우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 저희는 효모 균주 MHY3765에 대한 마크 Hochstrasser 감사합니다. 이 작품은 NSF 교부금 1,051,970 (OK)로와 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 여행 그랜트 먼로 학자 프로그램 그랜트 (ES를)에 의해 지원되었다.

기본 조건에서 발아 효모 세포에서 발현 6xHIS - 태그 단백질의 정제 1. 단백질 발현의 효모 세포와 유도의 성장 (2에서 수정) 선택 사항 : 관심 대신 아래에 설명 된 갈락토스에 의한 문화의 단백질을 표현 대수 성장 효모 배양을 사용합니다. <ol><li> 플라스미드 인코딩 갈락토오스 유도 선택의 단백질 6xHIS - 태그와 함께 걸 + 효모 균주의 세포를 변환 할 수 있습니다. 예를 들어, 시약 목록을 참조하십시오. </li><li> 2 % 자당을 포함하는 적절한 선택 배지 5 ㎖ (예 : SD-우라실)에 형질 전환을 접종. 30 ° CO / N, 회전을 품다. </li><li> 600 nm에서 광학 밀도가 2 % 자당과 선택 배지 33 ㎖에 0.3 (= 0.3 OD 600)를 측정하므로 O / N 문화를 희석. (Δ150 RPM) 흔들어, 30 ° C에서 성장. </li><li> 문화 OD 600 = 0.8에 도달했을 때-1.5, 2 % 갈 락토 가진 1x YEP의 최종 농도 6 %의 갈락토스 (표 1 레시피)과 배 YEP의 17 ML을 추가하여 원하는 단백질의 발현을 유도. 전체 문화 볼륨 지금은 50 ML이다. 부화, 추가로 5-6 시간 동안 30 ° C에서 떨고. 참고 : 문화 볼륨이 변경 될 수 있습니다. 원하는 최종 볼륨의 3 분의 2로 단계 1.3, 희석을합니다. 단계 1.4에서 배 YEP / 6 % 갈락토스의 3 분의 1의 최종 볼륨을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 5,000 rpm에서 5 분 동안 유도 문화와 원심 분리기 세포의 Δ150-200 OD 600 단위의 OD 600을 측정 </li><li> 1X 프로테아제 억제제 칵테일 2 ML 나사 캡 튜브로 전송과 1 ML 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 1 분간 세포를 원심 분리기 ° C. 가만히 따르다 뜨는을. </li><li> -80에서 즉시 세포 용해 또는 저장 ° C 더 사용할 때까지 다음, 액체 질소에 동결 세포 펠렛을 끼 웁니다. </li></ol><ol><li> 이전 단계에서 냉동 세포 펠렛으로, 산 세척 유리 구슬 200 μL와 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 500 μl를 (표 1, 선택의 세포 용해 버퍼를 사용 제조법)을 추가합니다. </li><li> 간단히 피펫 아래. 그것은 완전히 세포 펠렛을 resuspend을 할 필요가 없습니다. 항상 얼음에 튜브를 유지한다. 참고 : 피펫 팁의 끝 부분과 위아래로 pipetting 전에 잘릴 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에, 장소 비드 밀, 균형, 잠금, 별, 제조업체의 지침에 따라 컴퓨터를 실행에 세포 튜브 (들). </li><li> 5.5에서 20 초 동안 튜브 (들)을 포함하는 비드 비터 미터 / 초, 후 1 분 동안 녹은 얼음에 배치를 실행합니다. 총 배 반복합니다. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 15 분간 원심 분리하여 추출 된 단백질을 취소 ° C. 선택 사항 : SpinX 필터를 통해 원심 분리하여 작은 입자를 제거합니다. </li><li> 전체 세포 전자의 샘플을 준비서양 얼룩에 의해 관심의 단백질의 존재를 확인하기 위해 (WCE) xtract : <ol><li> 800 ㎕의 20 % 삼염화 초산 (TCA)에 대한 세포의 2 OD 600 단위 (삭제 추출물 등 5 μL 세포의 200 OD 600 단위를 수확 한 경우)와 해당 WCE 추가 할 수 있습니다. 혼합하는 소용돌이. </li><li> 4 ℃에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다. </li><li> 4에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 한 다음 펠렛와 소용돌이 튜브 TCA 2 %의 800 μL, ° C. 추가 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다. </li><li> TCA 샘플 버퍼 100 μL (표 1 레시피), 펠릿을 용해하는 소용돌이를 추가합니다. 참고 : 샘플 버퍼 펠렛에 추가 한 후 (노란색으로 변) 산성되면, Δ10 μL 트리스베이스의 분주 추가 [1M] 샘플이 다시 파란색까지. </li><li> 2-5 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어. </li><li> 소용돌이 AG펠렛의 잔해가 여전히 존재하는 경우 아인 완전히 용해합니다. 이 방법에 의해 제조 펠렛 완전히 용해 악명 어렵습니다. 완전히 알약을 용해 소용돌이로의 Δ10 분 걸릴 수 있습니다. </li><li> -80에서 보관 샘플 ° C 더 사용할 때까지. </li></ol></li><li> 더 이상 사용할 때까지 -80에서 액체 질소와 저장소에 남아있는 삭제 WCE ° C의 분주 동결 웁니다. </li></ol> 3. 효모 세포 균질 액에서 단백질의 일괄 정화 참고 :이 정화 방법은 CO 2 + 금속 친 화성 수지에 6xHIS - 태그 단백질의 정제에 최적화되었다. <ol><li> 수지 평형 <ol><li> 세포의 Δ20-40 OD 600 단위에서 준비 삭제 WCE의 샘플은 microcentrifuge 관에 친 화성 수지의 50-100 μl를 추가합니다. , 원하는 단백질 또는 아밀로오스와 같은 비특이적 수지를 표현하지 않은 세포에서 추출한 단백질은 대조군으로 사용할 수 있습니다특이 바인딩의. </li><li> 세척 버퍼 1 ML과 배 수지를 세척 : 상단에 바닥 반전 수지는 현탁 한 후 4시에 5,000 rpm에서 1 분간 회전 될 때까지 ° C. 뜨는을 대기음. 참고 : 같은 날에 추출 및 정제를 수행하는 경우, 수지 평형을 추출하기 전에 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 친화력 정화를위한 단백질 바인딩 <ol><li> 50-100 μL 세척 구슬로 클리어 해물 100-200 μl를 (Δ20-40 OD 600 단위)를 추가하고 용해 버퍼 1 ML에 총 볼륨을 가져옵니다. </li><li> 2-5 시간 동안 4에서 장동 또는 흔들 ° C로 품어. </li><li> 4 ℃에서 5,000 rpm에서 1 분간 회전 </li><li> 원하는 경우, 언 바운드 단백질의 후속 분석을 위해 남은 상층 액의 샘플을 저장합니다. TCA는 WCE (단계 2.6)에 대한 상기 설명 된대로 침전. </li><li> 5,000 rpm에서 1 분 동안 회전 한 다음 세척 버퍼 1 ML과 함께 배에 바인딩 단백질과 수지를 씻어4 ° C. 세척하는 동안 샘플 차가운 유지하십시오. </li></ol></li><li> 바인딩 단백질의 용출 <ol><li> 4에서 수지 nutate을 150 μL 용출 버퍼를 추가 ° 5 분 C, 4 5,000 rpm에서 1 분간 회전 ° C와 새로운 튜브에 뜨는을 저장합니다. 옵션 : 2X와 풀 elutions를 반복합니다. </li><li> 서양 얼룩에 대한 용출 샘플을 준비 용출 된 단백질의 25 μL에와 25 μL 2X 리튬 도데 실 황산 (LDS) 샘플 버퍼를 추가 2 μL β-메르 캅 토 에탄올 (BME) 2 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어.에게 참고 : 표준 2X Laemmli에 샘플 버퍼를 사용할 수도 있습니다. </li><li> 액체 질소에 동결 초과 용출 단백질을 끼 웁니다. 선택 사항 : 65 배 LDS 샘플 버퍼의 동일한 볼륨 수지 스트립 나머지 단백질 ° C 5 분, 새로운 튜브에 LDS-용출 단백질을 제거한 다음이 아닌 수지, 용출 된 단백질에 2 μL BME를 추가합니다. 이 순서는 conjuga 어떤 이온 항체의 제거를 방지하는 것입니다비즈 테드. </li><li> -80 ° C 더 사용할 때까지 매장 샘플. </li></ol></li><li> 적절한 항체와 서양 얼룩 및 프로브 단백질을 시각화합니다. <ol><li> 각 샘플의 20 μl를 (Δ1-3 OD 600 대)과 선택의 SDS-PAGE 젤의 단백질 사다리의 3-10 μl를로드합니다. 정기적으로이 프로토콜에 사용되는 젤 4-12% 비스 - 트리스 8 % 트리스 - 글리신 있습니다. </li><li> 50 분 동안 200 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 (표 1의 조리법)를위한 19 V에서 세미 드라이 송금 젤에서 PVDF 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> 4 % milk/1x 트리스 블록 막 4 ° C (표 1 레시피)에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 식염수 TWEEN (TBST)를 버퍼. </li><li> 4 ° C.에서 RT 또는 O / N에서 1-3 시간 동안 4 % milk/1x의 TBST에 대한 관심의 항원 - 태그 단백질 일차 항체로 막을 배양 </li><li> 5 분 1X TBST로 각각 3 배 막 씻으십시오. </li><li> 적절한로 막을 배양보조 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 복합 RT에서 1-3 시간 동안 항체. </li><li> 1X TBST의 큰 볼륨 15 분 각 배 막 씻으십시오. </li><li> 사란 랩 ECL 기판과 랩으로 막 커버. </li><li> 필름 막 노출하고 단백질을 시각화하기 위해 개발. </li></ol></li></ol>

<ol>
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저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 그대로, 네이티브의 준비에 초점을 맞추고, 사후 translationally 다운 스트림 응용 프로그램의 신진 효모 세포에서 단백질을 수정했습니다. 이 프로토콜을 시도하기 전에, 그것은 관심의 단백질이 쉽게 상태에게 12 변성에서 준비 단백질 추출물에서 발견 할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 클론 항체를 사용할 수없는 경우는 융합 단백질은 서양 말에서 감지 할 수 있도록...

효모 유전학의 최고 힘은 전설이지만, 신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의,에서 네이티브 단백질의 준비 및 분석은 종종 문제가 고민입니다. 후자는 상당한 기계적 강도와 효모 세포벽 1의 탄력성 때문이다. 다른 방법은 효소, 화학, 기계, 압력 기반의 전체 세포 단백질 추출물 2-6를 얻기 위해 효모 세포의 파괴에 대해 설명하고있다. 이 기술은 이후의 분석이나 정제 단계에 사용할 수있는 휴대 대표 네이티브 단백질 추출물을 산출하기 위해 효능 널리 다릅니다. 예를 들어, 효모 세포벽은 세포 용해 효소 (예 : zymolyase) 및 결과 spheroblasts으로 제거 할 수는 전단, 세제, 또는 단백질을 해제 삼투 용해에 의해 중단 될 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 많은 세포 내 fractionations의 시작 지점으로 고용하지만 긴에서 incubate을 필요로하고있다일부 단백질 7의 안정성과 호환되지 않습니다. 효모 세포의 단백질의 화학적 추출을위한 독자적인 효모 용해 시약 (예 : 세제)를 상업적으로 사용할 수 있지만이 단백질 추출 시약 및 단백질의 후속 생화학 적 특성에 미치는 영향의 효과는 항상 8 명확하지 않습니다. 자주 프랑스어 프레스로 불리는 고압 균질는 효과적으로 최초의 고압에게 복종하고 압력 셀에있는 작은 구멍을 통해 그들을 압출하여 효모 세포를 휴식. 이 기술은 높은 품질의 추출물을 생산하지만, 장비는 매우 고가이며, 세포 또는 여러 샘플 9 소량 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비드 밀 효모 세포의 기계적 장애는 종종 기본 효모 단백질 제제 10에 대한 선택의 방법입니다. 이 기술은 산 워싱턴 주와 효모 세포 벽의 기계적 장애를 포함셰이커, vortexers 또는 비드 공장의 다양한 수행 할 수 유리 구슬을 흘렸다. 특히이 방법은 동시에 여러 작은 샘플 (세포 이하 1 ㎖)을 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 많은 다른 구슬 또는 구슬 밀 중단 매트릭스는 이제 2 ㎖ 튜브에 세포 유형의 거의 모든 종류를 방해하는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 다른 기술과 장비를 고려, 비드 밀 단백 분해 효소 및 / 또는 프로 테아 억제제의 적절한 버퍼를 활용하고, 특히 효모 세포의 파괴와 같은 sumoylation로 번역 후 수정 사항을 보존하는 데 도움이 매우 빠르게 발생하는 추가 이점이 있습니다 및 추출물의 온도 제어됩니다. 이 프로토콜은 단백질 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하는 궁극적 인 목표와 부드러운 상태에서 내생 이상 발현 단백질의 빠르고 효과적이며 신뢰할 수있는 추출에 초점을 맞추고 있습니다. 성장 매체, 세포 용해 버퍼조성 및 비드 밀 설정은 단백질 상호 작용과 같은 sumoylation와 ubiquitylation로 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

구슬을 쳐서 균질화 방해 악명 어려운 신진 효모 세포에서 DNA, RNA, 단백질 및 대사 산물을 해제하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 여기에서 우리는 기능, 상호 작용과 단백질의 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화 된 버퍼로 단백질의 추출을위한 비드 밀 균질의 사용을 설명합니다. 관심의 단백질을 발현 대수 성장 세포 선택 액상 성장 미디어에서 재배된다. 성장 매체를 유도 프로모터 (예 : 갈락토스)에서 단백질 발현을 유도하는 약으로 보충 할 수 있습니다 (예 : nocodazole) 세포주기 단계를 동기화하거나 (예 : MG132) 프로 테아 기능을 억제. 세포는 침전 및 분해 효소 및 / 또는 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 적절한 버퍼에 재현 탁하고도 즉시 처리 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 냉동. 균질화은 20 초 BEA의 여섯 사이클에 의해 수행됩니다D-구타 (5.5 m / 초), 얼음의 한 분 배양 한 다음 각. 결과 균질는 원심 분리에 의해 제거되고 작은 입자는 여과에 의해 제거 할 수 있습니다. 결과 삭제 전체 세포 추출물 (WCE)은 웨스턴 블롯 다음 SDS-PAGE로 전체 단백질의 직접적인 분석을 위해 TCA 20 %를 사용하여 침전된다. 추출물은 특정 단백질의 친화력 정화, 번역 후 수정 또는 공동 정화 단백질의 분석의 검출에 적합하다. 대부분의 단백질 정화 프로토콜의 경우와 같은 일부 효소와 단백질은 정제 및 다른 사람을위한 유일한 조건이나 버퍼 조성물에 명시된 조건을 불안정하거나 용해 할 수 필요할 수 있습니다. 후자의 경우, 제시된 프로토콜은 경험적으로 단백질 추출 및 정제를위한 가장 비드를 제패 전략을 결정하는 데 유용한 출발점을 제공 할 수 있습니다. 우리는 에피토프 태그가 SUMO E3 리가, Siz1, 세포주기의 추출 및 정제를 보여Slx5, sumoylated 및 인산화뿐만 아니라, SUMO-대상 유비퀴틴 리가 소단위 모두되어 단백질을 규제.

우리의 대표적인 결과를 설명 비드 구타와 단백질 추출 프로토콜 스트림 응용 프로그램 (표 2에 요약)의 다양한 단백질의 재현성 준비에 유용 밝히지. WCEs의 쿠마시 염색 이어 SDS-PAGE 단백질 (~ 12&gt; 250 kDa의)의 넓은 범위 재현성 효모 세포 (그림 1A)에서 추출 할 수 있음을 보여줍니다. 분자량의 범위 이산 밴드는 양질의 단백질 추출물의 지표입니다. 추출물의 품질은 서양 ?...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.8K 조회수.  The College of William & Mary.  높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다. 

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

단백질 상호 작용을 발견하고 HaloTag 기술을 사용하여 단백질의 기능을 특성화

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...