Os autores gostariam de agradecer a FI Ataullakhanov para ajudar a projetar e fabricar câmaras de fluxo reutilizáveis, N. Dashkevich, N. e A. Gudimchuk Korbalev para fornecer imagens para figuras, N. Gudimchuk e P. Zakharov para o desenvolvimento de um protocolo e fornecendo reagentes para preparar sementes de microtúbulos marcadas com digoxigenina, A. Potapenko ajuda com edição de texto e outros membros da Grishchuk laboratório para dicas e discussões. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH conceder GM R01-098389 e uma concessão piloto da Pensilvânia Muscle Instituto ELG, que é um Kimmel Scholar, por RFBR concede 12-04-00111-a, 13-04-40190-H e 13 -04-40188-H, da Academia Russa de Ciências Presidium Grants (Mecanismos do Sistema de Integração Molecular e Biologia Celular Molecular programas e Molecular) para FI Ataullakhanov, NIH conceder GM R01 GM033787 para JR McIntosh, e um pós-doutorado bolsa da Fundação Dmitry Dynasty Zimin para VAV

Os autores não têm nada a revelar.

Muitos ensaios única molécula hoje em dia usam rotineiramente lamelas especialmente tratadas para reduzir drasticamente a aderência proteína inespecífica. O procedimento que descrevemos aqui é uma modificação do protocolo original desenvolvido no laboratório de Howard 32, e nós achamos que silanizar as lamelas vale bem a pena o esforço, mesmo com ensaios de contas baseadas em DIC, que não utilizam a fluorescência. Câmaras montadas com tais lamelas mostram superfícies muito mais limpas, e os res...

Os microtúbulos são estruturas altamente conservadas do citoesqueleto, que são importantes para a arquitectura celular, motilidade celular, divisão celular e o transporte intracelular 1. Estes polímeros dinâmicas montar a partir de tubulina na presença de GTP, e que exibir espontaneamente entre crescimento e encurtamento 2. Os microtúbulos são muito finas (apenas 25 nm de diâmetro), portanto, técnicas ópticas especiais para melhorar o contraste deve ser usada para observar microtúbulos com um microscópio de luz. Trabalhos anteriores com esses polímeros examinado seu comportamento dinâmico usando contraste de interferência diferencial (DIC) 3. Este e outros estudos in vitro mostraram que em condições experimentais típicas, os microtúbulos sofrer catástrofe e mude para a despolimerização apenas raramente, uma vez a cada 5-15 min (esta freqüência é de 7-15 mM concentração tubulina solúvel examinado em 28-32 ° C ) 4. Diferentes técnicas têm sido, assim, propôs a induçãoe despolimerização de microtúbulos de maneira controlada. Microtúbulos encurtamento pode ser desencadeada por lavagem para retirar tubulina solúvel 5,6, cortando microtúbulos com um feixe de laser 7, ou usando microtúbulos segmentados 8, tal como descrito aqui. Trabalhos anteriores utilizando microtúbulos segmentados, bem como polímeros estocasticamente de comutação, tem encontrado que as pequenas cargas intracelulares, tais como os cromossomas, vesículas, e pérolas revestidas com proteína, pode mover-se nas extremidades dos microtúbulos encurtamento 9-13. Este fenômeno é pensado para ter uma implicação direta para movimentos cromossômicas em células mitóticas, e os mecanismos subjacentes estão atualmente sob investigação ativa 14-16. Recentemente, técnicas fluorescentes à base, incluindo o total de fluorescência reflexão interna (TIRF) microscopia, foram utilizados para estudar a motilidade com microtúbulos dinâmica termina 17-24. A vantagem desta abordagem é que ela permite o exame de interacçãos entre os microtúbulos e proteínas de ligação de microtúbulos em tempo real, utilizando as proteínas marcadas com fluoróforos diferentes. Vários complexos de proteínas foram encontradas para mover processively com alongamento e / ou encurtar extremidades dos microtúbulos. Elas incluem as proteínas associadas a microtúbulos Dam1 10,12,18, Ska1 19, e XMAP215 20, bem como motores de cinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 e CENP-E 24. Estas proteínas apresentam processive ponta-tracking, que é fundamentalmente diferente daquele das proteínas de rastreamento de ponta clássicos como EB1 25. Embora as moléculas EB1 e os parceiros associados parecem permanecer estavelmente associada com microtúbulos dinâmica termina, as moléculas individuais permanecem ligados à extremidade do microtúbulo para apenas ~ 0,8 seg, rapidamente trocar com a piscina solúvel 26. Em contraste, processive ponta dos trackers, como Dam1, viajar com microtúbulos termina para muitos microns, e sua associação com dicas de microtúbulos pode durar mquaisquer segundos. A ponta do tempo de associação, bem como a taxa resultante de acompanhamento, depende fortemente o número de moléculas que formam o complexo de localização da ponta 27. Maiores conjuntos de proteínas são geralmente muito melhores ponta-trackers. Por exemplo, esses conjuntos complexos como os isolados de levedura cinetócoros pode permanecer acoplada a microtúbulos termina por 28 horas. Algumas proteínas de ligação de microtúbulos, por exemplo, complexo de proteínas kinetochore Ndc80, foram encontrados para ser incapaz de acompanhar com microtúbulos termina no mesmo nível molécula, ainda Ndc80 é muito eficiente em acoplar o movimento de cargas talão 19,29-31. Assim, para compreender o mecanismo de ponta de rastreamento por diferentes complexos de proteínas, bem como os seus papéis biológicos, é importante examinar ponta-rastreamento como uma função do número de moléculas do complexo de rastreamento de ponta, bem como para determinar a capacidade destes complexos para expor motilidade colectivo sobre a superfície de carga do grânulo. (Figura 1A). Em primeiro lugar, as lâminas de vidro disponíveis no mercado são modificados para fixar tubos de polietileno curto (Protocolo 1). A câmara de fluxo de microscopia reutilizável é, então, montado a partir de tal slide eo limpa-plasma e lamela silanizada (protocolo 2) 32-34 química ou. O volume da câmara resultante é apenas de 20-25 ul (ou tão pequenos quanto 15 ul, ver Nota 3 de protocolo 1), incluindo o volume do tubo de entrada. Câmaras de fluxo comercialmente disponíveis também podem ser utilizados, mas o seu volume é geralmente maior, o que leva ao desperdício desnecessário de proteínas. Se uma câmara maior é empregue, o volume de todas as soluções nos protocolos abaixo deve ser dimensionado proporcionalmente. Sementes de microtúbulos são então preparados, por exemplo, utilizando-se lentamente hidrolisável GTP analógico, GMPCPP (guanosina-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (protocolo 3, ver também Hyman &lt;in&gt; et al. 35). As sementes são imobilizadas sobre uma lamela de limpeza e a superfície é bloqueada posteriormente para impedir a absorção não específica de outras proteínas de 32 (protocolo de 4 descreve sementes imobilização utilizando digoxigenina). Os microtúbulos segmentado pode, então, ser preparado utilizando o Protocolo 5. A principal razão para esta abordagem é que os polímeros de microtúbulos dinâmicos, que formam na presença de GTP, podem ser estabilizadas pela adição temporariamente as curtas &quot;tampões&quot; de segmentos de tubulina estáveis, que contêm GMPCPP. Estas cápsulas contêm também tubulina Rodamina marcado, de modo que pode ser removido simplesmente através da iluminação do campo de visão com um laser de 530-550 nm, ou uma lâmpada de arco de mercúrio (Protocolo 6) 36. A intensidade de fluorescência do sinal de ponta-de controlo pode então ser utilizada para estimar o número de moléculas que se deslocam com as extremidades desmontagem de microtúbulos, tendo em conta a irregularidade da iluminação de campo do microscópio (Protocolo 7). Uma abordagem semelhante pode ser usadapara estudar as interacções entre os microtúbulos Despolimerização e pérolas revestidas com proteína, preparado como descrito em 27 (Protocolo 8). Algumas proteínas irão ligar-se facilmente às paredes dos microtúbulos segmentadas, mas pinças a laser também pode ser utilizado para segurar o cordão perto da parede de microtúbulos, promovendo assim a sua ligação.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Microtubule despolimerização pode fornecer força para o transporte de diferentes complexos de proteínas e pérolas revestidas de proteínas in vitro. Os mecanismos subjacentes são pensados ​​para jogar um papel vital nos movimentos do cromossoma dependente de microtúbulos durante a divisão celular, mas as proteínas relevantes e suas funções exatas são mal definido. Assim, existe uma necessidade crescente de desenvolver ensaios com a qual para estudar tal motilidade in vitro, utilizando os componentes purificados e meio bioquímico definido. Os microtúbulos, no entanto, são intrinsecamente instáveis ​​polímeros, a sua comutação entre crescimento e encurtamento é estocástica e difícil de controlar. Os protocolos que descrevemos aqui aproveitar os microtúbulos segmentados que são feitos com o photoablatable estabilização caps. Despolimerização desses microtúbulos segmentados podem ser acionados com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim os estudos de mobilidade nas extremidades desmontagem dos microtúbulos. Esta técnica pode ser usada para carry a uma análise quantitativa do número de moléculas em complexos de proteína fluorescente marcado, que se movem com processively dinâmica dos microtúbulos termina. Para optimizar a relação de sinal-para-ruído neste e em outros ensaios fluorescentes quantitativos, lamelas devem ser tratadas para reduzir a absorção não específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solúveis. Protocolos detalhados são fornecidos para ter em conta as irregularidades de iluminação fluorescente, e determinar a intensidade de um único fluoróforo usando ajuste de Gauss equidistante. Finalmente, descreve-se o uso de microtúbulos segmentadas para estudar movimentos das microesferas revestidas com proteínas dependentes de microtúbulos, fornecendo insights sobre a capacidade de diferentes proteínas do motor e não motores a par de microtúbulos despolimerização ao movimento de carga processiva.

Rastreamento com despolimerizando microtúbulos Protein termina. Yeast kinetochore componente Dam1 é de longe o melhor ponta-tracker do microtúbulos despolimerizando termina 14. O complexo de 10-subunidade marcada com GFP podem ser facilmente expressas e purificadas a partir de células bacterianas 18,38, portanto, recomendado usá-lo como um controlo positivo para o ensaio de localização da ponta. Uma proteína fluorescente que controla o fim da despolimerização de microtúb...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K visualizações.  Russian Academy of Sciences.  Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos. 