אנו מודים לכל החברים במעבדה Kerscher על תמיכתם. אנו מודים למארק Hochstrasser לזן שמרי MHY3765. עבודה זו נתמכה על ידי NSF מענק 1051970 (לאישור) והווארד יוז רפואי במכון לתואר ראשון ומסעות מענק מונרו חוקרי גרנט תכנית (לES).

טיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים המתבטאים בתאי שמרי ניצנים בתנאים מקומיים 1. צמיחה של תאי שמרים ואינדוקציה של ביטוי חלבון (שונה מ 2) אופציונלי: השתמש וגריתמית תרבויות שמרים גדלו מבטאות חלבון של עניין במקום תרבויות-Induced גלקטוז שתפורטנה להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך תאים של גל + שמרי מתח עם קידוד פלסמיד-גלקטוז מושרה 6xHIS מתויג חלבון של בחירה. לדוגמה, ראה רשימת חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית המתאימה (SD-אורציל למשל) המכיל 2% סוכרוז. לדגור על 30 מעלות CO / N, מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות O / N, כך שהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מודדת 0.3 (OD 600 = 0.3) ב33 מ&quot;ל של תקשורת סלקטיבית עם 2% סוכרוז. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס, רעד (Δ150 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התרבות הגיעה OD 600 = 0.8<html> -1.5, לגרום לביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מ&quot;ל של YEP 3x עם גלקטוז 6% (מתכון בטבלה מס &#39;1), לריכוז סופי של 1x YEP עם 2% גלקטוז. נפח הכולל של התרבות הוא כעת 50 מ&quot;ל. דגירה, רועד, על 30 מעלות צלזיוס במשך 5-6 שעות נוספות. הערה: יכול להיות מגוון נפח התרבות. בשלב 1.3, לדלל לשני שלישים מהנפח הסופי הרצוי. בשלב 1.4, להוסיף נפח הסופי השליש מ3x YEP / 6% גלקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של התרבות המושרית ו צנטריפוגות Δ150-200 600 יחידות OD של תאים במשך 5 דקות ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה עם 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS 1X עם מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ולהעביר צינור כובע בורג מ&quot;ל 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים 1 דקות ב15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד הקפאת תא גלולה בחנקן נוזלי, ואחריו תמוגה המיידית תא או אחסון ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol>&gt; 2. הומוגניזציה של תאי שמרים והפקה של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקפוא תא גלולה מהשלב הקודם, להוסיף 200 μl של חרוזי זכוכית חומצת שטף ו500 μl של חיץ תמוגה קר כקרח (מתכון בטבלה 1 או להשתמש במאגר תמוגה תא של בחירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה פיפטה מעלה ומטה. זה לא נדרש באופן מלא לresuspend תא גלולה. שמור צינורות על קרח בכל העת. הערה: סוף קצה פיפטה עשוי להיות מנותק לפני pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על 4 מעלות צלזיוס, מניח את הצינור (ים) עם תאים לתוך טחנת חרוז, שיווי המשקל, הנעילה, ולהפעיל את המכונה כהוראות יצרן לכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקצף חרוז המכיל את הצינור (ות) עבור 20 שניות ב 5.5 מ &#39;/ שנייה, ולאחר מכן מניח על קרח עכור דקות 1. חזור על 6x בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלבונים המופקים על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. אופציונלי: להסיר חלקיקים קטנים על ידי צנטריפוגה דרך פילטר SPINX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם של כל תא הדוארxtract (WCE) כדי לאשר את נוכחותו של החלבון של עניין על ידי כתם מערבי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף WCE מקביל עם 2 600 יחידות OD של תאים (לדוגמא 5 μl של תמצית תנוקה אם 200 600 יחידות OD של תאים נקצרו) ל -20% חומצת 800 μl Trichloroacetic (TCA). מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 2.5 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μl של 2% TCA לגלולה ומערבולת הצינור, ואחריו צנטריפוגה ל2.5 דקות ב 15,000 סל&quot;ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 100 של חיץ מדגם TCA (מתכון בטבלה מס &#39;1), מערבולת לפזר גלולה. הערה: אם חיץ המדגם הופך להיות חומצי (הופך לצהוב) לאחר שבנוסף לגלולה, להוסיף aliquots של Δ10 טריס בסיס μl [1M] עד המדגם הוא כחול שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב100 ° C גוש חום במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת AGעין לפזר באופן מלא אם שאריות של גלולה עדיין קיימות. פלטות שהוכנו על ידי שיטה זו הן קשה לשמצה להמסה מלאה. זה עלול לקחת Δ10 דקות של vortexing לפזר כדורים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם בחנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד להקפיא aliquots של WCE שנותר פינה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 3. טיהור אצווה של חלבונים מhomogenates התא שהמרים הערה: שיטת טיהור זו הוטבה לטיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים על CO 2 + שרף זיקת מתכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדגם בWCE פינה הוכן מΔ20-40 600 יחידות OD של תאים, להוסיף 50-100 μl של שרף זיקה לצינור microcentrifuge. חלבונים המופקים מהתאים שלא מבטאים את החלבון הרצוי או שרף לא ספציפי, כגון amylose, עשויים לשמש כשליטהים לכריכה ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שרף 5x עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף: להפוך עליונה מעל לתחתית עד שרף הוא resuspended, ואז לסובב דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. לשאוב supernatant. הערה: אם מבצע חילוץ וטיהור באותו היום, ניתן לבצע איזון שרף לפני המיצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחייב חלבון לטיהור זיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100-200 μl של lysate פינה (Δ20-40 יחידות OD 600) ל50-100 חרוזים שטף μl, ולהביא את הנפח הכולל עד 1 מ&quot;ל עם חיץ תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם nutation או נדנדה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לשמור את דגימה של הנוזל העליון שנותר לניתוח שלאחר מכן של חלבונים מאוגד. TCA לזרז כמפורט לעיל לWCE (שלב 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שרף עם חלבונים מאוגדים 5x עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, ואחרי ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב4 ° C. שמור דגימות קרות במהלך שוטף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elution של חלבונים Bound <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 חיץ elution μl לשרף, nutate על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ספין דקות 1 ב 5000 סל&quot;ד ב 4 ° C ולשמור את supernatant בצינור חדש. אופציונלי: חזור על 2x וelutions בריכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם eluted לכתם מערבי: עד 25 μl של חלבוני eluted, להוסיף 25 סולפט μl 2x ליתיום dodecyl (LDS) חיץ מדגם עם 2 μl β-mercaptoethanol (BME) ו דגירה ב100 מעלות צלזיוס גוש חום למשך 2 דקות. הערה: ניתן להשתמש גם בחיץ מדגם Laemmli 2X הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד חלבון eluted עודף הקפאה בחנקן נוזלי. אופציונלי: חלבונים שנותרו רצועה משרף עם נפח שווה של חיץ מדגם LDS 2x על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הסירו את חלבוני LDS-eluted לצינור חדש, ולאחר מכן להוסיף 2 BME μl לחלבוני eluted, לא לשרף. צו זה הוא למנוע ההסרה של כל יונים או נוגדני הconjugaטד את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות דגימות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מערבי ובדיקה עם נוגדנים מתאימים כדי להמחיש חלבונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10-20 μl (Δ1-3 יחידות OD 600) של כל דגימה ו3-10 μl של סולם חלבון בג&#39;ל-SDS של בחירה. ג&#39;לי בשימוש שגרתי עבור פרוטוקול זה כולל 4-12% Bis-טריס ו8% טריס-גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל הג&#39;ל על 200 V למשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מג&#39;ל לקרום PVDF על ידי העברת חצי יבשה ב19 V במשך 20-30 דקות (מתכון בטבלה מס &#39;1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרום בבלוק 4% milk/1x טריס נאגר מלוח-Tween (TBST) במשך שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C (מתכון בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן עיקרי לחלבון epitope מתויג עניין ב4% TBST milk/1x עבור 1-3 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBST 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם קרום מתאיםperoxidase המשני חזרת (HRP) מצומדות נוגדן ל1-3 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 3x במשך 15 דקות כל אחד בנפח גדול של TBST 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות עם קרום מצע ECL ולעטוף בניילון נצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הקרום לסרט ולפתח לדמיין חלבון. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת שלמה, ילידים, ולאחר translationally שונה חלבונים מתאי שמרי ניצנים עבור יישומים למטה הנחל. לפני שאנסה פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לקבוע אם החלבון של עניין ניתן לאתר בקלות בתמציות חלבונים שהוכנו תחת denaturing תנאי 12. אם נוגדני polyclonal אינם זמינים זה עש...

כוח האדיר של שמרי גנטיקה הוא אגדי, אבל ההכנה והניתוח של חלבוני ילידים משמרי ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הוא לעתים קרובות כרוכה בבעיות. האחרון הוא כתוצאה מהחוזק מכאני הניכר והאלסטיות של תא שמרי 1 הקיר. אמצעים שונים כבר תאר להאנזימטית, כימית, מכאני, ומבוסס לחץ השיבוש של תאי שמרים להשיג תמצית חלבון כל תא 2-6. טכניקות אלו משתנות במידה רבה ביעילותם להניב תמציות חלבוני תא נציגויות, ילידים שיכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן או צעדי טיהור. לדוגמה, ניתן להסיר את דופן תא השמרים עם אנזימים ממסים (למשל zymolyase) וכתוצאה מכך יכול spheroblasts להיות מופר על ידי גז, חומרי ניקוי, או תמוגה האוסמוטי לשחרר חלבונים. גישה זו כבר מועסק בהצלחה כנקודה מוצאת לחלוקות subcellular רבות אבל זה דורש incubations ארוךשאינם תואם את היציבות של חלבונים מסוימים 7. ריאגנטים תמוגה שמרי קנייניות (כגון חומרי ניקוי) למיצוי הכימי של חלבונים של תאי שמרים זמינים מסחרי, אבל היעילות של חומרים כימיים האלה במיצוי חלבון והשפעתם על האפיון ביוכימי הבא של חלבונים לא תמיד ברורה 8. homogenizers לחץ גבוה, המכונה לעתים קרובות לוחץ צרפתית, ביעילות לשבור תאי שמרים על ידי חשיפתם הראשונה ללחץ גבוה ולאחר מכן extruding אותם דרך פתח קטן בתא לחץ. טכניקה זו מייצרת תמציות באיכות גבוהות, אבל הציוד מאוד יקר ולא יכול להיות מתאים לכמויות קטנות של תאים או במספר רב של דגימות 9. לכן, הפרעה מכאנית של תאי שמרים בטחנת חרוז היא לעתים קרובות את שיטת בחירה של חלבון הכנות שמרי ילידים 10. טכניקה זו כרוכה בהפרעה מכאנית של דופן תא השמרים עם חומצה-WAלשפוך חרוזי זכוכית, אשר יכול להיות שנערכו עם מגוון רחב של המלשינים, vortexers או טחנות חרוזים. יש לציין, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעבד בו זמנית מספר רב של מדגמים קטנים יותר (1 מ&quot;ל של תאים או פחות). חרוזים שונים או מטריצות שיבוש טחנת חרוז זמינים מסחרי לשבש כמעט כל סוג של תא בסוג 2 צינורות מ&quot;ל עכשיו. בהתחשב בטכניקות ובציוד האחרות, יש טחנת חרוז יתרון נוסף שהשיבוש של תאי שמרים מתרחש מהר מאוד, מה שעוזר לשימור לאחר translational שינויים כגון sumoylation, במיוחד כאשר את המאגרים המתאימים עם פרוטאז ו / או מעכבי proteasome מנוצלים והטמפרטורה של תמציות נשלטת. פרוטוקול זה מתמקד בחילוץ המהיר, יעיל, ואמין של חלבונים אנדוגניים וביטוי יתר בתנאים עדינים עם המטרה הסופית לשמר את תפקוד חלבון, יחסי גומלין, ולאחר translational שינויים. תקשורת צמיחה, מאגר תמוגה תאקומפוזיציות והגדרות טחנת חרוז מותאמות לשמור על אינטראקציות חלבון ולאחר translational שינויים כגון sumoylation וubiquitylation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogenization ממכות חרוז הוא דרך מהירה ויעילה כדי לשחרר דנ&quot;א, רנ&quot;א, חלבונים ומטבוליטים מתאי שמרי ניצנים, שהם קשים לשמצה לשבש. כאן אנו מתארים את השימוש בטחנה homogenizer חרוז להפקת חלבונים לתוך המאגרים מותאמים לשמור את הפונקציות, אינטראקציות ולאחר translational שינויים של חלבונים. תאים גדלים וגריתמית המבטאים את החלבון של עניין הם גדלו בתקשורת צמיחה נוזלית של בחירה. את תקשורת הצמיחה עלולה להיות בתוספת חומרים כימיים כדי לגרום ביטוי חלבון מיזמים מושרים (למשל גלקטוז), לסנכרן את שלב מחזור תא (לדוגמא nocodazole), או לעכב פונקצית proteasome (למשל MG132). תאים אז pelleted וresuspended בחיץ מתאים המכיל פרוטאז ו / או מעכבי phosphatase ומעובדים או מייד או קפוא בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. Homogenization מושגת על ידי שישה מחזורים של 20 שניות ביהD-מכות (5.5 מ &#39;/ שנייה), כל אחד ואחריו דגירה דקה אחת על קרח. Homogenate כתוצאה מכך אינו מסומן על ידי צנטריפוגה וניתן להסיר חלקיקים קטנים על ידי סינון. כל תמצית התא פינה כתוצאה מכך (WCE) הוא זירז באמצעות 20% TCA לניתוח ישיר של חלבונים הכולל ב-SDS אחריו מערבי סופג. תמציות מתאימות גם לטיהור זיקה של חלבונים מסוימים, זיהוי של לאחר translational שינויים, או הניתוח של חלבוני שיתוף לטיהור. כמו במקרה של רוב פרוטוקולי טיהור חלבונים, אנזימים וחלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים ייחודיים או בהרכבי חיץ לטיהורם ואחרים עשויים להיות לא יציבים או לא מסיס בתנאים האמורים. במקרה האחרון, שהוצג הפרוטוקול עשוי לספק נקודת התחלה שימושית אמפירי כדי לקבוע את אסטרטגית חרוז המכות הטובה ביותר למיצוי חלבון וטיהור. אנחנו מראים את השאיבה וטיהור של epitope מתויג SUMO E3 האנזים, Siz1, מחזור תאמוסדר חלבון שהופך גם sumoylated וphosphorylated, כמו גם למקטע האנזים היוביקוויטין SUMO ממוקד, Slx5.

תוצאות הנציג שלנו מגלות כי פרוטוקול חילוץ חרוז מכות וחלבון תאר שימושי להכנה לשחזור של חלבונים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם (בטבלה 2). -SDS אחריו מכתים Coomassie של WCEs מראה כי מגוון רחב של חלבונים (~ 12 ל&gt; 250 KDA) ניתן לחלץ reproducibly מתאי שמרים (איור 1 א). להק?...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K Views.  The College of William & Mary.  הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים. 

Video: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...