種皮の発芽抑圧的な活動を再構成する。 SCBAは、休眠中の非休眠の遺伝子組み換え種皮と胚性材料、発芽を制御する遺伝的経路の組み合わせを使用することができ、具体的にはOP以来胚乳および胚におけるeratingを解剖することができます。ここでは詳細はSCBAを組み立てる手順を私たち。

以前の研究は、GAを合成できない変異体の種子は、種子11,12の高いABAの蓄積の結果として、発芽することができなかったことを示した。その除去は、胚の成長13をトリガするので、発芽することができないことは、種皮が必要です。このことは、GAを合成することができない種子の胚乳は、胚の成長をブロックするためにABAを放出していることを示した。そこで、GAとABAを合成?...

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A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

13.2K ビュー.  Université de Genève. 私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。 

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Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

生物学

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

全種サイズ樹脂断面の簡易ドライ断面化方法とその応用

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.)

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 varieties, which have large differences in salt tolerance, are employed as the study materials. Six mixed salt concentrations of 0, 3, 5, 10, 15, and 20 g/L derived using equal molar ratios of Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, and Na2SO4 are used. To determine their effects, the related indexes of seed germination, seedling growth, and physiology are measured, and salt tolerance is comprehensively evaluated using membership function analysis. The results show that as the mixed salt concentration increases, the germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, and root fresh weight of the two cultivars significantly decrease, whereas the relative salt rate gradually increases. The hypocotyl length and fresh weight aboveground increase first and then decrease, while the malondialdehyde (MDA), proline (Pro) content, catalase (CAT), peroxidase (POD), and superoxide dismutase (SOD) activity decrease and then increase. The germination potential, germination index, germination rate, seed germination vigor index, root length, root fresh weight, MDA and Pro content, and CAT activity of the Hongtianhu 101 seeds are higher than those of Xinxiang 8 for all salt concentrations employed here. However, hypocotyl length, fresh weight aboveground, and relative salt rate are lower in Hongtianhu 101 than in Xinxiang 8. The comprehensive evaluation of salt tolerance reveals that the total weighted values of the two membership function indexes increase first and then decrease as the mixed salt concentration increases. Compared with 5 g/L, which has the highest membership function value, the index under salt concentrations of 3 g/L, 10 g/L, and 15 g/L decreases by 4.7%-11.1%, 25.3%-28.3%, and 41.4%-45.1%, respectively. This study provides theoretical guidance for the breeding of salt-tolerant varieties of pepper and an analysis of the physiological mechanisms involved in salt tolerance and salt-tolerant cultivation.

Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper Capsicum annuum L.

The paper below presents a protocol for measuring seed germination, seedling growth, and physiological indexes of two pepper varieties with salinity tolerance differences in response to six mixed salt concentrations. This protocol can be used to evaluate the salt tolerance of pepper varieties.

種子発芽に及ぼす複合塩ストレスの影響の解析とトウガラシの耐 塩性分析

To determine the salt tolerance and physiological mechanism of pepper (Capsicum annuum L.) at the germination stage, the Hongtianhu 101 and Xinxiang 8 ...

共焦点イメージングによるERL1ダイナミクスの時空間的研究

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

著者スポットライト:気孔系統細胞における膜輸送イベントを研究するための画像ベースの方法  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

FluoZin-3アッセイによる哺乳類細胞における亜鉛輸送メカニズムの調査

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

著者スポットライト:ZnT1機能による細胞亜鉛制御の探索 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

In Vitro亜鉛輸送アッセイを用いた哺乳類亜鉛トランスポーターの特性評価(英語)

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...