著者らは、プロトコルを開発し、するための試薬を提供するための再利用可能なフローチャンバーを設計·製造​​を支援するため、FI Ataullakhanov、N. Dashkevich、N.​​ GudimchukとA. Korbalev数字のために画像を提供するため、N. GudimchukとP.ザハロフに感謝したいと思いますテキスト編集やヒントや議論のためのGrishchukラボの他のメンバーと助けをジゴキシゲニン標識微小管の種、A.ポタペンコを準備します。この作品は、によって部分的にサポートされていましたNIH付与GM R01-098389とキンメル学者でELGにペンシルベニア州マッスル研究所からのパイロット助成金、RFBRは、12 04から00111 - 、13 - 04から40190-Hを付与し、13で-04-40188-H、FI Ataullakhanovに科学幹部会補助金（分子システムインテグレーションおよび分子機序および分子細胞生物学プログラム）のロシア科学アカデミー、NIHは、JRマッキントッシュにGM R01 GM033787を付与し、ドミトリーZimin王朝財団ポスドクフェローシップへVAV

著者らは、開示することは何もありません。

多くの単一分子アッセイは、最近日常大幅に非特異的なタンパク質の付着を低減するために、特別に処理カバーグラスを使用しています。我々はここで説明する手順では、ハワード·ラボ32で開発されたオリジナルのプロトコルの変形例であり、我々はカバースリップをシラン化することであっても蛍光を使用していないDICベースのビーズアッセイ、と努力の価値であることがわかり?...

微小管は高度に細胞構造、細胞運動性、細胞分裂、細胞内輸送および1のために重要である細胞骨格構造が保存されている。これらの動的なポリマーは、GTPの存在下でチューブから組み立て、そして、彼らは自然に成長と2の短縮を切り替える。微小管は、従って、コントラストを高めるために特殊な光学技術は、光学顕微鏡で微小管を観察するために使用されるべきである（直径がわずか25 nm）の非常に薄い。これらのポリマーを用いた以前の研究は、微分干渉コントラスト（DIC）3を使用して動的挙動を調べた。 試験管内でこれと同様の研究は、一般的な実験条件の下で、微小管は、まれにしか解重合に破局し、スイッチを受けていないことを明らかにした一回5〜15分間（この周波数は、28〜32℃で調べた7月15日ミリモル、可溶性チューブリン濃度である）4。異なる技術は、このようにインダクタに提案されている制御された方法でのE微小管脱重合。微小管の短縮は、ここで説明するように、離れて可溶性チューブ5,6を洗浄するレーザ光​​7と微小管を切断するか、またはセグメント化された微小管8を用いてトリガすることができる。セグメント化された微小管だけでなく、確率的に切り替えるポリマーを使用してこれまでの研究は、このような染色体、小胞、およびタンパク質をコーティングしたビーズのような小さな細胞内貨物は、短縮微小管9月13日の端に移動させることを見出した。この現象は、有糸分裂細胞における染色体の動きのための直接含意を持っていると考えられており、基本的なメカニズムは、アクティブな調査14〜16の下に現在されている。 最近では、全反射蛍光（TIRF）顕微鏡などの蛍光ベースの技術は、動的微小管と運動性を研究するために使用されてきたが17-24を終了します。このアプローチの利点は、相互作用の試験を可能にすることである異なる蛍光で標識したタンパク質を用いて、リアルタイムで微小管と微小管結合タンパク質間のS。いくつかのタンパク質複合体は、微小管末端を伸長及び/又は短縮してprocessively移動することが見出された。彼らは、微小管結合タンパク質DAM1 10,12,18、Ska1 19、およびXMAP215 20だけでなく、キネシンモーターKif18A 21,22、MCAK 23およびCENP-Eの24が含まれています。これらのタンパク質は、EB1 25のような古典的な先端追跡タンパク質のそれとは根本的に異なるセッ先端追跡を呈する。 EB1分子および関連パートナーは、安定的に、動的微小管に結合したままでいるように見えるものの、終了、個々の分子は急速に可溶性のプール26を交換するだけ〜0.8秒間、微小管の先端に結合したまま。これとは対照的に、進行的先端トラッカーは、DAM1のように、微小管との旅行が多くミクロンのために終了し、微小管の先端との関連は、男のために最後にすることができます任意の秒数。先端会合時間だけでなく、追跡の結果率は、先端追跡複雑な27を形成する分子の数に強く依存する。より大きなタンパク質のアンサンブルは、通常、はるかに優れた先端トラッカーです。例えば、単離された酵母動原体のような複雑なアセンブリは、微小管に結合されたままでは時間28で終了。いくつかの微小管結合タンパク質、 例えば Ndc80の動原体タンパク質複合体、微小管は、単一分子レベルで終了し、まだNdc80ビード貨物19,29-31の動きを結合する非常に効率的であるとともに追跡することができないことが見出されている。したがって、異なるタンパク質複合体、ならびにそれらの生物学的役割によって先端追尾のメカニズムを理解するためには、先端追跡複合体中の分子の数の関数としての先端トラッキングを調べるために、ならびに決定することが重要であるビーズ貨物の表面に集合的な運動性を発揮するこれらの複合体の能力。 図1A）を用いた実験を準備し、実施するための詳細なプロトコルを提供下。まず、市販のガラススライドは、短いポリエチレンチューブ（プロトコル1）を取り付けるために修飾される。再使用可能な顕微鏡流チャンバは、その後、スライドおよび化学的またはプラズマ洗浄、シラン化カバースリップ（プロトコル2）32-34から組み立てられる。結果として生じるチャンバ容積は、入口管の体積を含むのみ20-25液（又は15μlのできるだけ小さい、プロトコル1の注3を参照）である。市販のフローチャンバーを使用することもできるが、その体積は、タンパク質の不必要な浪費をもたらす、通常は大きくなる。大きなチャンバーを採用した場合は、以下のプロトコルのすべてのソリューションの量が比例して拡大縮小する必要があります。微小管の種子は、その後徐々に加水分解性GTP類似体、GMPCPP（グアノシン-5&#39;-[（α、β）-methyleno]三リン酸）（プロトコル3を使用して調製される、ハイマン&lt;も参照してください。EM&gt;ら35）。種子を洗浄し、カバースリップ上に固定され、表面は、その後、他のタンパク質の非特異的吸収を防ぐためにブロックされている32（プロトコル4を用いてジゴキシゲニン種子の固定化を記載）。セグメント化された微小管は、次いで、プロトコル5を用いて調製することができる。このアプローチの主な根拠は、GTPの存在下で形成動的微小管ポリマーは、GMPCPPを含有する安定なチューブセグメントの短い「キャップ」を付加することによって、一時的に安定させることができることである。これらのキャップはまた、ローダミン標識したチューブリンを含有するので、530〜550 nmのレーザーまたは水銀アークランプ（プロトコル6）36で視野を照明することによって簡単に除去することができる。先端トラッキング信号の蛍光強度は、次いで考慮顕微鏡視野照明（プロトコル7）のばらつきを考慮して、分解、微小管の端部に移動する分子の数を推定するために使用することができる。同様のアプローチを使用することができる微小管脱重合および27に記載したように調製したタンパク質被覆ビーズ（プロトコール8）との間の相互作用を研究する。いくつかのタンパク質は容易にセグメント化された微小管の壁に結合するが、レーザーピンセットはまた、それによって、その結合を促進し、微小管の壁の近くにビードを保持するために使用することができる。

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

微小管の解重合は、 インビトロで異なるタンパク質複合体およびタンパク質被覆ビーズを輸送する力を提供することができる。基本的なメカニズムは、細胞分裂時の微小管依存染色体の運動に重要な役割を果たしていると考えられているが、関連するタンパク質およびそれらの正確な役割は明確に定義されています。したがって、精製された成分と定義され、生化学的環境を用いて、インビトロでそのような運動性を研究するためのものでアッセイを開発する必要性が高まっている。微小管は、しかしながら、本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮それらの切り替えは、確率的と制御が困難である。我々はここで説明するプロトコルはphotoablatableがキャップを安定化して作られてセグメント化された微小管を利用しています。そのようなセグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管の端部に運動性の研究を補助する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。この技術は、約するために使用することができる動的な微小管が終了するとprocessively移動する蛍光標識されたタンパク質複合体中の分子数の定量分析を行っRRY。このにおける信号対雑音比、および他の定量的蛍光アッセイを最適化するために、カバーガラスを可溶性蛍光標識されたタンパク質の非特異的吸収を減少させるために処理されるべきである。詳細なプロトコルを考慮に蛍光照明ムラを取ると等距離ガウスフィットを使用して、単一のフルオロフォアの強度を決定するために提供される。最後に、進行的貨物の動きに結合する微小管脱重合に異なるモーターと非運動タンパク質の能力への洞察を提供し、タンパク質でコーティングされたマイクロビーズの微小管依存の動きを研究するセグメント化された微小管の使用を記載している。

微小管脱重合を追跡するタンパク質が終了する。酵母動原コンポーネントDAM1が圧倒的に脱重合微小管のベストのヒント-トラッカーである14を終了します。 GFPで標識されたこの10サブユニット複合体は、容易に発現し、細菌細胞18,38から精製し、私たちは、先端追跡アッセイのポジティブコントロールとして、それを使用することをお勧めすることができます。微...

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Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能でトリガすることができる。

逆アセンブル微小管端部によって駆動される運動を研究するセグメント化微小管の調製

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K ビュー.  Russian Academy of Sciences. 微小管は本質的に不安定なポリマーであり、成長との間の短縮その切り替えは、確率および制御することは困難である。ここでは、photoablatable安定キャップでセグメント化された微小管を使用してプロトコルを記述します。セグメント化された微小管の脱重合することにより、分解、微小管末端を有する運動の分析を支援する、高い時間および空間分解能...