אנו מודים לכל החברים במעבדה Kerscher על תמיכתם. אנו מודים למארק Hochstrasser לזן שמרי MHY3765. עבודה זו נתמכה על ידי NSF מענק 1051970 (לאישור) והווארד יוז רפואי במכון לתואר ראשון ומסעות מענק מונרו חוקרי גרנט תכנית (לES).

טיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים המתבטאים בתאי שמרי ניצנים בתנאים מקומיים 1. צמיחה של תאי שמרים ואינדוקציה של ביטוי חלבון (שונה מ 2) אופציונלי: השתמש וגריתמית תרבויות שמרים גדלו מבטאות חלבון של עניין במקום תרבויות-Induced גלקטוז שתפורטנה להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך תאים של גל + שמרי מתח עם קידוד פלסמיד-גלקטוז מושרה 6xHIS מתויג חלבון של בחירה. לדוגמה, ראה רשימת חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית המתאימה (SD-אורציל למשל) המכיל 2% סוכרוז. לדגור על 30 מעלות CO / N, מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות O / N, כך שהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מודדת 0.3 (OD 600 = 0.3) ב33 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית עם 2% סוכרוז. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס, רעד (Δ150 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התרבות הגיעה OD 600 = 0.8<html> -1.5, לגרום לביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מ&quot;ל של YEP 3x עם גלקטוז 6% (מתכון בטבלה מס &#39;1), לריכוז סופי של 1x YEP עם 2% גלקטוז. נפח הכולל של התרבות הוא כעת 50 מ&quot;ל. דגירה, רועד, על 30 מעלות צלזיוס במשך 5-6 שעות נוספות. הערה: יכול להיות מגוון נפח התרבות. בשלב 1.3, לדלל לשני שלישים מהנפח הסופי הרצוי. בשלב 1.4, להוסיף נפח הסופי השליש מ3x YEP / 6% גלקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של התרבות המושרית ו צנטריפוגות Δ150-200 600 יחידות OD של תאים במשך 5 דקות ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה עם 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS 1X עם מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ולהעביר צינור כובע בורג מ&quot;ל 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים 1 דקות ב15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד הקפאת תא גלולה בחנקן נוזלי, ואחריו תמוגה המיידית תא או אחסון ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol>&gt; 2. הומוגניזציה של תאי שמרים והפקה של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקפוא תא גלולה מהשלב הקודם, להוסיף 200 μl של חרוזי זכוכית חומצת שטף ו500 μl של חיץ תמוגה קר כקרח (מתכון בטבלה 1 או להשתמש במאגר תמוגה תא של בחירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה פיפטה מעלה ומטה. זה לא נדרש באופן מלא לresuspend תא גלולה. שמור צינורות על קרח בכל העת. הערה: סוף קצה פיפטה עשוי להיות מנותק לפני pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על 4 מעלות צלזיוס, מניח את הצינור (ים) עם תאים לתוך טחנת חרוז, שיווי המשקל, הנעילה, ולהפעיל את המכונה כהוראות יצרן לכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקצף חרוז המכיל את הצינור (ות) עבור 20 שניות ב 5.5 מ &#39;/ שנייה, ולאחר מכן מניח על קרח עכור דקות 1. חזור על 6x בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלבונים המופקים על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. אופציונלי: להסיר חלקיקים קטנים על ידי צנטריפוגה דרך פילטר SPINX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם של כל תא הדוארxtract (WCE) כדי לאשר את נוכחותו של החלבון של עניין על ידי כתם מערבי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף WCE מקביל עם 2 600 יחידות OD של תאים (לדוגמא 5 μl של תמצית תנוקה אם 200 600 יחידות OD של תאים נקצרו) ל -20% חומצת 800 μl Trichloroacetic (TCA). מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 2.5 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μl של 2% TCA לגלולה ומערבולת הצינור, ואחריו צנטריפוגה ל2.5 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 100 של חיץ מדגם TCA (מתכון בטבלה מס &#39;1), מערבולת לפזר גלולה. הערה: אם חיץ המדגם הופך להיות חומצי (הופך לצהוב) לאחר שבנוסף לגלולה, להוסיף aliquots של Δ10 טריס בסיס μl [1M] עד המדגם הוא כחול שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב100 ° C גוש חום במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת AGעין לפזר באופן מלא אם שאריות של גלולה עדיין קיימות. פלטות שהוכנו על ידי שיטה זו הן קשה לשמצה להמסה מלאה. זה עלול לקחת Δ10 דקות של vortexing לפזר כדורים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם בחנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד להקפיא aliquots של WCE שנותר פינה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 3. טיהור אצווה של חלבונים מhomogenates התא שהמרים הערה: שיטת טיהור זו הוטבה לטיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים על CO 2 + שרף זיקת מתכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדגם בWCE פינה הוכן מΔ20-40 600 יחידות OD של תאים, להוסיף 50-100 μl של שרף זיקה לצינור microcentrifuge. חלבונים המופקים מהתאים שלא מבטאים את החלבון הרצוי או שרף לא ספציפי, כגון amylose, עשויים לשמש כשליטהים לכריכה ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שרף 5x עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף: להפוך עליונה מעל לתחתית עד שרף הוא resuspended, ואז לסובב דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. לשאוב supernatant. הערה: אם מבצע חילוץ וטיהור באותו היום, ניתן לבצע איזון שרף לפני המיצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחייב חלבון לטיהור זיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100-200 μl של lysate פינה (Δ20-40 יחידות OD 600) ל50-100 חרוזים שטף μl, ולהביא את הנפח הכולל עד 1 מ&quot;ל עם חיץ תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם nutation או נדנדה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לשמור את דגימה של הנוזל העליון שנותר לניתוח שלאחר מכן של חלבונים מאוגד. TCA לזרז כמפורט לעיל לWCE (שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שרף עם חלבונים מאוגדים 5x עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, ואחרי ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב4 ° C. שמור דגימות קרות במהלך שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution של חלבונים Bound <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 חיץ elution μl לשרף, nutate על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C ולשמור את supernatant בצינור חדש. אופציונלי: חזור על 2x וelutions בריכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם eluted לכתם מערבי: עד 25 μl של חלבוני eluted, להוסיף 25 סולפט μl 2x ליתיום dodecyl (LDS) חיץ מדגם עם 2 μl β-mercaptoethanol (BME) ו דגירה ב100 מעלות צלזיוס גוש חום למשך 2 דקות. הערה: ניתן להשתמש גם בחיץ מדגם Laemmli 2X הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד חלבון eluted עודף הקפאה בחנקן נוזלי. אופציונלי: חלבונים שנותרו רצועה משרף עם נפח שווה של חיץ מדגם LDS 2x על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הסירו את חלבוני LDS-eluted לצינור חדש, ולאחר מכן להוסיף 2 BME μl לחלבוני eluted, לא לשרף. צו זה הוא למנוע ההסרה של כל יונים או נוגדני הconjugaטד את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מערבי ובדיקה עם נוגדנים מתאימים כדי להמחיש חלבונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10-20 μl (Δ1-3 יחידות OD 600) של כל דגימה ו3-10 μl של סולם חלבון בג&#39;ל-SDS של בחירה. ג&#39;לי בשימוש שגרתי עבור פרוטוקול זה כולל 4-12% Bis-טריס ו8% טריס-גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 200 V למשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מג&#39;ל לקרום PVDF על ידי העברת חצי יבשה ב19 V במשך 20-30 דקות (מתכון בטבלה מס &#39;1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרום בבלוק 4% milk/1x טריס נאגר מלוח-Tween (TBST) במשך שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C (מתכון בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן עיקרי לחלבון epitope מתויג עניין ב4% TBST milk/1x עבור 1-3 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBST 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם קרום מתאיםperoxidase המשני חזרת (HRP) מצומדות נוגדן ל1-3 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 3x במשך 15 דקות כל אחד בנפח גדול של TBST 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות עם קרום מצע ECL ולעטוף בניילון נצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הקרום לסרט ולפתח לדמיין חלבון. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת שלמה, ילידים, ולאחר translationally שונה חלבונים מתאי שמרי ניצנים עבור יישומים למטה הנחל. לפני שאנסה פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לקבוע אם החלבון של עניין ניתן לאתר בקלות בתמציות חלבונים שהוכנו תחת denaturing תנאי 12. אם נוגדני polyclonal אינם זמינים זה עש...

כוח האדיר של שמרי גנטיקה הוא אגדי, אבל ההכנה והניתוח של חלבוני ילידים משמרי ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הוא לעתים קרובות כרוכה בבעיות. האחרון הוא כתוצאה מהחוזק מכאני הניכר והאלסטיות של תא שמרי 1 הקיר. אמצעים שונים כבר תאר להאנזימטית, כימית, מכאני, ומבוסס לחץ השיבוש של תאי שמרים להשיג תמצית חלבון כל תא 2-6. טכניקות אלו משתנות במידה רבה ביעילותם להניב תמציות חלבוני תא נציגויות, ילידים שיכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן או צעדי טיהור. לדוגמה, ניתן להסיר את דופן תא השמרים עם אנזימים ממסים (למשל zymolyase) וכתוצאה מכך יכול spheroblasts להיות מופר על ידי גז, חומרי ניקוי, או תמוגה האוסמוטי לשחרר חלבונים. גישה זו כבר מועסק בהצלחה כנקודה מוצאת לחלוקות subcellular רבות אבל זה דורש incubations ארוךשאינם תואם את היציבות של חלבונים מסוימים 7. ריאגנטים תמוגה שמרי קנייניות (כגון חומרי ניקוי) למיצוי הכימי של חלבונים של תאי שמרים זמינים מסחרי, אבל היעילות של חומרים כימיים האלה במיצוי חלבון והשפעתם על האפיון ביוכימי הבא של חלבונים לא תמיד ברורה 8. homogenizers לחץ גבוה, המכונה לעתים קרובות לוחץ צרפתית, ביעילות לשבור תאי שמרים על ידי חשיפתם הראשונה ללחץ גבוה ולאחר מכן extruding אותם דרך פתח קטן בתא לחץ. טכניקה זו מייצרת תמציות באיכות גבוהות, אבל הציוד מאוד יקר ולא יכול להיות מתאים לכמויות קטנות של תאים או במספר רב של דגימות 9. לכן, הפרעה מכאנית של תאי שמרים בטחנת חרוז היא לעתים קרובות את שיטת בחירה של חלבון הכנות שמרי ילידים 10. טכניקה זו כרוכה בהפרעה מכאנית של דופן תא השמרים עם חומצה-WAלשפוך חרוזי זכוכית, אשר יכול להיות שנערכו עם מגוון רחב של המלשינים, vortexers או טחנות חרוזים. יש לציין, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעבד בו זמנית מספר רב של מדגמים קטנים יותר (1 מ&quot;ל של תאים או פחות). חרוזים שונים או מטריצות שיבוש טחנת חרוז זמינים מסחרי לשבש כמעט כל סוג של תא בסוג 2 צינורות מ&quot;ל עכשיו. בהתחשב בטכניקות ובציוד האחרות, יש טחנת חרוז יתרון נוסף שהשיבוש של תאי שמרים מתרחש מהר מאוד, מה שעוזר לשימור לאחר translational שינויים כגון sumoylation, במיוחד כאשר את המאגרים המתאימים עם פרוטאז ו / או מעכבי proteasome מנוצלים והטמפרטורה של תמציות נשלטת. פרוטוקול זה מתמקד בחילוץ המהיר, יעיל, ואמין של חלבונים אנדוגניים וביטוי יתר בתנאים עדינים עם המטרה הסופית לשמר את תפקוד חלבון, יחסי גומלין, ולאחר translational שינויים. תקשורת צמיחה, מאגר תמוגה תאקומפוזיציות והגדרות טחנת חרוז מותאמות לשמור על אינטראקציות חלבון ולאחר translational שינויים כגון sumoylation וubiquitylation.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast ORF strain in BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td></tr><tr><td>pYES2.1 TOPO vector</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td></tr><tr><td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &amp;micro;m (30-40 US sieve)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Use for additional filtering of clarified lysate</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Protein gel stain</td></tr><tr><td>Mammalian Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Alternative commercial lysis buffer</td></tr><tr><td>Anti-V5 agarose</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Method of immunoprecipitation</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>anti-myc antibody</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogenization ממכות חרוז הוא דרך מהירה ויעילה כדי לשחרר דנ&quot;א, רנ&quot;א, חלבונים ומטבוליטים מתאי שמרי ניצנים, שהם קשים לשמצה לשבש. כאן אנו מתארים את השימוש בטחנה homogenizer חרוז להפקת חלבונים לתוך המאגרים מותאמים לשמור את הפונקציות, אינטראקציות ולאחר translational שינויים של חלבונים. תאים גדלים וגריתמית המבטאים את החלבון של עניין הם גדלו בתקשורת צמיחה נוזלית של בחירה. את תקשורת הצמיחה עלולה להיות בתוספת חומרים כימיים כדי לגרום ביטוי חלבון מיזמים מושרים (למשל גלקטוז), לסנכרן את שלב מחזור תא (לדוגמא nocodazole), או לעכב פונקצית proteasome (למשל MG132). תאים אז pelleted וresuspended בחיץ מתאים המכיל פרוטאז ו / או מעכבי phosphatase ומעובדים או מייד או קפוא בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. Homogenization מושגת על ידי שישה מחזורים של 20 שניות ביהD-מכות (5.5 מ &#39;/ שנייה), כל אחד ואחריו דגירה דקה אחת על קרח. Homogenate כתוצאה מכך אינו מסומן על ידי צנטריפוגה וניתן להסיר חלקיקים קטנים על ידי סינון. כל תמצית התא פינה כתוצאה מכך (WCE) הוא זירז באמצעות 20% TCA לניתוח ישיר של חלבונים הכולל ב-SDS אחריו מערבי סופג. תמציות מתאימות גם לטיהור זיקה של חלבונים מסוימים, זיהוי של לאחר translational שינויים, או הניתוח של חלבוני שיתוף לטיהור. כמו במקרה של רוב פרוטוקולי טיהור חלבונים, אנזימים וחלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים ייחודיים או בהרכבי חיץ לטיהורם ואחרים עשויים להיות לא יציבים או לא מסיס בתנאים האמורים. במקרה האחרון, שהוצג הפרוטוקול עשוי לספק נקודת התחלה שימושית אמפירי כדי לקבוע את אסטרטגית חרוז המכות הטובה ביותר למיצוי חלבון וטיהור. אנחנו מראים את השאיבה וטיהור של epitope מתויג SUMO E3 האנזים, Siz1, מחזור תאמוסדר חלבון שהופך גם sumoylated וphosphorylated, כמו גם למקטע האנזים היוביקוויטין SUMO ממוקד, Slx5.

תוצאות הנציג שלנו מגלות כי פרוטוקול חילוץ חרוז מכות וחלבון תאר שימושי להכנה לשחזור של חלבונים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם (בטבלה 2). -SDS אחריו מכתים Coomassie של WCEs מראה כי מגוון רחב של חלבונים (~ 12 ל&gt; 250 KDA) ניתן לחלץ reproducibly מתאי שמרים (איור 1 א). להק?...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  The College of William & Mary.  הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים. 

Video: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biochemistry

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

ביטוי, טיהור, וליפוזום קשירה של שמרים מסוג SNX-BAR הטרודיורס

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

Genetics

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video