فإن الكتاب أود أن أشكر FI Ataullakhanov للمساعدة في تصميم وتصنيع الدوائر تدفق قابلة لإعادة الاستخدام، N. داشكيفيتش، N. Gudimchuk وA. Korbalev لتوفير الصور للشخصيات، N. Gudimchuk وP. زاخاروف لوضع بروتوكول وتوفير الكواشف ل إعداد البذور أنيبيب المسمى digoxigenin، A. Potapenko للمساعدة في تحرير النص وغيرها من أعضاء Grishchuk المختبر للحصول على نصائح والمناقشات. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح R01-GM 098389 ومنحة رائدة من معهد بنسلفانيا العضلات لELG، وهو كيميل الباحث، من خلال RFBR يمنح 12-04-00111 واحد، 13 04-40190-H و 13 -04-40188-H، والأكاديمية الروسية للعلوم رئاسة المنح (آليات الأنظمة الجزيئية والتكامل وبيولوجيا الخلية الجزيئية برامج والجزيئية) لFI Ataullakhanov، المعاهد الوطنية للصحة منح R01 GM033787 جنرال موتورز لJR ماكينتوش، وزمالة ما بعد الدكتوراه مؤسسة ديمتري اسرة زيمين ل VAV

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

العديد من المقايسات جزيء واحد في الوقت الحاضر تستخدم بشكل روتيني coverslips معاملة خاصة لخفض كبير غير محدد من البروتين الشائكة. الإجراء وصفنا هنا هو تعديل للبروتوكول الأصلي وضعت في مختبر هوارد 32، ونجد أن silanizing لل coverslips تستحق الجهد حتى مع المقايسات حبة مقرها مدينة د?...

وحفظا للغاية ميكروتثبول الهياكل هيكل الخلية التي تعتبر مهمة للهندسة المعمارية الخلوية، حركية الخلية، وانقسام الخلايا، والنقل داخل الخلايا 1. هذه البوليمرات الحيوية التجمع من تويولين في حضور GTP، ويحولون بشكل عفوي بين النمو وتقصير 2. الأنابيب الدقيقة هي رقيقة جدا (فقط 25 نانومتر في القطر) وبالتالي تقنيات بصرية خاصة لتعزيز وينبغي أن تستخدم المقابل لمراقبة الأنابيب الدقيقة مع المجهر الخفيفة. فحص العمل السابق مع هذه البوليمرات سلوكهم الديناميكية باستخدام النقيض تدخل الفرق (DIC) 3. وكشفت هذه الدراسات ومماثلة في المختبر أنه في ظل الظروف التجريبية النموذجية، والأنابيب الدقيقة الخضوع كارثة والتحول إلى التحلل إلا نادرا، مرة واحدة كل 5-15 دقيقة (هذا التردد هو 7-15 ملي تركيز تويولين ذوبان درست في 28-32 درجة مئوية ) 4. وهكذا تم اقتراح تقنيات مختلفة لinducه أنيبيب التحلل في الطريقة التي تسيطر عليها. يمكن أن تسبب أنيبيب تقصير من قبل تجرف تويولين للذوبان 5،6، وقطع الأنابيب الدقيقة مع شعاع ليزر 7، أو باستخدام الأنابيب الدقيقة 8 مجزأة، كما هو موضح هنا. العمل السابق باستخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة، فضلا عن البوليمرات التحول عشوائيا، وقد وجدت أن الشحنات داخل الخلايا الصغيرة، مثل الكروموسومات، الحويصلات، وحبات المغلفة البروتين، يمكن ان تتحرك في نهايات الأنابيب الدقيقة تقصير 9-13. ويعتقد أن هذه الظاهرة أن يكون لها تأثير مباشر على الاقتراحات الصبغي في الخلايا الإنقسامية، والآليات الكامنة ويجري حاليا التحقيق نشط 14-16. في الآونة الأخيرة، وتقنيات تستند الفلورسنت، بما في ذلك مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهري، وقد استخدمت لدراسة حركية ديناميكية مع أنيبيب ينتهي 17-24. ميزة هذا النهج هو أنه يتيح فحص التفاعلق بين الأنابيب الدقيقة والبروتينات ملزمة أنيبيب في الوقت الحقيقي باستخدام البروتينات المسمى مع fluorophores مختلفة. تم العثور على العديد من المجمعات البروتين لنقل processively مع التمطيط و / أو تقصير نهايات أنيبيب. وتشمل هذه البروتينات المرتبطة أنيبيب Dam1 10،12،18، 19 Ska1، وXMAP215 20، وكذلك المحركات كينيسين Kif18A 21،22، 23 و MCAK CENP-E 24. هذه البروتينات تظهر processive بلاغ تتبع، والتي تختلف اختلافا جوهريا عن ذلك من البروتينات تتبع غيض الكلاسيكية مثل EB1 25. على الرغم من أن جزيئات EB1 والشركاء المرتبطة تظهر أن تظل المرتبطة ثابت مع أنيبيب ديناميكية ينتهي، تبقى الجزيئات الفردية ملزمة لطرف أنيبيب فقط ~ 0.8 ثانية، تبادل بسرعة مع تجمع ذوبان 26. في المقابل، processive بلاغ بتتبع، مثل Dam1، السفر مع أنيبيب تنتهي لكثير من ميكرون، وارتباطهم نصائح أنيبيب يمكن أن تستمر لم<html> أي ثواني. غيض الوقت تكوين الجمعيات، فضلا عن معدل الناتج من تتبع، يعتمد بشدة على عدد من الجزيئات التي تشكل تتبع طرف مجمع 27. الفرق أكبر من البروتين وعادة ما تكون أفضل بكثير بلاغ بتتبع. على سبيل المثال، مثل جمعيات معقدة مثل kinetochores الخميرة يمكن أن تبقى معزولة إلى جانب أنيبيب ينتهي لساعات 28. بعض البروتينات ملزمة أنيبيب، مثل Ndc80 بروتين معقد الحيز الحركي، وقد وجد أن تكون قادرة على تعقب مع أنيبيب ينتهي عند مستوى جزيء واحد، ولكن Ndc80 هي فعالة جدا في اقتران حركة البضائع حبة 19،29-31. وبالتالي، لفهم آلية بلاغ تتبع عن طريق المجمعات البروتين المختلفة، فضلا عن قدرتها على التنوع الأدوار، فمن المهم دراسة بلاغ تتبع بوصفها وظيفة من عدد الجزيئات في مجمع تتبع الحافة، وكذلك لتحديد قدرة هذه المجمعات لعرض الحركة الجماعية على سطح حبة البضائع. &gt; فيما يلي نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لإعداد وإجراء التجارب مع الأنابيب الدقيقة مجزأة (الشكل 1A). أولا، يتم تعديل الشرائح الزجاجية المتاحة تجاريا لأنابيب البولي ايثيلين إرفاق قصيرة (بروتوكول 1). ثم يتم تجميعها وقابلة لإعادة الاستخدام غرفة التدفق المجهري من هذه الشريحة وتنظيفها البلازما وساترة silanized (بروتوكول 2) 32-34 كيميائيا أو. حجم الغرفة الناتج هو فقط 20-25 ميكرولتر (أو صغيرة مثل 15 ميكرولتر، انظر الملاحظة 3 في البروتوكول 1)، بما في ذلك حجم الأنبوب مدخل. ويمكن أيضا تدفق غرف متوفرة تجاريا استخدامها، ولكن حجمها عادة ما يكون أكبر، مما أدى إلى إهدار غير ضروري للبروتينات. إذا استخدمت غرفة أكبر، وينبغي تحجيم حجم كل الحلول في البروتوكولات أدناه نسبيا. ثم يتم إعداد البذور أنيبيب، على سبيل المثال باستخدام المتحللة ببطء GTP التناظرية، GMPCPP (غوانوزين-5&#39;-[(α، β) methyleno] ثلاثي) (بروتوكول 3، انظر أيضا هيمان &lt;م&gt; وآخرون 35). ويجمد البذور على ساترة تنظيفها ويتم حظر السطح في وقت لاحق لمنع امتصاص غير محدد من البروتينات الأخرى 32 (4 بروتوكول يصف الشلل باستخدام بذور digoxigenin). ويمكن بعد ذلك الأنابيب الدقيقة مجزأة تكون مستعدة باستخدام بروتوكول 5. والمبرر الرئيسي لهذا النهج هو أن البوليمرات أنيبيب الديناميكية، والتي تشكل في وجود GTP، يمكن أن يستقر مؤقتا عن طريق إضافة &quot;قبعات&quot; قصيرة من قطاعات تويولين مستقرة، والتي تحتوي على GMPCPP. تحتوي هذه القبعات أيضا تويولين رودامين المسمى، بحيث يمكن إزالتها ببساطة عن طريق إلقاء الضوء على مجال الرؤية مع ليزر 530-550 نانومتر أو مصباح الزئبق قوس (البروتوكول 6) 36. ويمكن بعد ذلك كثافة مضان للإشارة بلاغ تتبع استخدامها لتقدير عدد الجزيئات التي تسافر مع نهايات أنيبيب تفكيك، مع الأخذ بعين الاعتبار التفاوت في مجال الإضاءة المجهر (بروتوكول 7). ويمكن استخدام نهج مماثللدراسة التفاعلات بين الأنابيب الدقيقة depolymerizing وحبات المغلفة البروتين، أعد كما هو موضح في 27 (بروتوكول 8). وربط بعض البروتينات بسهولة على جدران الأنابيب الدقيقة مجزأة، ولكن يمكن أيضا ملاقط الليزر يمكن استخدامها لعقد حبة بالقرب من الجدار أنيبيب، وبالتالي تعزيز ملزمة لها.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

يمكن أنيبيب التحلل توفير القوة لنقل مجمعات البروتين المختلفة والخرز المغلفة البروتين في المختبر. ويعتقد أن الآليات الكامنة لتلعب دورا حيويا في الاقتراحات التي تعتمد على كروموسوم أنيبيب خلال انقسام الخلايا، ولكن البروتينات ذات الصلة ودورها المحدد وغير محددة. وبالتالي، هناك حاجة متزايدة لتطوير المقايسات التي لدراسة مثل هذه الحركة في المختبر باستخدام مكونات النقي وتعريف الوسط البيوكيميائية. الأنابيب الدقيقة، ومع ذلك، هي بطبيعتها غير مستقرة البوليمرات؛ التبديل ما بين النمو والسمن العشوائية ويصعب السيطرة عليها. البروتوكولات وصفنا هنا الاستفادة من الأنابيب الدقيقة مجزأة التي يتم إجراؤها مع photoablatable استقرار مباراة دولية. يمكن أن تسبب التحلل من هذه الأنابيب الدقيقة مجزأة مع القرار الزماني والمكاني عالية، مما يساعد دراسات الحركة في نهايات أنيبيب تفكيك. هذه التقنية يمكن استخدامها لكاليفورنياRRY بإجراء تحليل كمي لعدد من الجزيئات في المجمعات البروتين fluorescently المسمى، والتي تتحرك processively مع أنيبيب ديناميكية ينتهي. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء في هذه وغيرها من المقايسات الفلورسنت الكمي، ينبغي أن يعامل coverslips للحد من امتصاص البروتينات القابلة للذوبان غير محدد من fluorescently المسمى. وتقدم بروتوكولات مفصلة إلى أن تأخذ في الاعتبار تفاوت إضاءة الفلورسنت، وتحديد كثافة من fluorophore واحد باستخدام تناسب التمويه على مسافة واحدة. أخيرا، نحن تصف استخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة لدراسة الاقتراحات التي تعتمد على أنيبيب من بلي المغلفة البروتين، وتوفير نظرة ثاقبة قدرة المحركات المختلفة وأية محرك البروتينات لزوجين التحلل أنيبيب لحركة البضائع processive.

البروتين تتبع مع ​​depolymerizing أنيبيب ينتهي. الحيز الحركي الخميرة المكون Dam1 هو إلى حد بعيد أفضل بلاغ تعقب من أنيبيب depolymerizing ينتهي 14. هذا المجمع 10-الوحيدات المسمى مع GFP يمكن التعبير عنها بسهولة وتنقيته من الخلايا البكتيرية 18،38، لذلك نوصي استخدامه كع?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

الأنابيب الدقيقة هي بطبيعتها غير مستقرة البوليمرات، والتبديل ما بين النمو والسمن العشوائية ويصعب السيطرة عليها. نحن هنا تصف البروتوكولات باستخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة مع قبعات استقرار photoablatable. يمكن أن تسبب التحلل من الأنابيب الدقيقة مجزأة مع القرار الزماني والمكاني عالية، مما يساعد تحليل الاقتراحات مع نهايات أنيبيب تفكيك.

إعداد مقسمة ميكروتثبول لدراسة الاقتراحات وانطلاقا من تفكيك أنيبيب ينتهي

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Russian Academy of Sciences.  الأنابيب الدقيقة هي بطبيعتها غير مستقرة البوليمرات، والتبديل ما بين النمو والسمن العشوائية ويصعب السيطرة عليها. نحن هنا تصف البروتوكولات باستخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة مع قبعات استقرار photoablatable. يمكن أن تسبب التحلل من الأنابيب الدقيقة م...

Video: Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

إنتاج<em&gt; القيطم مداري</em&gt; البيض مقتطفات من التعرف على الرنا أنيبيب المرتبطة بها

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

باستخدام كاتشو-2 خلايا لدراسة نقل الدهون من الأمعاء

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

قياس ديناميات الأنابيب المجهرية بواسطة المجهر القرص الغزل في المغزل ميتوتيك القطب

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

دليل خطوة بخطوة لتخطيط كهربية البعوض

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...