Gli autori desiderano ringraziare FI Ataullakhanov per aver contribuito a progettare e realizzare camere di flusso riutilizzabili, N. Dashkevich, N. Gudimchuk e A. Korbalev per la fornitura di immagini per i personaggi, N. Gudimchuk e P. Zakharov per lo sviluppo di un protocollo e fornendo reagenti preparare semi microtubuli digossigenina, A. Potapenko aiuto con l&#39;editing del testo e gli altri membri del Grishchuk laboratorio per le punte e discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH concedere GM R01-098.389 e una borsa di studio pilota della Pennsylvania Muscle Institute a ELG, che è un Kimmel Scholar, da RFBR concede 12-04-00111-una proprietà di 13 04-40.190-H e 13 -04-40188-H, Accademia Russa delle Scienze Presidio Grants (Meccanismi di sistemi molecolari di integrazione e programmi di biologia cellulare molecolare e molecolari) per FI Ataullakhanov, NIH concedere GM R01 GM033787 a JR McIntosh, e una borsa di studio della Dynasty Dmitry Zimin Fondazione VAV

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti saggi singola molecola al giorno d&#39;oggi usano abitualmente coprioggetto appositamente trattata per ridurre drasticamente aspecifica di proteine ​​attaccare. La procedura che descriviamo qui è una modifica del protocollo originale sviluppato in laboratorio Howard 32, e troviamo che silanizzante i coprioggetti è valsa la pena, anche con saggi di perline basati DIC, che non utilizzano la fluorescenza. Chambers assemblati con tali coprioggetto mostrano superfici più puliti, ed i risultati ottenut...

I microtubuli sono altamente conservate strutture citoscheletriche che sono importanti per l&#39;architettura cellulare, la motilità cellulare, divisione cellulare, e trasporto intracellulare 1. Questi polimeri dinamici assemblare da tubulina in presenza di GTP, e si passa spontaneamente tra crescita e accorciando 2. I microtubuli sono molto sottili (solo 25 nm di diametro) quindi particolari tecniche ottiche per migliorare il contrasto dovrebbe essere utilizzato per osservare microtubuli con un microscopio ottico. Il lavoro precedente di questi polimeri esaminato il comportamento dinamico con contrasto di interferenza differenziale (DIC) 3. Questo ed analoghi studi in vitro hanno rivelato che, in condizioni tipiche sperimentali, i microtubuli subiscono catastrofe e passare alla depolimerizzazione solo raramente, una volta ogni 5-15 minuti (questa frequenza è di 7-15 mM concentrazione di tubulina solubile esaminati a 28-32 ° C ) 4. Diverse tecniche sono state quindi proposto di induzionee depolimerizzazione dei microtubuli in modo controllato. Microtubulo accorciamento può essere attivato da lavando via tubulina solubile 5,6, il taglio microtubuli con un raggio laser 7, oppure utilizzando microtubuli segmentati 8, come descritto qui. Impieghi precedenti utilizzando microtubuli segmentati, così come polimeri stocasticamente commutazione, ha trovato che i piccoli carichi intracellulari, come cromosomi, vescicole, e perle rivestite con proteine, possono muoversi alle estremità dei microtubuli accorciamento 9-13. Questo fenomeno è pensato per avere un&#39;implicazione diretta per i movimenti cromosomiche nelle cellule in mitosi, ed i meccanismi di fondo sono attualmente sotto inchiesta attivo 14-16. Recentemente, tecniche fluorescenti-based, tra la fluorescenza totale interna riflessione (TIRF) microscopia, sono stati impiegati per studiare la motilità con microtubuli dinamica finisce 17-24. Il vantaggio di questo approccio è che consente l&#39;esame di interaziones tra i microtubuli e proteine ​​microtubuli vincolante in tempo reale utilizzando proteine ​​marcate con differenti fluorofori. Diversi complessi proteici sono stati trovati a muoversi processively con allungamento e / o accorciando le estremità del microtubulo. Essi comprendono le proteine ​​associate ai microtubuli Dam1 10,12,18, Ska1 19, e XMAP215 20, così come i motori chinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 e CENP-E 24. Queste proteine ​​mostrano processive tip-tracking, che è fondamentalmente diversa da quella dei classici proteine ​​punta inseguimento come EB1 25. Anche se le molecole EB1 ei partner associati sembrano rimanere stabilmente associata a microtubuli dinamica finisce, le singole molecole rimangono vincolati alla punta microtubulo solo ~ 0,8 secondi, rapido scambio con la piscina solubile 26. Al contrario, processive punta-trackers, come Dam1, viaggiano con microtubuli finisce per molti micron, e la loro associazione con le punte dei microtubuli può durare per meventuali secondi. La punta associazione tempo, così come la velocità di inseguimento risultante, dipende fortemente dal numero di molecole che formano la punta inseguimento complesso 27. Ensemble di proteine ​​più grandi sono di solito molto migliori tip-trackers. Ad esempio, tali insiemi complessi come isolate cinetocori lievito possono rimanere agganciati al microtubulo estremità per 28 ore. Alcune proteine ​​microtubuli vincolante, ad esempio Ndc80 complesso proteico cinetocoro, sono stati trovati per essere in grado di monitorare con microtubuli termina a livello di singola molecola, ma Ndc80 è molto efficiente nel accoppiando il movimento del tallone carico 19,29-31. Così, per comprendere il meccanismo di ribaltamento inseguimento da diversi complessi proteici, così come i loro ruoli biologici, è importante esaminare punta-tracking in funzione del numero di molecole del complesso-punta inseguimento, nonché per determinare la capacità di questi complessi di esporre motilità collettiva sulla superficie del cordone carico. (Figura 1A). In primo luogo, i vetrini disponibili in commercio sono modificati per inserire tubo polietilene breve (protocollo 1). La camera di flusso microscopia riutilizzabile viene assemblato da un tale scorrimento e il plasma puliti e coprioggetto silanizzata (protocollo 2) 32-34 o chimicamente. Il volume della camera risultante è solo il 20-25 microlitri (o piccolo come 15 microlitri, vedere Nota 3 nel protocollo 1), compreso il volume del tubo di ingresso. Camere di flusso commercialmente disponibili possono anche essere utilizzati, ma il loro volume è di solito più grande, che porta alla inutile spreco di proteine. Se una camera più grande è impiegato, il volume di tutte le soluzioni nei protocolli indicati deve essere scalata proporzionalmente. Semi di microtubuli vengono poi preparati, ad esempio utilizzando lentamente idrolizzabile GTP analogico, GMPCPP (5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (protocollo 3, vedi anche Hyman &lt;em&gt; et al. 35). I semi vengono immobilizzati su un vetrino pulito e la superficie viene successivamente bloccate per impedire l&#39;assorbimento aspecifico di altre proteine ​​32 (protocollo 4 descrive semi immobilizzazione utilizzando digossigenina). I microtubuli segmentati possono quindi essere preparati utilizzando il protocollo 5. La motivazione principale di questo approccio è che i polimeri microtubuli dinamiche, che formano in presenza di GTP, possono essere stabilizzati temporaneamente aggiungendo le corte &quot;tappi&quot; di segmenti tubulina stabili, che contengono GMPCPP. Questi tappi contengono anche tubulina rodamina marcato, in modo che possano essere rimossi semplicemente illuminando il campo visivo con un laser 530-550 nm o una lampada a vapori di mercurio (Protocollo 6) 36. Intensità di fluorescenza del segnale punta-tracking può quindi essere utilizzato per stimare il numero di molecole che viaggiano con lo smontaggio estremità del microtubulo, tenendo conto della disuniformità del campo di illuminazione microscopio (Protocollo 7). Un approccio simile può essere utilizzatoper studiare le interazioni tra microtubuli depolimerizzazione e perline rivestite con proteine, preparato come descritto in 27 (protocollo 8). Alcune proteine ​​si legano facilmente alle pareti dei microtubuli segmentati, ma pinzette laser può anche essere utilizzato per contenere il tallone vicino alla parete del microtubulo, promuovendo in tal modo il suo legame.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Microtubulo depolimerizzazione in grado di fornire la forza di trasportare diversi complessi proteici e perline proteine ​​rivestite in vitro. I meccanismi sottostanti sono pensati per svolgere un ruolo vitale nel cromosoma movimenti microtubuli-dipendente durante la divisione cellulare, ma le proteine ​​interessate ei loro ruoli esatti sono mal definiti. Quindi, vi è una crescente necessità di sviluppare saggi con cui studiano tale motilità in vitro utilizzando componenti purificati e ambiente biochimico definito. I microtubuli, tuttavia, sono intrinsecamente instabili polimeri, la loro commutazione tra crescita e l&#39;accorciamento è stocastico e difficile da controllare. I protocolli che descriviamo qui approfittano dei microtubuli segmentati che sono fatti con il photoablatable stabilizzazione caps. Depolimerizzazione di tali microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo studi di motilità presso lo smontaggio estremità del microtubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per caRRY un&#39;analisi quantitativa del numero di molecole in complessi proteici fluorescenza marcata, che si muovono con processively microtubuli dinamica termina. Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore in questo ed altri saggi fluorescenti quantitative, coprioggetto devono essere trattati per ridurre l&#39;assorbimento aspecifico di proteine ​​solubili fluorescenza marcata. Protocolli dettagliati vengono forniti per tenere conto della disuniformità di illuminazione fluorescente, e determinare l&#39;intensità di un singolo fluoroforo utilizzando equidistante forma gaussiana. Infine, si descrive l&#39;uso dei microtubuli segmentati per studiare i movimenti microtubuli-dipendente delle microsfere rivestite di proteine, fornendo approfondimenti nella capacità di diverse proteine ​​motrici e non motori a coppia microtubuli depolimerizzazione al movimento merci processive.

Proteine ​​inseguimento con depolimerizzante microtubuli finisce. Lievito cinetocoro componente Dam1 è di gran lunga il miglior consiglio-tracker del microtubulo depolimerizzante finisce 14. Questo complesso di 10 subunità marcato con GFP può essere facilmente espresso e purificato da cellule batteriche 18,38, quindi si raccomanda di usarlo come controllo positivo per il test-punta inseguimento. Una proteina fluorescente che tiene traccia con la fine depolimerizzante di un m...

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Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

I microtubuli sono intrinsecamente polimeri instabili, e il loro passaggio tra la crescita e l&#39;accorciamento è stocastico e difficile da controllare. Qui si descrivono i protocolli utilizzando microtubuli segmentato con tappi di stabilizzazione photoablatable. Depolimerizzazione dei microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo l&#39;analisi delle proposte di risoluzione con lo smontaggio estremità del microtubulo.

Preparazione di segmentate microtubuli allo Studio Proposte guidato dal Smontaggio microtubuli Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Russian Academy of Sciences.  I microtubuli sono intrinsecamente polimeri instabili, e il loro passaggio tra la crescita e l'accorciamento è stocastico e difficile da controllare. Qui si descrivono i protocolli utilizzando microtubuli segmentato con tappi di stabilizzazione photoablatable. Depolimerizzazione dei microtubuli segmentati può essere attivato con alta risoluzione temporale e spaziale, aiutando in tal modo l'analisi delle proposte di risoluzione con lo smontaggio estremità del m...