我々は彼らのサポートのためにカーシャーラボのすべてのメンバーに感謝します。私たちは、酵母株MHY3765用マークHochstrasserに感謝します。この作品は、NSFの助成金1051970（OK）に、ハワードヒューズ医学研究所学部旅行助成とモンロー学者プログラムグラント（ESへ）によってサポートされていました。

変性条件下で出芽酵母細胞で発現6xHisタグタンパク質の精製 1。タンパク質発現の酵母細胞と誘導の成長 （2から変更） オプション：関心の代わりに後述のガラクトース誘導性の文化のタンパク質を発現対数的に成長している酵母培養を使用してください。 <ol><li>ギャル+コードするプラスミドで酵母株の選択のガラクトース誘導性6xHisタグタンパク質の細胞を形質転換する。例えば、試薬のリストを参照してください。 </li><li> 2％ショ糖を含む適切な選択培地（ 例えば SD-ウラシル）5ml中の形質転換体を植菌。 30°CO / N、回転でインキュベートする。 </li><li> 600nmでの光学密度が2％ショ糖と選択培地33 mlの0.3（= 0.3 OD 600）を測定するようにO / N文化を希釈します。 （Δ150rpm）で揺れ、30℃で成長する。 </li><li>文化は、OD 600 = 0.8に達したとき-1.5、2％ガラクトースの1x YEPの最終濃度が、6％ガラクトース（ 表1のレシピ）で3回17mlのYEPを添加することにより、所望のタンパク質の発現を誘導する。合計培養液量は現在50ミリリットルです。インキュベートし、追加の5-6時間、30℃で、揺れ。 注：培養液量を変化させることができる。ステップ1.3で、希薄所望の最終体積の三分の二に。ステップ1.4では、3倍YEP / 6％ガラクトースの三分の一、最終容量を追加します。 </li><li> 4℃で5,000 rpmで5分間誘発文化や遠心分離機、細胞のΔ150-200 OD 600単位のOD 600を測定します</li><li> 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと2 mlのスクリューキャップチューブに移すと1ミリリットルの氷冷1X PBSで再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li> 4℃で15,000 rpmで1分間遠心し℃で上清をデカント。 </li><li> -80℃で即時細胞溶解またはストレージが続く液体窒素、℃でさらに使用するまで、Cで凍結細胞ペレットをスナップ。 </li></ol><ol><li>前のステップからの凍結細胞ペレットに、酸洗浄ガラスビーズと氷冷溶解バッファー（ 表1のレシピや、選択した細胞溶解バッファーを使用します）500μlの200μlのを追加します。 </li><li>簡単に言うとペッティング上下。これは完全に細胞ペレットを再懸濁する必要はない。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。 注：ピペットチップの先端が上下にピペッティング前に切断されることがあります。 </li><li> 4℃で、場所ビーズミル、バランス、ロック、そして当たり製造元の指示としてマシンを実行中に細胞とチューブ（秒）。 </li><li> 5.5で20秒間チューブ（s）を含むビーズビーターメートル/秒、その後1分間ぬかるみ氷上に置きを実行します。合計で6倍を繰り返します。 </li><li> 4℃15,000 rpmで15分間、℃で遠心分離により抽出したタンパク質をクリアオプション：SpinXフィルターを通して遠心分離により小さな微粒子を除去。 </li><li>全細胞eのサンプルを準備しますウェスタンブロットによって目的のタンパク質の存在を確認する（WCE）xtract： <ol><li> 800μlの20％トリクロロ酢酸（TCA）への細胞の2 OD 600台（クリアエキス例えば 、5μlの細胞の200 OD 600台が収穫されている場合）に対応するWCE追加。ミックスする渦。 </li><li> 4℃で15,000 rpmで2.5分間遠心上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。 </li><li> 4℃15,000 rpmで2.5分間遠心分離し、ペレットとボルテックスチューブにTCA 2％800μlの、℃までを追加上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。 </li><li> TCAサンプルバッファー100μlの（ 表1のレシピ）、ペレットを溶解するために渦を追加します。注意：サンプルバッファがペレットに添加した後（黄色に変わります）、酸性になった場合、Δ10μlのトリス塩基のアリコートを追加[1M]サンプルは再び青になるまで。 </li><li> 2-5分間100℃のヒートブロックでインキュベートする。 </li><li>渦AGAINペレットの残党がまだ存在する場合は、完全に溶解する。この方法で調製したペレットは、完全に溶解するの難しいことで知られています。それは完全にペレットを溶解するためにボルテックスのΔ10分かかる場合があります。 </li><li> -80 Storeサンプル°C、さらに使用するまで。 </li></ol></li><li>さらに使用するまで-80℃で液体窒素や店舗内の残りのクリアWCE°Cのアリコートを凍結スナップ。 </li></ol> 3。酵母細胞ホモジネートからのタンパク質のバッチ精製注：この精製法は、Co 2 +金属アフィニティー樹脂に6xHisタグタンパク質の精製の ​​ために最適化されました。 <ol><li> レジン平衡 <ol><li>細胞のΔ20-40 OD 600台から調製クリアWCEのサンプルについては、マイクロ遠心チューブに親和性樹脂の50〜100μLを加える。例えば、アミロース、所望のタンパク質または非特異性樹脂を発現しない細胞から抽出したタンパク質を、コントロールとして使用することができる非特異的結合のための。 </li><li>洗浄緩衝液1mlで5倍の樹脂を洗う：トップオーバーボトム反転樹脂を再懸濁させた後、4℃で5,000 rpmで1分間スピンするまで℃に上清を吸引。 注：同じ日に抽出·精製を行う場合は、樹脂平衡化、抽出の前に行うことができる。 </li></ol></li><li> アフィニティー精製の ​​ためのタンパク結合 <ol><li> 50〜100μlの洗浄したビーズにクリアライセート100-200液（Δ20-40 OD 600単位）を追加し、溶解緩衝液で1ミリリットルの合計容積をもたらす。 </li><li> 2-5時間で4章動またはロッキング°Cでインキュベートする。 </li><li> 4℃で5,000 rpmで1分間スピン</li><li>必要に応じて、非結合タンパク質のその後の分析のために残りの上清のサンプルを保存します。 TCAはWCE（ステップ2.6）については、上記の詳細として沈殿する。 </li><li> 5,000 rpmで少なくとも1分間スピンコートした後、洗浄緩衝液1mlで5倍の結合タンパク質で樹脂を洗浄4℃洗浄中にサンプルは冷やしておく。 </li></ol></li><li> 結合したタンパク質の溶出 <ol><li> 4で、樹脂にうなだれるを150μlの溶出バッファーを追加℃で5分間、4℃で5,000 rpmで1分間スピン℃、新しいチューブに上清を保存します。オプション：2倍とプール溶出を繰り返します。 </li><li> 、溶出したタンパク質の25μlに2μlのβ-メルカプトエタノール（BME）と25μlの2倍のリチウムドデシル硫酸塩（LDS）サンプルバッファーを加え、2分間100℃のヒートブロックでインキュベート：ウェスタンブロット用溶出サンプルを準備します。 注：標準2XのLaemmliサンプル緩衝液を用いてもよい。 </li><li>液体窒素中で凍結過剰溶出タンパク質をスナップ。 オプション：65℃2倍LDSサンプルバッファー等量と樹脂からのストリップの残りのタンパク質は℃で5分間、新しいチューブにLDS-溶出タンパク質を除去し、ではない樹脂に、溶出したタンパク質に2μlのBMEを追加します。この順序は、抱合あるあらゆるイオンまたは抗体の除去を防止するためであるビーズにテッド。 </li><li> -80℃でさらに使用するまで、店舗のサンプル。 </li></ol></li><li> タンパク質を可視化するための適切な抗体を用いたウェスタンブロットおよびプローブ 。 <ol><li>各サンプルの10〜20μL（Δ1-3 OD 600台）と、選択したSDS-PAGEゲル中のタンパク質ラダーの3-10μLをロードします。日常的にこのプロトコルに使用ゲルは4〜12％ビス - トリス、8％トリス - グリシンが含まれています。 </li><li> 50分間200 Vでゲルを実行します。 </li><li> 20〜30分（ 表1のレシピ）が19 Vでセミドライ転送によりゲルからPVDF膜にタンパク質を転送します。 </li><li> 4％milk/1xトリスのブロック膜は、4℃（ 表1のレシピ）でRTまたはO / Nで1時間食塩水TWEEN（TBST）をバッファリング。 </li><li> 4℃でRTまたはO / Nで1-3時間、4％milk/1xのTBSTの関心のエピトープタグタンパク質に一次抗体を有する膜をインキュベート</li><li> 1×TBSTで5分間ごとに、3倍の膜を洗浄します。 </li><li>適切なメンブレンをインキュベート二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合室温で1-3時間、抗体。 </li><li> 1×TBST大容量で15分ごとに、3倍の膜を洗浄します。 </li><li>サランラップでECL基質とラップでメンブレンをカバーしています。 </li><li>フィルムに膜を露出させ、タンパク質を可視化するために開発しています。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein.">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li><li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast.">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li><li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to protein purification. , (1990).</li><li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Affinity+Purification+(TAP)+Method:+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification.">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li><li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid.">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).</li><li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、無傷の、ネイティブの準備に焦点を当て、翻訳後のダウンストリームアプリケーションのため出芽酵母細胞からタンパク質を変更しました。このプロトコルを試みる前に、目的のタンパク質を容易に変性条件下12で調製したタンパク質抽出物中で検出することができるかどうかを判断することが重要である。ポリクローナル抗体が利用できない場合、それは、融合...

酵母遺伝学の素晴らしいパワーは伝説ですが、出芽酵母、 サッカロマイセス·セレビシエ、から天然タンパク質の調製及び分析は、多くの場合、問題をはらんでいます。後者は、酵母細胞壁1のかなりの機械的強度及び弾性のためである。別の手段は、酵素的、化学的、機械的、圧力ベースの全細胞タンパク質抽出物2-6を得るために、酵母細胞の破壊のために記載されている。これらの技術は、その後の分析または精製工程に使用することができる細胞代表、天然のタンパク質抽出物を得るためにそれらの効力が大きく異なる。例えば、酵母細胞壁溶解酵素（ 例えばザイモリアーゼ）、得フェロブラストで除去することができるが、剪断、界面活性剤、またはタンパク質を放出する浸透溶解によって破壊することができる。このアプローチは成功し、多くの細胞下分画するための出発点として使用されるが、それは長いインキュベーションを必要とされていますそれはいくつかのタンパク質7の安定性と互換性がありません。 酵母細胞のタンパク質の化学的抽出のための独自の酵母溶解試薬 ​​（例えば、界面活性剤など）、市販されているが、これらのタンパク質抽出における試薬およびタンパク質のその後の生化学的特徴付けに対する効果の有効性は必ずしも明らかではない8。高圧ホモジナイザーは、しばしばフランス語押下と呼ばれる、効果的に第1高圧にそれらを施し、次いで圧力セル内の小さな開口部を介してそれらを押し出すことによって酵母細胞を破壊する。この技術は、高品質の抽出物を生成したが装置は非常に高価であり、細胞または複数のサンプル9少量のに適しているわけではない。したがって、ビーズミルで酵母細胞の機械的破壊は、しばしば、天然の酵母タンパク質調製物10を選択する方法である。この技術は、酸のWAを有する酵母細胞壁の機械的破壊を伴うシェーカー、vortexersまたはビーズミルの様々行うことができるガラスビーズを流した。特に、この方法は、同時に複数のより小さな試料（1 mlの細胞以下）を処理するために使用することができる。さまざまなビーズやビーズミル混乱行列は今や2 mlのチューブに細胞型のほとんどすべての種類を妨害するために市販されている。他の技術と設備を考慮し、ビーズミル、プロテアーゼおよび/またはプロテアソーム阻害剤と適切なバッファが利用される場合は特に、例えばSUMO化などの翻訳後修飾を維持するのに役立ち、これ酵母細胞の破壊は非常に速く起こるという利点を有しているそして抽出物の温度が制御される。 このプロトコルは、内因性および過剰発現タンパク質の機能を維持するために究極の目標と穏やかな条件の下でタンパク質相互作用、および翻訳後修飾の、高速で効果的、かつ信頼性の高い抽出に焦点を当てています。増殖培地、細胞溶解バッファー組成物、及びビーズミルの設定は、タンパク質間相互作用、例えばSUMO化とユビキチン化などの翻訳後修飾を維持するために最適化される。

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast ORF strain in BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td></tr><tr><td>pYES2.1 TOPO vector</td><td>Life Technologies</td><td>K4150-01</td><td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td></tr><tr><td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &amp;micro;m (30-40 US sieve)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Use for additional filtering of clarified lysate</td></tr><tr><td>TALON Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Protein gel stain</td></tr><tr><td>Mammalian Lysis Buffer</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Alternative commercial lysis buffer</td></tr><tr><td>Anti-V5 agarose</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Method of immunoprecipitation</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>anti-myc antibody</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>secondary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

ビーズ打つことによって均質化は、悪名高い混乱させるのは難しいです出芽酵母の細胞からDNA、RNA、タンパク質、代謝物を解放するために、高速かつ効率的な方法です。ここでは、機能的相互作用およびタンパク質の翻訳後修飾を維持するために最適化されたバッファーにタンパク質を抽出するためのビーズミル、ホモジナイザーの使用を記載している。目的のタンパク質を発現する対数的に増殖している細胞は、選択した液体増殖培地で増殖させる。増殖培地は、誘導性プロモーター（ 例えば、ガラクトース）からのタンパク質発現を誘導するための試薬 ​​を補充することができる（ 例えば 、ノコダゾール）の細胞周期段階を同期させる、または（ 例えば、MG132）プロテアソーム機能を阻害する。次に細胞をペレット化し、プロテアーゼおよび/またはホスファターゼ阻害剤を含有する適当な緩衝液中に再懸濁しており、すぐに処理されるか、後で使用するために液体窒素中で凍結される。均質化は20秒BEAの6サイクルによって達成されるD-鼓動（5.5メートル/秒）、氷上で1分間インキュベートした各。得られたホモジネートを遠心分離によってクリアされ、小さな微粒子を濾過により除去することができる。結果クリア全細胞抽出物（WCE）はウェスタンブロッティング続いSDS-PAGEによる全タンパク質の直接分析のためにTCA 20％を使用して沈殿させる。抽出物はまた、特定のタンパク質のアフィニティー精製、翻訳後修飾、または共精製タンパク質の分析の検出に適している。ほとんどのタンパク質精製プロトコルの場合と同様に、いくつかの酵素やタンパク質は、それらの精製および他のためのユニークな条件やバッファー組成物が記載された条件の下で不安定になったり、不溶性のかもしれませんが必要な場合があります。後者の場合、提示プロトコルは、経験的にタンパク質抽出および精製のための最良のビード打ち戦略を決定するために有用な出発点を提供することができる。私たちは、エピトープタグSUMO E3リガーゼ、SIZ1、細胞周期の抽出と精製を示すSlx5、SUMO化およびリン酸化と同様、SUMO-ターゲットユビキチンリガーゼのサブユニットの両方になるタンパク質を規制。

我々の代表的な結果について説明ビード打ちおよびタンパク質抽出プロトコルは、ダウンストリーム·アプリケーション（ 表2に要約）の様々なタンパク質の再現可能な製造のために有用であることを明らかにした。 WCEsのクーマシー染色したSDS-PAGEでタンパク質（〜12〜&gt; 250 kDaの）広範囲の再現性酵母細胞（ 図1A）から抽出することができることを示している。分?...

Watch this Scientific Journal Video about Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications at JoVE.com

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

JoVE Journal

Biology

24.8K ビュー.  The College of William & Mary. 高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。 

ビデオ: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

生化学

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and lipids during endocytosis, sorting within the endosomal system, and autophagy. Central to SNX-BAR protein function is the ability to form homodimers or heterodimers that bind membranes using highly conserved phox-homology (PX) and BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domains. In addition, oligomerization of SNX-BAR dimers on membranes can elicit the formation of membrane tubules and vesicles and this activity is thought to reflect their functions as coat proteins for endosome-derived transport carriers. Researchers have long utilized in vitro binding studies using recombinant SNX-BAR proteins on synthetic liposomes or giant unilamellar vesicles (GUVs) to reveal the precise makeup of lipids needed to drive membrane remodeling, thus revealing their mechanism of action. However, due to technical challenges with dual expression systems, toxicity of SNX-BAR protein expression in bacteria, and poor solubility of individual SNX-BAR proteins, most studies to date have examined SNX-BAR homodimers, including non-physiological dimers that form during expression in bacteria. Recently, we have optimized a protocol to overcome the major shortcomings of a typical bacterial expression system. Using this workflow, we demonstrate how to successfully express and purify large amounts of SNX-BAR heterodimers and how to reconstitute them on synthetic liposomes for binding and tubulation assays.

Here, we present a workflow for the expression, purification and liposome binding of SNX-BAR heterodimers in yeast.

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

遺伝学

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

生物学

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research. S. cerevisiae is an attractive model organism due to the fact that its genome has been sequenced, its genetics are easily manipulated, and it is very easy to maintain in the lab. Because many yeast proteins are similar in sequence and function to those found in other organisms, studies performed in yeast can help us to determine how a particular gene or protein functions in higher eukaryotes (including humans).
This video provides an introduction to the biology of this model organism, how it was discovered, and why labs all over the world have selected it as their model of choice. Previous studies performed in S. cerevisiae that have contributed to our understanding of important cellular processes such as the cell cycle, aging, and cell death are also discussed. Finally, the video describes some of the many ways in which yeast cells are put to work in modern scientific research, including protein purification and the study of DNA repair mechanisms and other cellular processes related to Alzheimer&rsquo;s and Parkinson&rsquo;s diseases.

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

出芽酵母入門

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

出芽酵母SNX-BARヘテロダイマーの発現、精製、リポソーム結合

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

出芽酵母入門

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で