המחברים מבקשים להודות לFI Ataullakhanov שעזרו לתכנן ולייצר זרימת תאים לשימוש חוזר, נ &#39;Dashkevich, נ&#39; וא &#39;Gudimchuk Korbalev למתן תמונות לדמויות, נ&#39; פ &#39;וGudimchuk זכרוב לפיתוח פרוטוקול ומתן ריאגנטים ל להכין זרעי microtubule כותרת digoxigenin, א Potapenko לעזרה בעריכת טקסט ולחברי הגילדה של המעבדה Grishchuk לעצות ודיונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק NIH GM-R01 098,389 ומענק טייס משריר פנסילבניה מכון לELG, שהוא Scholar קימל, על ידי RFBR מעניק 12-04-00,111-, 13-04-40,190-H ו13 -04-40188-H, אקדמיה הרוסית למדעי מענקי נשיאות (מנגנונים של אינטגרציה של המערכות המולקולרית ותוכניות ביולוגיה המולקולרית של תא ומולקולרי) לFI Ataullakhanov, מענק NIH GM R01 GM033787 לJR מקינטוש, ומלגה הבתר דמיטרי Zimin שושלת קרן ל ט&quot;ו

יש המחברים אין לחשוף.

מבחני מולקולה בודדים רבים בימינו משתמשים באופן שגרתי coverslips טיפול מיוחד כדי להפחית את דבק חלבון ספציפי באופן דרסטי. ההליך שאנו מתארים כאן הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי שפותח במעבדה של הווארד 32, ואנו מוצאים כי silanizing coverslips הוא גם שווה את המאמץ אפילו עם מבחני חרוז מבוסס דסק&quot;ש, שלא משתמשים בקרינה. צ&#39;יימברס התאסף עם coverslips כגון להראות משטחים הרבה יותר נקיים, והתוצאות שהתקבלו בנוכחות החלבון קושר microtubule מסיס הן לשעתק יותר, במיוחד אם נעשה שימוש בריכוז חלבון נמוך מאוד. השלבים הקריטיים ביותר להכנה מוצלחת של MTS המפולח הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטימיזציה של ריכוז טובולין ופעמים דגירה (שלבים 5.1-5.2). הפעמים והריכוזים שניתנו בפרוטוקול הם משוערים ועשויות להשתנות בהתאם להבדלים בהכנות טובולין, קאמרי נפח וכו &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספציפי והדוקקובץ מצורף של microtubule nucleators לcoverslip, ו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכולת לשלוט בזרימה במהירויות באופן מדויק. בידיים שלנו, את התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר ניסויים נערכים בזרימת התאים האטומים. </li></ol> היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שdepolymerization microtubule יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח תנועות בקצות microtubule הפירוק. בעזרת טכניקה זו, ניתן לשנות את המאגרים במהירות וניתן להוסיף מחייב חלבוני microtubule וחרוזים במגוון רחב של מאגרים לאחר microtubules יצר. זה מאפשר לחקר ההשפעות של חלבון על depolymerization microtubule בנפרד מהתפקידים האפשריים שלו בהרכבת microtubule. האפשרות זו שימושית אם החלבון גם יכול לקיים אינטראקציה עם טובולין מסיס, אשר עשוי להסוות האינטראקציות שלה עם microtubules. עם זאת, מאז טובולין החופשי, unpolymerized נמצא בתא, יש להשתמש בזהירות wתרנגולת לפרש את משמעות פיזיולוגית של תוצאות כאלה. המגבלה העיקרית של גישת microtubule המפולח הוא שזה לא מתאים ללמוד תנועות במהלך עצרת microtubule, או את ההשפעות של מעקב אחר חלבונים על אסון microtubule והצלה. לשאלות אלה, מבחני עם microtubules הדינמי גדל בנוכחות של טובולין מסיס הם מתאימים יותר. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שמאגרי תנועתיות צריכים להיות חופשיים מאנזימי הדחה חמצן. תערובות אנזים כזה, לדוגמא המבוססת על קטלאז וגלוקוז אוקסידאז 48, יכולה לשפר באופן משמעותי את חייו של מולקולות ניאון. עם זאת, אם ריאגנטים אלה משמשים assay microtubule המפולח, צילום האינדוקציה של פירוק היא נדירה כי microtubule כובעי אקונומיקה ללא התפוררות. במבחני הקרינה כמותית, השיעור של הלבנת תמיד צריך להילקח בחשבון, כפי שתואר לעיל, או למשל בהתייחסות23, במיוחד אם הם לא בשימוש תרופות אנטי הלבנת. מחייב חלבוני microtubule כמה נבדקו בassay microtubule המפולח הראו העדפה מחייבת לכותרת Rhodamine כובעי ייצוב לעומת מגזרי microtubule ללא תווית. מחייב את כובעים עשוי להפחית את החלק היחסי של חרוזים התהליכית, שכן חרוזים הקשורים כובע לעתים קרובות להתנתק microtubule כאשר הכובע מתפרק. לבסוף, נציין כי אם חרוזים מצופים מנוע ללכת לכיוון microtubule התוספת בסופו מהר מאוד, הם לעתים קרובות מגיעים לכובעים האדומים לפני depolymerization microtubule מופעל, ובמקרה כזה הם יהיו גם לנתק מmicrotubule וניסוי כזה לא יהיה פרודוקטיבי . לסיכום, את היכולת של חלבוני קושרי microtubule ללא פעילות מוטורית הגלומה לעקוב סוף קיצור microtubule היא תופעה מעניינת, ובכל זאת הבינה היטב. הפרוטוקולים שתוארו כאן צריכים לסייע מחקרים של יחסי ציבור כגוןoteins והמאפיינים שלהם במבחנה. תחבורת depolymerization תלויה microtubule ממלא תפקיד חשוב בהפרדת כרומוזום במהלך מיטוזה. לכן, אנו מקווים כי הטכניקות המתוארות כאן תהיה סופו של דבר לעזור כדי לקבל תובנה רבה יותר על המנגנונים של חלוקת תא.

Microtubules הם מאוד נשמרים מבני cytoskeletal כי הם חשובים לארכיטקטורה הסלולר, תנועתיות תא, חלוקת תא, והובלה תאית 1. פולימרים אלה דינמיים להרכיב מטובולין בנוכחות GTP, והם עוברים באופן ספונטני בין צמיחה וקיצור 2. Microtubules הם דקים מאוד (25 ננומטר רק בקוטר) ולכן טכניקות אופטיות מיוחדות כדי לשפר את צריך לשמש ניגוד להתבונן microtubules עם מיקרוסקופ אור. עבודה קודמת עם פולימרים אלו נבחנת ההתנהגות הדינמית שלהם באמצעות התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) 3. מחקרים במבחנה וזה דומה גילו כי תחת תנאי ניסוי טיפוסיים, microtubules לעבור קטסטרופה ומתג לdepolymerization רק לעתים רחוקות, פעם אחת בכל דקות 5-15 (התדר הזה הוא בשביל 7-15 ריכוז טובולין מסיס מ&quot;מ נבדק ב28-32 ° C &#39;) 4. טכניקות שונות ובכך הוצעו לinducdepolymerization microtubule דואר באופן מבוקר. קיצור microtubule יכול להיות מופעל על ידי שטיפת טובולין מסיס 5,6, חיתוך microtubules עם קרן לייזר 7, או שימוש בmicrotubules מפולחת 8, כפי שמתואר כאן. העבודה קודמת באמצעות microtubules המפולח, כמו גם פולימרים stochastically מיתוג, מצאה כי מטענים קטנים תאיים, כגון כרומוזומים, שלפוחית, וחרוזים מצופים חלבון, יכולים לנוע בקצות microtubules קיצור 9-13. הוא חשב תופעה זו יש השלכה ישירה לתנועות כרומוזום בתאי mitotic, והמנגנונים שבבסיס נמצאים כעת תחת חקירה פעילה 14-16. לאחרונה, טכניקות מבוססות פלורסנט, כוללים הקרינה הכוללת הפנימית ההשתקפות (TIRF) מיקרוסקופיה, כבר מועסקים ללמוד תנועתיות עם microtubule הדינמי מסתיים 17-24. היתרון של גישה זו הוא שהיא מאפשרת בדיקה של אינטראקציהים בין microtubules ומחייב חלבוני microtubule בזמן אמת באמצעות חלבונים שכותרתו עם fluorophores שונה. כמה קומפלקסי חלבונים נמצאו לעבור processively עם מתארך ו / או לקצר קצות microtubule. הם כוללים את חלבוני microtubule הקשורים Dam1 10,12,18, Ska1 19, וXMAP215 20, כמו גם מנועים kinesin Kif18A 21,22, MCAK 23 ו24 CENP-E. חלבונים אלה תערוכת קצה מעקב התהליכית, שהוא שונה מהותי מזו של חלבוני מעקב טיפ הקלאסיים כמו EB1 25. למרות שנראה מולקולות EB1 והשותפים הקשורים להישאר ביציבות קשורים microtubule הדינמי מסתיים, המולקולות בודדות יישארו מחויבות לקצה microtubule רק ~ שניות 0.8, מהירות החלפה עם הבריכה מסיסה 26. לעומת זאת, טיפ עוקבים התהליכית, כמו Dam1, לנסוע עם microtubule מסתיים עבור מיקרון רבים, והקשר שלהם עם עצות microtubule יכול להימשך מ &#39;<html> כל שניות. קצה זמן עמותה, כמו גם את השיעור של מעקב וכתוצאה מכך, תלוי בחום על מספר המולקולות היוצרים את 27 מורכבות מעקב הקצה. הרכבי חלבון גדולים יותר הם בדרך כלל-עוקבים אחר עצה הרבה יותר טוב. לדוגמא, מכלולים מורכבים כגון kinetochores השמרים המבודד יכולים להישאר מצמידים microtubule מסתיים במשך שעות 28. מחייב חלבוני microtubule מסוימים, למשל חלבון מורכב kinetochore Ndc80, כבר מצאתי להיות מסוגל לעקוב אחר עם microtubule מסתיים ברמת מולקולה בודדת, ובכל זאת Ndc80 הוא יעיל מאוד בצימוד תנועת מטענים חרוז 19,29-31. לכן, כדי להבין את המנגנון של קצה מעקב על ידי מתחמים שונים חלבון, כמו גם התפקידים הביולוגיים שלהם, חשוב לבחון את קצה מעקב כפונקציה של מספר המולקולות במתחם מעקב הקצה, כמו גם כדי לקבוע היכולת של קומפלקסים אלה להציג תנועתיות קולקטיבית על פני השטח של מטען חרוז. &gt; להלן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים להכין ולערוך ניסויים עם microtubules המפולח (איור 1 א). ראשית, שקופיות זכוכית הזמינות המסחרי שונה כדי לצרף צינורות קצרים פוליאתילן (1 לפרוטוקול). הזרימה מיקרוסקופית החדר לשימוש חוזר לאחר מכן הורכב משקופיות כאלה ו- ניקה פלזמה ו coverslip silanized (פרוטוקול 2) 32-34 כימי או. וכתוצאה מכך נפח התא הוא רק 20-25 μl (או קטן כמו 15 μl, ראה באור 3 ב 1 לפרוטוקול), ובכלל זה היקף צינורות היניקה. יכולים לשמש גם זרימת תאים זמינים באופן מסחרי, אבל הנפח שלהם הוא בדרך כלל גדול יותר, מה שמוביל לבזבוז המיותר של חלבונים. אם חדר גדול יותר הוא מועסק, היקף כל הפתרונות בפרוטוקולים להלן אמור להיות מדורגים באופן יחסי. לאחר מכן זרעי microtubule מוכנים, למשל באמצעות אנלוגי GTP Hydrolysable לאט, (אדנוזין Guanosine-5&#39;-[(α, β)-methyleno]) GMPCPP (פרוטוקול 3, ראה גם היימן &lt;em&gt; et al. 35). הזרעים הם משותקים על coverslip ניקה ועל פני השטח, נחסם לאחר מכן על מנת למנוע קליטה לא ספציפית של חלבונים אחרים 32 (פרוטוקול 4 מתאר חוסר תנועת זרעים באמצעות digoxigenin). אז יכול להיות מוכן microtubules המפולח באמצעות פרוטוקול 5. הרציונל העיקרי לגישה זו הוא כי פולימרים microtubule דינמיים, המהווים בנוכחות GTP, ניתן התייצבו באופן זמני על ידי הוספה &quot;כובעים&quot; קצרים של מגזרי טובולין יציבים, המכילים GMPCPP. כמוסות הללו גם מכילות טובולין שכותרת Rhodamine, כך שניתן יהיה להסירו פשוט על ידי מאיר שדה הראייה בלייזר 530-550 ננומטר או מנורת קשת כספית (פרוטוקול 6) 36. עוצמת הקרינה של אות קצה המעקב לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את מספר המולקולות שנוסעות עם קצות microtubule פירוק, תוך לקיחה בחשבון את חוסר האחידות של התאורה בשדה מיקרוסקופ (7 לפרוטוקול). גישה דומה ניתן להשתמש בםכדי לחקור אינטראקציות בין microtubules depolymerizing וחרוזים מצופה חלבון, שהוכנו כמתואר ב27 (פרוטוקול 8). חלבונים מסוימים בקלות יהיו לאגד את הקירות של microtubules המפולח, אלא גם פינצטה הלייזר יכולה לשמש כדי להחזיק את חרוז ליד קיר microtubule, ובכך לקדם אותה מחייב.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

depolymerization microtubule יכול לספק כוח להובלת קומפלקסי חלבונים שונים וחרוזים מצופים חלבון במבחנה. המנגנונים הם חשבו לשחק תפקיד חיוני בתנועות כרומוזום microtubule תלוי במהלך חלוקת תא, אך החלבונים הרלוונטיים והתפקידים המדויקים שלהם מעורפלים. לפיכך, יש צורך הולך וגדל לפיתוח מבחני שבה ללימודים כגון תנועתיות במבחנה באמצעות רכיבים מטוהרים וסביבה ביוכימית מוגדרת. Microtubules, לעומת זאת, מטבעם פולימרים יציבים; מיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. הפרוטוקולים שאנו מתארים כאן לנצל את microtubules המפולח שהם עשו עם photoablatable ייצוב כובעים. Depolymerization של microtubules המפולח כאלה יכולים להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע ללימודים של תנועתיות בקצות microtubule הפירוק. טכניקה זו יכולה לשמש כדי carry מתוך ניתוח כמותי של מספר המולקולות בקומפלקסי החלבונים שכותרת פלורסנטי, אשר להזיז processively עם microtubule הדינמי מסתיים. כדי לייעל את יחס בזה ואות לרעש מבחני ניאון כמותיים אחרים, יש להתייחס אליהם coverslips כדי להפחית את הספיגה ספציפיות של חלבוני fluorescently שכותרתו מסיסים. פרוטוקולים מפורטים מסופקים לקחת בחשבון את חוסר האחידות של תאורת ניאון, ולקבוע את עוצמת fluorophore יחיד באמצעות כושר גאוס במרחק שווה. לבסוף, אנו מתארים את השימוש של microtubules המפולח ללמוד תנועות microtubule תלוי של microbeads מצופה החלבון, המספקים תובנות על יכולת של חלבוני מנוע וnonmotor שונים לdepolymerization microtubule זוג לתנועת מטענים התהליכית.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends at JoVE.com

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

preparation-segmented-microtubules-to-study-motions-driven

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Russian Academy of Sciences.  Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע ...

Video: Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a genetically encoded marker for the positive ends of microtubules (EB3 labelled with tdTomato fluorescent protein) and high-speed, high-resolution, live-cell imaging using spinning disk confocal microscopy. Cell cycle synchronization and increased density of microtubules are achieved by inhibiting centrosomal separation in mitotic cells, and analysis of growth is performed using open-source U-Track software. The use of a bright and red-shifted fluorescent protein, in combination with the lower laser power and reduced exposure time required for spinning disk microscopy reduce phototoxicity and the probability of light-induced artifacts. This allows for imaging a larger number of cells in the same preparation while maintaining the cells in a growth medium under standard culture conditions. Because the analysis is performed in a supervised automatic fashion, the results are statistically robust and reproducible.

Here we present a robust and detailed method of microtubule dynamics analysis in cells synchronized in prometaphase using live-cell spinning disk confocal microscopy and MATLAB-based image processing.

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...