Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Kerscher por su apoyo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser para la cepa de levadura MHY3765. Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF 1051970 (para bien) y el Instituto Médico Howard subvención Pregrado Viajes y Monroe Académicos Programa de Subvenciones (a ES).

Purificación de proteínas marcadas con 6xHis expresadas en células de levadura en ciernes en condiciones nativas 1. Crecimiento de células de levadura y la inducción de la expresión de la proteína (Modificado de 2) OPCIONAL: Usa logarítmicamente crecientes cultivos de levaduras que expresan la proteína de interés en lugar de los cultivos inducidos por galactosa se describen a continuación. <ol><li> Transformar células de una cepa de levadura Gal + con un plásmido que codifica una proteína inducible por galactosa de elección 6xHis de etiquetado. Por ejemplo, véase la lista de reactivos. </li><li> Inocular transformantes en 5 ml de medios selectivos apropiados (por ejemplo, SD-uracilo) que contiene 2% de sacarosa. Se incuba a 30 ° CO / N, rotación. </li><li> Diluir cultivo O / N de modo que la densidad óptica a 600 nm mide 0,3 (DO600 = 0,3) en 33 ml de medio selectivo con 2% de sacarosa. Crecer a 30 º C, agitando (Δ150 rpm). </li><li> Cuando el cultivo alcanzó una DO600 = 0,8-1,5, Inducir la expresión de la proteína deseada mediante la adición de 17 ml de YEP 3x con 6% de galactosa (receta en la Tabla 1), para una concentración final de 1x YEP con 2% de galactosa. Cultura volumen total es ahora de 50 ml. Incubar, agitación, a 30 ° C para un 5-6 horas más. Nota: el volumen de cultivo se puede variar. En la etapa 1.3, diluido en dos terceras partes de el volumen final deseado. En la etapa 1.4, añadir un tercio del volumen final de 3x YEP / 6% de galactosa. </li><li> Mida la OD 600 de la cultura inducida y centrifugar Δ150-200 OD 600 unidades de células durante 5 minutos a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento de células con 1 ml de PBS enfriado en hielo con 1x 1x cóctel inhibidor de proteasa y transferir a un tubo con tapón de 2 ml de tornillo. </li><li> Centrifugar las células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante. </li><li> Snap congelación sedimento de células en nitrógeno líquido, seguido por la lisis celular inmediata o de almacenamiento a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol><ol><li> Para el sedimento celular congelado de la etapa anterior, añadir 200 l de perlas de vidrio lavadas con ácido y 500 l de tampón de lisis enfriado en hielo (receta en la Tabla 1 o utilizar tampón de lisis celular de elección). </li><li> Brevemente pipeta hacia arriba y abajo. No es necesario para resuspender completamente el sedimento celular. Mantenga los tubos en hielo en todo momento. Nota: El extremo de la punta de la pipeta puede ser cortada antes de pipetear arriba y hacia abajo. </li><li> A 4 ° C, el lugar del tubo (s) a las células en el molino de bolas, el equilibrio, la cerradura, y ejecutar la máquina según las instrucciones del fabricante. </li><li> Ejecute el batidor del grano que contiene el tubo (s) durante 20 segundos a 5,5 m / seg, a continuación, colocar en hielo fangoso por 1 min. Repetir 6 veces en total. </li><li> Borrar las proteínas extraídas por centrifugación durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: eliminar pequeñas partículas por centrifugación a través de un filtro spinx. </li><li> Prepare una muestra de toda la célula eXtract (EBB) para confirmar la presencia de la proteína de interés mediante Western Blot: <ol><li> Añadir WCE correspondiente con 2 unidades de DO 600 de células (por ejemplo, 5 l de extracto aclarado si se cosecharon 200 OD 600 unidades de células) a 800 l 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para mezclar. </li><li> Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento. </li><li> Añadir 800 l de TCA al 2% a la pastilla y el tubo de vórtice, seguido por centrifugación durante 2.5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento. </li><li> Añadir 100 l de TCA al tampón de muestra (receta en la Tabla 1) y agitar para disolver el precipitado. Nota: Si el tampón de muestra se convierte en ácida (se vuelve amarilla) después de la adición al sedimento, añadir alícuotas de Δ10 l Tris base [1M] hasta que la muestra es de color azul de nuevo. </li><li> Incubar en un bloque de 100 ° C de calor para 2-5 min. </li><li> Vortex again se disuelva completamente si los restos de pellets siguen presentes. Gránulos preparados por este método son notoriamente difíciles de disolver completamente. Puede tomar Δ10 min de agitación para disolver completamente pellets. </li><li> La tienda de la muestra a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> Snap congelar alícuotas de permanecer WCE despejado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 3. La purificación por lotes de proteínas de homogeneizados de células de levadura Nota: Este método de purificación se ha optimizado para la purificación de las proteínas marcadas con 6xHis de Co 2 + resina de afinidad de metal. <ol><li> Resina Equilibrio <ol><li> Para una muestra de WCE aclarado preparado a partir de Δ20-40 OD 600 unidades de células, añadir 50-100 l de resina de afinidad a un tubo de microcentrífuga. Las proteínas extraídas a partir de células que no expresan la proteína deseada o una resina no específica, tales como amilosa, se pueden usar como controls para la unión no específica. </li><li> Lavar la resina 5x con 1 ml de tampón de lavado: invertir arriba-más de fondo hasta que se vuelve a suspender la resina y, a continuación, girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Nota: si se realiza la extracción y purificación en el mismo día, el equilibrado de resina se puede realizar antes de la extracción. </li></ol></li><li> Binding Protein para purificación por afinidad <ol><li> Añadir 100-200 l de lisado aclarado (Δ20-40 OD 600 unidades) a 50-100 l perlas lavadas, y llevar el volumen total a 1 ml con tampón de lisis. </li><li> Incubar con nutación o mecedora a 4 ° C durante 2-5 horas. </li><li> Haga girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Si lo desea, guarde una muestra del sobrenadante restante para el análisis posterior de las proteínas no fijadas. TCA precipitar como se detalló anteriormente para el WCE (paso 2.6). </li><li> Lavar la resina con proteínas unidas 5x con 1 ml de tampón de lavado, seguidos de un centrifugado durante 1 minuto a 5000 rpm a4 ° C. Mantener las muestras frías durante el lavado. </li></ol></li><li> La elución de las proteínas unidas <ol><li> Añadir 150 l de tampón de elución a la resina, titubear a 4 ° C durante 5 minutos, centrifugado durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C y guardar el sobrenadante en un nuevo tubo. OPCIONAL: Repetir 2x y eluciones piscina. </li><li> Preparar muestra eluida de Western blot: Para 25 l de proteínas eluidas, añadir 25 l 2x dodecil sulfato de litio (LDS) tampón de muestra con 2 l β-mercaptoetanol (BME) y se incuba en un bloque de 100 ° C de calor durante 2 min. Nota: 2X tampón de muestra de Laemmli estándar también se puede utilizar. </li><li> Snap congelación exceso de proteína eluida en nitrógeno líquido. OPCIONAL: proteínas restantes tiras de resina con un volumen igual de 2x tampón de muestra LDS a 65 ° C durante 5 min, eliminar las proteínas SUD-eluidas a un tubo nuevo, a continuación, añadir 2 l BME a las proteínas eluidas, no a la resina. Esta orden es para evitar la retirada de cualesquiera iones o anticuerpos que son conjugaciónted a las perlas. </li><li> Almacene las muestras a -80 ° C hasta nuevo uso. </li></ol></li><li> Western Blot y la sonda con los anticuerpos apropiados para visualizar las proteínas. <ol><li> Cargar 10-20 l (Δ1-3 600 unidades de DO) de cada muestra y 3-10 l de una escalera de proteína en un gel de SDS-PAGE de elección. Los geles utilizados habitualmente para este protocolo son, entre 4-12% Bis-Tris y el 8% Tris-glicina. </li><li> Ejecutar en gel a 200 V durante 50 min. </li><li> Transferir las proteínas a partir de gel a una membrana de PVDF mediante transferencia semiseca a 19 V durante 20-30 minutos (receta en la Tabla 1). </li><li> Bloquear la membrana en 4% milk/1x solución salina amortiguadora Tris-Tween (TBST) durante 1 hora a TA o O / N a 4 ° C (receta en la Tabla 1). </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario a la proteína epítopo de etiquetado de interés en el 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar la membrana 3x durante 5 minutos cada uno con TBST 1x. </li><li> Incubar la membrana con apropiadaperoxidasa de rábano secundaria (HRP) conjugada con anticuerpo durante 1-3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la membrana 3 veces durante 15 min cada uno en un gran volumen de TBST 1x. </li><li> Cubra membrana con sustrato ECL y envolver en papel film. </li><li> Exponer la membrana a una película y desarrollar para visualizar las proteínas. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. 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W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se centra en la preparación de intacta, nativa, y después de la traducción modificada proteínas a partir de células de levadura en ciernes para aplicaciones de corriente abajo. Antes de intentar este protocolo, es fundamental para determinar si la proteína de interés puede ser fácilmente detectado en extractos proteicos preparados bajo condiciones de desnaturalización 12. Si los anticuerpos policlonales no están disponibles, puede ser ventajoso epítopo etiqueta de la proteína de int...

El asombroso poder de la genética de la levadura es legendaria, pero la preparación y el análisis de las proteínas nativas de levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es a menudo lleno de problemas. Este último es debido a la considerable resistencia mecánica y la elasticidad de la pared celular de levadura 1. Diferentes medios han sido descritos para la enzimática, química, mecánica, y la presión basada en la interrupción de las células de levadura para obtener extracto de proteína de células enteras 2-6. Estas técnicas varían ampliamente en su eficacia para producir extractos de proteínas de células nativas representativas, que se pueden utilizar para los análisis posteriores o pasos de purificación. Por ejemplo, la pared celular de la levadura se puede quitar con enzimas líticas (por ejemplo, zimoliasa) y esferoblastos resultantes se pueden interrumpir por cizallamiento, detergentes, o lisis osmótica para liberar las proteínas. Este enfoque ha sido empleado con éxito como el punto de partida para muchos fraccionamientos subcelulares pero requiere largas incubacionesque no son compatibles con la estabilidad de algunas proteínas 7. Reactivos de lisis de levadura específicos (tales como detergentes) para la extracción química de las proteínas de las células de levadura están disponibles comercialmente, pero la eficacia de estos reactivos en la extracción de la proteína y su efecto en la caracterización bioquímica posterior de las proteínas no siempre es clara 8. Homogeneizadores de alta presión, se hace referencia a menudo como prensas francesas, se rompen eficazmente células de levadura por primera sometiéndolos a alta presión y luego extruir a través de una pequeña abertura en una celda de presión. Esta técnica produce extractos de alta calidad, pero el equipo es muy caro y puede no ser adecuado para pequeñas cantidades de células o múltiples muestras 9. Por lo tanto, la rotura mecánica de las células de levadura en un molino de perlas es a menudo el método de elección para la levadura preparaciones de proteínas nativas 10. Esta técnica implica la ruptura mecánica de la pared celular de la levadura con ácido-waarrojar perlas de vidrio, que pueden llevarse a cabo con una variedad de sacudidores, Vórtices o molinos de perlas. En particular, este método se puede utilizar para procesar simultáneamente múltiples muestras más pequeñas (1 ml de células o menos). Muchas cuentas de diferentes matrices o interrupción molino de perlas están ahora disponibles comercialmente para interrumpir casi cualquier tipo de tipo de células en tubos de 2 ml. Teniendo en cuenta las otras técnicas y equipos, un molino de bolas tiene la ventaja añadida de que la interrupción de las células de levadura se produce muy rápido, lo que ayuda a preservar las modificaciones post-traduccionales tales como la sumoilación, especialmente cuando se utilizan los tampones apropiados con proteasa y / o inhibidores del proteasoma y la temperatura de los extractos se controla. Este protocolo se centra en la extracción rápida, eficaz, fiable y de proteínas endógenas y sobre-expresado en condiciones suaves con el objetivo final de preservar la función de proteínas, interacciones, y modificaciones post-traduccionales. El medio de crecimiento, tampón de lisis celularcomposiciones, y la configuración de molino de perlas están optimizados para mantener interacciones de proteínas y modificaciones post-traduccionales tales como la ubiquitinación y la sumoilación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogeneización por golpeo del talón es una manera rápida y eficiente para liberar el ADN, ARN, proteínas y metabolitos a partir de células de levadura en ciernes, que son notoriamente difícil de interrumpir. Aquí se describe el uso de un homogeneizador de molino de bolas para la extracción de las proteínas en tampones optimizados para mantener las funciones, interacciones y modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Células de crecimiento logarítmico que expresan la proteína de interés se cultivan en un medio de cultivo líquido de elección. Los medios de cultivo pueden suplementarse con reactivos para inducir la expresión de la proteína a partir de promotores inducibles (por ejemplo, galactosa), sincronizar la fase del ciclo celular (por ejemplo, nocodazol), o inhibir la función del proteasoma (por ejemplo, MG132). Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en un tampón adecuado que contiene proteasa y / o inhibidores de la fosfatasa y se procesan inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido para su uso posterior. La homogeneización se lleva a cabo seis ciclos de 20 seg bead-latido (5,5 m / seg), cada una seguida por una incubación minutos en hielo. El homogeneizado resultante se aclaró por centrifugación y las partículas pequeñas se puede retirar por filtración. El extracto de células enteras aclarado resultante (WCE) se precipitó usando TCA al 20% para el análisis directo de proteínas totales por SDS-PAGE seguida de Western Blot. Los extractos también son adecuados para la purificación por afinidad de proteínas específicas, la detección de modificaciones post-traduccionales, o el análisis de proteínas co-purificación. Como es el caso para la mayoría de los protocolos de purificación de proteínas, algunas enzimas y proteínas pueden requerir condiciones únicas o composiciones tampón para su purificación y otros pueden ser inestables o insolubles en las condiciones indicadas. En este último caso, el protocolo presentado puede proporcionar un punto de partida útil para determinar empíricamente la mejor estrategia de cordón-latido para la extracción y purificación de proteínas. Se demuestra la extracción y purificación de un epítopo de etiquetado SUMO E3 ligasa, Siz1, un ciclo celularregulada proteína que se convierte en tanto sumoylated y fosforilados, así como una subunidad de ubiquitina ligasa SUMO-dirigida, Slx5.

Nuestros resultados representativos revelan que el protocolo de extracción del talón-latido y proteína descrita es útil para la preparación reproducible de proteínas para una variedad de aplicaciones aguas abajo (que se resumen en la Tabla 2). SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie de WCE muestran que una amplia gama de proteínas (~ 12 a&gt; 250 kDa) se puede reproducible extrae de las células de levadura (Figura 1A). Bandas discretas más de una gama de pesos moleculares so...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.8K vistas.  The College of William & Mary.  La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción. 

Video: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

El descubrimiento de las interacciones de proteínas y caracterización de la función de proteínas utilizando HaloTag Tecnología

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...