Agradecemos a todos os membros do laboratório Kerscher pelo seu apoio. Agradecemos Mark Hochstrasser para o fermento tensão MHY3765. Este trabalho foi financiado pela NSF 1051970 (para OK) e um Howard Hughes Medical Institute Graduação viagem concessão e Monroe Scholars Programa Grant (para ES).

Purificação de proteínas 6xHis-tagged expressos em células de levedura sob condições nativas brotamento 1. O crescimento de células de levedura e a indução da expressão de proteina (Modificado a partir de 2) OPCIONAL: Use logaritmicamente crescentes culturas de levedura que expressam a proteína de interesse, em vez das culturas induzidas galactose descritos abaixo. <ol><li> Transformar células de uma estirpe de levedura + Gal com um plasmídeo que codifica uma proteína indutivel galactose de escolha 6xHis-tag. Por exemplo, veja a lista dos reagentes. </li><li> Inocular os transformantes em 5 ml de meio selectivo apropriado (por exemplo, DP-uracilo), contendo 2% de sacarose. Incubar a 30 ° CO / N, rotação. </li><li> Diluir O / N a cultura de modo a que a densidade óptica a 600 nm mede 0,3 (DO600 = 0,3) em 33 ml de meio selectivo com 2% de sacarose. Crescer a 30 ° C, com agitação (Δ150 rpm). </li><li> Quando a cultura atingiu OD 600 = 0,8-1.5, Induzir a expressão da proteína pretendida por adição de 17 ml de YEP 3x com 6% de galactose (Receita na Tabela 1), para uma concentração final de 1x YEP com 2% de galactose. Volume de cultura total agora é de 50 ml. Incubar, agitação, a 30 ° C durante uma hora adicional de 5-6. Nota: o volume de cultura pode ser variada. No passo 1.3, diluído em dois terços do volume final pretendido. No passo 1.4, adicionar um terço do volume final de 3x YEP / 6% de galactose. </li><li> Medir a DO600 da cultura induzida e centrifugar Δ150-200 OD de 600 unidades de células durante 5 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento de células com 1 ml de gelo frio 1x com PBS 1x cocktail inibidor de protease e transferir para um tubo de tampa 2 ml parafuso. </li><li> Centrifugar as células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante. </li><li> Encaixe sedimento celular congelamento em azoto líquido, seguido de imediato de lise celular ou de armazenamento a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol><ol><li> Para a célula de sedimento congelado a partir do passo anterior, adiciona-se 200 ul de contas de vidro lavadas com ácido e 500 ul de tampão de lise gelado (receita na Tabela 1, ou usar tampão de escolha de lise celular). </li><li> Resumidamente pipeta cima e para baixo. Não é necessário para ressuspender completamente o sedimento celular. Manter os tubos em gelo em todos os momentos. Nota: O fim da ponteira pode ser cortada antes de pipetagem cima e para baixo. </li><li> A 4 ° C, colocar o tubo (s) com as células para o moinho de bolas, equilíbrio, bloqueio e executar a máquina como por instruções do fabricante. </li><li> Executar o batedor de talão contendo o tubo (s) de 20 segundos a 5,5 m / seg, e depois colocar em gelo lamacento durante 1 min. Repita 6x no total. </li><li> Limpar as proteínas extraídas através de centrifugação durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: remover pequenas partículas por centrifugação através de um filtro Esfinge. </li><li> Prepara-se uma amostra de toda a célula eXtract (WCE) para confirmar a presença da proteína de interesse por meio de Western Blot: <ol><li> Adicionar WCE correspondente com 2 600 unidades de OD de células (por exemplo, 5 mL do extracto limpo se 200 OD de 600 unidades de células foram colhidas) a 800 ul de 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para misturar. </li><li> Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mas tenha cuidado para manter o sedimento. </li><li> Adicionar 800 uL de TCA a 2%, a pelete e o tubo de vórtice, seguido por centrifugação durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mas tenha cuidado para manter o sedimento. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de amostra de TCA (Receita na Tabela 1), vortex para dissolver o sedimento. Nota: Se o tampão de amostra torna-se ácido (fica amarelo) após a adição ao sedimento, adicione alíquotas de Δ10 mL de Tris base de [1M] até que a amostra é azul novamente. </li><li> Incubar em um bloco de calor de 100 ° C por 2-5 min. </li><li> Vortex again para dissolver totalmente se restos de pellet ainda estão presentes. Peletes preparados por este método são notoriamente difíceis de dissolver totalmente. Pode levar Δ10 min de vortex para dissolver completamente peletes. </li><li> Amostra Armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Encaixe congelar alíquotas do restante WCE apuradas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Purificação de Proteínas de lote homogenatos celulares de leveduras Nota: Este método de purificação foi optimizado para a purificação de proteínas 6xHis-tag em Co 2 + resina de afinidade com metal. <ol><li> Equilíbrio resina <ol><li> Para uma amostra de WCE preparadas a partir Δ20 sacudiu-40 OD de 600 unidades de células, adiciona 50-100 ul de resina de afinidade para um tubo de microcentrífuga. As proteínas extraídas a partir de células que não expressam a proteína desejada ou uma resina não específica, tais como amilose, pode ser usado como controles para a ligação inespecífica. </li><li> Lavar a resina 5x com 1 ml de tampão de lavagem: invertido topo-a-fundo para que a resina é suspensa de novo, e depois girar durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante. Nota: se efectuar a extracção e purificação, no mesmo dia, o equilíbrio da resina pode ser realizada antes da extracção. </li></ol></li><li> Binding Protein Purificação por Afinidade <ol><li> Adicionar 100-200 ul de ligado clarificado (Δ20 OD-40 600 unidades) para 50-100 ul de pérolas lavadas, e perfazer um volume total de 1 ml com tampão de lise. </li><li> Incubar com nutation ou balanço a 4 ° C por 2-5 horas. </li><li> Girar durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Se desejado, guardar uma amostra do sobrenadante para análise posterior remanescente de proteínas não ligadas. TCA precipitam como descrito acima para o WCE (passo 2.6). </li><li> Lavar a resina com proteínas ligadas 5x com 1 ml de tampão de lavagem, seguido por uma centrifugação durante 1 min a 5000 rpm a4 ° C. Manter as amostras frio durante as lavagens. </li></ol></li><li> A eluição das proteínas ligadas <ol><li> Adicionar 150 ul de tampão de eluição à resina, nutar a 4 ° C durante 5 min, centrifugação durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e guardar o sobrenadante num novo tubo. OPCIONAL: Repita 2x e eluições piscina. </li><li> Prepare a amostra eluída por Western Blot: Para 25 mL de proteínas eluídas, adicionar 25 ul de dodecil-sulfato de lítio 2x (LDS) com tampão de amostra de 2 ul β-mercaptoetanol (BME) e incubar em ° C num bloco de aquecimento 100 por 2 min. Nota: O tampão de amostra de Laemmli 2X padrão também podem ser usadas. </li><li> Tire o excesso de proteína eluída congelamento em nitrogênio líquido. OPCIONAL: tiras restantes proteínas a partir da resina com um volume igual de 2x tampão de amostra de LDS a 65 ° C durante 5 minutos, remover as proteínas LDS-eluídas para um novo tubo, em seguida, adicionar 2 mL de BME para as proteínas eluídas, e não para a resina. Esta ordem é para impedir a remoção de quaisquer iões ou anticorpos que são Conjugated às pérolas. </li><li> Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Western Blot e de sonda com anticorpos adequados para visualizar as proteínas. <ol><li> Carregar 10-20 ul (Δ1-3 OD 600 unidades) de cada amostra e 3-10 uL de uma escada de proteína num gel de SDS-PAGE de escolha. Géis rotineiramente utilizados para este protocolo incluem 4-12% de Bis-Tris e 8% de Tris-Glicina. </li><li> Executar gel a 200 V durante 50 min. </li><li> Transferir as proteínas do gel para uma membrana de PVDF de transferência semi-seco, a 19 V durante 20-30 minutos (a receita na Tabela 1). </li><li> Bloco de membrana em 4% milk/1x tampão salino Tris-Tween (TBST), durante 1 hora à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C (a receita na Tabela 1). </li><li> Incubar a membrana com anticorpo primário à proteína marcadas com epítopo de interesse em 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. </li><li> Lave membrana 3x por 5 minutos cada com TBST 1x. </li><li> Incubar a membrana com adequadaperoxidase de rábano secundário (HRP) conjugado anticorpo durante 1-3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar membrana 3x durante 15 minutos cada uma em um grande volume de TBST 1x. </li><li> Cubra membrana com substrato ECL e embrulhe em papel filme. </li><li> Expor membrana para filmar e desenvolver a visualizar proteínas. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. 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T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. 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T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo centra-se na preparação de intacta, nativo, e as proteínas modificada após a tradução a partir de células de levedura de brotamento para aplicações a jusante. Antes de efectuar este protocolo, é crítico para determinar se a proteína de interesse pode ser facilmente detectado em extractos proteicos preparados sob condições de desnaturação 12. Se os anticorpos policlonais não estão disponíveis, pode ser vantajoso para epitopos marcação da proteína de interesse de modo a que ...

O incrível poder de fermento genética é lendária, mas a preparação e análise de proteínas nativas da levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é muitas vezes repleta de problemas. O último é devido ao considerável resistência mecânica e elasticidade da parede da célula de levedura 1. Diferentes meios têm sido descritos para a ruptura das células de levedura para obter extracto de proteína de célula inteira 2-6 enzimática, química, mecânica e baseada pressão. Estas técnicas variam muito na sua eficácia para produzir extractos de proteínas nativas de células representativas, que podem ser utilizados para análises posteriores ou de passos de purificação. Por exemplo, a parede celular de levedura podem ser removidas com enzimas líticas (por exemplo, Zymolyase) e esferoblastos resultantes podem ser rompidas por cisalhamento, detergentes, ou lise osmótica para libertar proteínas. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso como o ponto de partida para muitos fraccionamentos subcelulares mas requer longas incubaçõesque não são compatíveis com a estabilidade de algumas proteínas 7. Os reagentes de lise de levedura farmacêuticas (tais como detergentes) para a extracção química de proteínas de células de levedura estão disponíveis comercialmente, mas a eficácia destes reagentes na extracção da proteína e do seu efeito na subsequente caracterização bioquímica de proteínas não é sempre claro 8. Os homogeneizadores de alta pressão, muitas vezes referida como prensas Francesa, quebrar eficazmente células de levedura por primeiro submetendo-os a alta pressão e, em seguida, extrudindo-los através de uma pequena abertura de uma célula de pressão. Esta técnica produz extractos de elevada qualidade, mas o equipamento é muito caro e pode não ser adequado para pequenas quantidades de amostras de células ou múltiplos 9. Por conseguinte, a ruptura mecânica das células de levedura num moinho de esferas é frequentemente o método de escolha para a preparação de proteínas de levedura nativas 10. Esta técnica envolve a ruptura mecânica da parede celular da levedura com ácido-waverter esferas de vidro, que podem ser realizados com uma grande variedade de agitadores, moinhos de vortexers ou grânulo. Nomeadamente, este método pode ser usado para processar simultaneamente múltiplas amostras pequenas (1 ml de células ou menos). Muitas contas diferentes ou talão moinho matrizes rompimento já estão disponíveis comercialmente para interromper qualquer tipo de tipo de célula em tubos de 2 ml. Considerando as outras técnicas e equipamentos, um moinho de esferas tem a vantagem adicional de que a ruptura das células de levedura ocorre muito rapidamente, o que ajuda a preservar a modificações pós-translacionais, tais como sumoilação, especialmente quando são utilizados os tampões apropriados com protease e / ou inibidores de proteassoma e a temperatura é controlada de extractos. Este protocolo centra-se na extração rápida, eficaz e confiável de proteínas endógenas e sobre-expressos em condições suaves com o objetivo final de preservar a função da proteína, interações e modificações pós-traducionais. O meio de crescimento, tampão de lise celularAs composições e configurações de moinho de esferas são optimizados para manter as interacções proteicas e modificações pós-traducionais tais como sumoilação e ubiquitinação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

Homogeneização por espancamento talão é uma maneira rápida e eficiente para liberar DNA, RNA, proteínas e metabólitos de células de levedura de brotamento, que são notoriamente difíceis de romper. Aqui descrevemos o uso de um homogeneizador de moinho de esferas para a extracção de proteínas nos buffers optimizados para manter as funções, interações e modificações pós-traducionais das proteínas. As células em crescimento logarítmica que expressam a proteína de interesse é cultivada num meio de crescimento líquido de escolha. Os meios de cultura podem ser suplementados com os reagentes para induzir a expressão de proteína a partir de promotores inductíveis (por exemplo galactose), sincronizar estágio do ciclo celular (por exemplo, nocodazol), ou inibir a função do proteassoma (por exemplo, MG132). As células são então sedimentadas e ressuspensas num tampão adequado contendo a protease e / ou inibidores de fosfatase e seja processado imediatamente ou congelado em azoto líquido para posterior utilização. A homogeneização é realizada por seis ciclos de 20 seg bead-batimento (5,5 m / seg), cada um seguido por um minuto de incubação sobre gelo. O homogenato resultante foi clarificado por centrifugação e as pequenas partículas podem ser removidas por filtração. O extracto celular total foi afastada resultante (WCE) é precipitado utilizando 20% de TCA para análise directa de proteínas totais por SDS-PAGE seguido por Western blotting. Os extractos são também adequados para a purificação por afinidade de proteínas específicas, a detecção de modificações pós-tradução, ou a análise de proteínas de co-purificação. Como é o caso para a maioria dos protocolos de purificação de proteínas, algumas enzimas e proteínas podem exigir condições únicas ou composições de tampão para a sua purificação, e outros podem ser instáveis ​​ou insolúveis sob as condições indicadas. Neste último caso, o protocolo apresentado pode proporcionar um ponto de partida útil para determinar empiricamente a melhor estratégia talão batimento para a extracção e purificação de proteínas. Mostramos a extração e purificação de um epitopo-marcado SUMO E3 ligase, Siz1, um ciclo celularregulada proteína que se torna tanto sumoylated e fosforilada, bem como uma subunidade de ubiquitina ligase SUMO-alvo, Slx5.

Os resultados representativos revelam que o protocolo de extracção de grânulo proteína-batimento e descrita é útil para a preparação de proteínas reprodutíveis para uma variedade de aplicações a jusante (resumidos na Tabela 2). SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie de WCEs mostrar que uma grande variedade de proteínas (12 a&gt; ~ 250 kDa) podem ser reprodutivelmente extraído de células de levedura (Figura 1A). Bandas discretas ao longo de um intervalo de pesos mo...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.8K visualizações.  The College of William & Mary.  A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais. 

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Descobrindo Interações proteína e caracterização da função das proteínas Usando HaloTag Tecnologia

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...