Esta pesquisa é apoiada por um Grant Scientist Nacional de Desenvolvimento (13SDG14420049) para AA da American Heart Association e fundos start-up da Universidade Estadual de Wayne. Somos gratos a Dr. Ronald W. Holz e Dr. Mary Bittner para fornecer conselhos sobre os preparativos adrenal bovina e Dr. Daniel Axelrod de assistência com a pTIRFM configurar e comentários úteis sobre o manuscrito. Syt-1 pHluorin foi utilizado com permissão do Dr. Gero Miesenböck (Universidade de Oxford). GCAMP5G foi obtida através Addgene. Agradecemos James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman e Praneeth Katrapti com a ajuda na otimização de diversas fases dos procedimentos descritos.

1. Configuração do Sistema PTIRF A técnica pTIRFM é construído sobre uma plataforma de microscópio invertido. Os feixes de laser são dirigidos por meio de uma porta de iluminação lateral e um cubo de filtro voltado para o lado nonpolarizing, e depois concentraram-se no plano focal posterior de uma objectiva 60X 1,49 NA TIRF. Duas lentes adicionais (1,6 x e 2x) no caminho de emissão entre o microscópio e camera EMCCD dar um tamanho final do pixel de cerca de 80 nm. Feixes de laser são guiados através de software controlado espelhos galvanômetro para comutação rápida entre reflexão interna epi-e total (TIR) ​​de iluminação. O protocolo descrito abaixo assume que a óptica para TIRF já estão posicionados sobre a mesa de ar nas posições ideais para excitação fluoróforo e de imagem. Ele descreve como a óptica de polarização são adicionados a um microscópio TIRF configuração existente para permitir a imagiologia de deformações da membrana celular. Um esquema de óptica set-up do nosso laboratório para gerar tanto TIR e polarizatTIR base de iões é apresentado na Figura 1A. O protocolo assume a utilização de um laser de 488 nm para a excitação das vesículas de proteínas fluorescentes e um laser de 561 nm, para a formação de imagens do corante de carbocianina, fez. <ol><li> Ligue todos os componentes do microscópio, lasers e computadores. </li><li> Dirigir um feixe de laser de 488 nm para o plano focal traseiro (BFP) da lente de 1,49 NA, tal como ilustrado na Figura 1A. Se o feixe de raios laser é focado sobre o PBF, que vai emergir colimada e aparecem como pequenas local bem definido no tecto directamente acima do objectivo. </li><li> Ajustar o espelho galvanómetro X (o espelho situado no plano de amostra equivalente) de modo que o feixe de laser é movido para fora do eixo e emerge do objectivo em ângulos progressivamente mais acentuada para o objectivo normais. </li><li> Em seguida, verifique se TIR seja alcançado. Adicionar 10 ul de microesferas fluorescentes para um volume de 1 ml do PSS em um prato de fundo de vidro. Apenas a fluorescência a partir de microesferas na parte inferior of o prato, mais próximo da interface de TIR, deve ser detectada. Detecção de microesferas flutuantes indica que o ângulo entre a luz incidente e normal objectivo é insuficiente. A seção abaixo descreve a configuração dos componentes ópticos necessários para geração de imagens baseado na polarização. </li><li> Utilizando o feixe de 488 nm, alinhado como um guia, ajustar a posição do feixe de laser em bruto 561 nm, de modo que se desloca ao longo de um percurso óptico idêntico. O laser de 561 nm será usado para geração de imagens do corante de carbocianina, fez. </li><li> Inserir uma lente divergente e espelhos jusante do laser de 561 nm. Usando os espelhos, ajustar o feixe de modo que ele é coaligned com o feixe de 488 nm e o ponto está no foco do tecto quando os espelhos galvanométricos estão na posição &quot;0&quot;. </li><li> Centralize uma placa de quarto de onda (QW) no caminho do feixe imediatamente a jusante da abertura do laser. Use uma QW que seja acromático ou sintonizado o comprimento de onda de excitação.Um QW irá circular polarizar qualquer luz polarizada linearmente, que entra com um ângulo de 45 ° com o eixo óptico. Alguns componentes ópticos, tais como os cubos de polarização, tem um viés atenuação em relação a um eixo de polarização. O QW pode ser rodado para compensar esta polarização. Este ajuste irá resultar em um feixe elipticamente polarizada. Um QW é necessário porque o próprio feixe de laser é altamente polarizada linearmente (verticalmente) à medida que emerge a partir da abertura. </li><li> Coloque um cubo de polarização (PC1) a jusante do feixe polarizado elipticamente. O cubo de polarização reflecte o componente vertical (y) do campo eléctrico e passa a componente horizontal (x). O cubo de polarização é colocado sobre um pequeno palco traduzindo para facilitar o alinhamento subsequente dos caminhos do feixe de polarização. </li><li> Use um segundo cubo polarizador (PC2) e espelhos (Figura 1A) para recombinar os feixes. </li><li> Coloque um obturador entre o primeiro cubo de polarização (PC1) e o co verticaisespelho mponent. Coloque um segundo obturador entre o espelho componente horizontal e segundo cubo polarização (PC2). Estes obturadores são controlados pelo software de imagem que permite ao usuário selecionar rapidamente entre as polarizações de feixe. </li><li> Use um filtro polarizador para verificar a orientação do campo elétrico em cada caminho do feixe. Um filtro de polarização apenas irá permitir a transmissão em linha com o eixo do filtro. </li><li> Verificar se as componentes vertical e horizontal do feixe de laser são alinhados uns com os outros e o feixe de 488 nm. Faça os ajustes necessários. As três vigas devem ser todos focados no BFP e emergir colimado do objetivo para o mesmo ponto no teto. Este ponto pode ser assinalado por um X para facilitar o alinhamento futuro. </li><li> Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo. Coloque o prato contendo microesferas fluorescentes (veja o passo 4 acima) sobre o objectivo. </li><li> Digite TIR movendo o espelho X galvanômetro. Em TIR, o componen verticaist do feixe é a s-pol e o componente horizontal do feixe é agora o p-pol. Ajustar a intensidade relativa entre as vigas, rodando a placa QW. Ver cada campo evanescente polarizado com uma amostra de rodamina, o qual está previsto para ser orientada aleatoriamente. Gire a placa QW para coincidir com as intensidades médias de pixel. Se necessário, adicione um filtro de densidade neutra em um caminho do feixe polarizado para atenuar sua intensidade. </li></ol> 2. Isolamento celular Cromafim Um procedimento para o isolamento de células cromafins saudáveis ​​a partir da glândula supra-renal de vitelo é fornecida abaixo. Adapta-se a partir de protocolos publicados anteriormente por Wick, Senter et ai. 19 e O&#39;Connor, Mahata et al. 20 Após o isolamento, as células foram electroporadas com o plasmídeo (s) de interesse, utilizando um sistema de electroporação. Este sistema resulta em 20-30% de células que expressam as proteínas fluorescentes desejados. Normalmente, 70% das células sobrevivem os eleitosprocesso roporation. Os detalhes dos componentes PSS e de mídia são fornecidos nas Tabelas 2, 3 e 4. <ol><li> Dois dias antes da preparação celular, o tratamento de 35 mm de fundo de vidro de qualidade óptica (0,17 mm de espessura) pratos com 1 ml de poli-D-lisina (0,1 mg / ml), seguido por 1,25 ml de colagénio bovino. Deixar pratos ar seco tecido cultura capô. </li><li> Obter glândulas adrenais bovinas do matadouro. Mantenha as glândulas no gelo, enquanto eles são transportados para o laboratório. As glândulas supra-renais de bovinos pode ser envolto em uma espessa camada de gordura. Use uma tesoura cirúrgica para remover o excesso de gordura e expor a abertura veia adrenal. Perfundir a veia com prep-PSS repetidamente até que a glândula é removida do sangue. </li><li> Em seguida, pipeta-se lentamente 2 mL de solução de TH-PSS para dentro da abertura da veia, até a glândula incha. Incubar as glândulas inflados a 37 ° C durante 15 min. Repetir o tratamento TH-PSS e incubar novamente. </li><li> Corte através do córtex adrenal exterior em torno da borda da glândula com scissors e descascar a glândula além de expor a medula. Usar um bisturi para raspar suavemente e separar a medula do tecido cortical. </li><li> Picar o medula com um par de lâminas de bisturi de 5-10 min. </li><li> Um passo final de digestão é necessário para isolar as células cromafins individuais. Despeje a suspensão de células picadas em um balão de agitação. Encher parcialmente o recipiente com uma proporção de 2:1 de TH-PSS (30 ml) para TL-PSS (15 ml) e incubar durante 30 min a 37 ° C enquanto gira a aproximadamente 100 rpm. </li><li> Separam-se as células cromafins individuais de tecido não digerido por filtração através de uma malha de 400 mM. Recolhe-se o filtrado. Centrifugar a 200 xg para sedimentar as células e ressuspender em gelo PSS frio. </li><li> Filtrar as células através de uma malha de 250 um, pelete, e finalmente ressuspender em tampão de electroporação (ver passo 2.9). </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e preparar-se para a transfecção. </li><li> Transfectar células com o sistema de acordo com a electroporaçãoas recomendações do fabricante. As condições precisas para eletroporação deve ser determinada empiricamente. Nota: Os ajustes que proporcionam o melhor equilíbrio entre a eficiência de transfecção e taxa de sobrevivência celular para esta preparação de células bovinas cromafins são 1.100 V, 40 ms, e um pulso. Nós estimamos que, com estas condições, 20-30% das células são transfectadas. Cerca de 30% das células não sobrevivem ao processo de electroporação. </li><li> Células da placa suavemente sobre poli-D-lisina e colagénio tratado pratos em 1 ml de meio electroporating aquecidos. </li><li> Coloque pratos numa incubadora a 37 ° C (5% CO 2). Adicionar 1 ml de meio antibiótico 2x a cada placa, após 6 h. Troque a mídia por meios normais no dia seguinte. </li><li> As células de cromafina são tipicamente trabalhada de 2-5 dias após a electroporação. </li></ol> 3. pTIRF Aquisição de Imagem <ol><li> Ligue o sistema de imagem e iniciar o software de aquisição. </li><li> Verificar que os lasers estão alinhados. Verifique evanescenteperfil de campo utilizando microesferas. </li><li> Prepare o sistema de perfusão global e local. Reservatórios solução limpa com filtrada deionizada H 2 O e preencher com basal e estimulando soluções PSS. </li><li> Antes de imagiologia células cromafins, verificar que os p-pol e s-pol excitações iluminar a mesma região do campo de visão e as intensidades de iluminação são mais ou menos equivalentes. Para fazer isso, encher um prato com fundo de vidro com 2 ml de PSS contendo rodamina com uma concentração final de 10 mM. Sequencialmente excitar a amostra rhodamine com p-pol e luz s-pol e capturar as imagens. Na prática, as emissões de P e S de DID são normalizados ao valor médio de P e S emissões de rodamina. Consulte as seções análise de imagem e de discussão para mais detalhes. </li><li> Agora vá para coloração de células cromafins bovinas com fez. Enxágüe meios de cultura do prato contendo as células cromafins e substituir com 2 ml de basal-PSS. Adicionar 10 ul de 10 mM de DID (diluída em etanol)directamente para a placa contendo as células. Agite suavemente prato para 2-10 segundos e remover a solução fiz + PSS. </li><li> Lave o prato 3-4x com basal-PSS para remover qualquer resíduo fez. As células são agora corado e pronto para utilizar. </li><li> Adicionar uma gota de óleo de imersão para o objectivo. Coloque prato contendo células cromafins fez corados em cima do objetivo. </li><li> Visualizando o prato seja através da objectiva ou da câmara, encontrar uma célula que é transfectadas com a proteína de interesse e corados com fez. Uma célula bem coradas apresenta uma emissão P nitidamente que realça os bordos da célula; a emissão de S deverá ser aproximadamente uniforme ao longo da pegada da célula (isto é, a região da célula que está aderente ao vidro e fotografada em TIRF). </li><li> Posicionar a agulha de perfusão local de modo que seja mais ou menos 100 mm de distância a partir da célula. </li><li> Concentre-se na membrana celular e ativar o hardware autofocus imediatamente antes da aquisição estimulação das células / imagem. &lt;/ Li&gt; <li> Comece a aquisição de imagem. Perfundir células durante 10 segundos com uma solução de base e, em seguida, durante 60 segundos com uma solução despolarizante, 56 mM de KCl. Adquirir imagens enquanto rapidamente cofragem entre 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (para monitorar as mudanças em P e S emissão de DID) e 488 nm de excitação (para a imagem da sonda vesícula transfectadas). Os exemplos de imagens obtidas durante as experiências são mostrados na Figura 2 e Figura 3. </li></ol> 4. Análise de Imagem Cálculos para processamento de imagem pode ser realizada com ImageJ, mas utilizando scripts em uma linguagem de programação flexível, como IDL ou Matlab pode aumentar significativamente a análise de transferência, automatizando a tarefa. Dois tipos de imagens devem ser calculados para obter informações topológico a partir de imagens de emissão matérias -. O P / S e P 2 S P / S informa sobre deformações de membrana locais, enquanto o S +2 P soma relatórios sobre a tintura total de membrana em uma determinada regiãodo campo. <ol><li> Todas as imagens devem ser fundo subtraído. Escolha um ROI off-celular, medir a intensidade média dos pixels na ROI e subtraindo esse valor de todos os pixels da pilha de imagens. </li><li> Para calcular P / S, dividir cada &quot;P&quot; frame emissão pela moldura posterior &quot;S&quot; de emissões (pixel a pixel). P / S varia de acordo com as intensidades relativas dos p-e s-pol excitações, desvios na sistema óptico, e franjas de interferência. Para reduzir estes efeitos, normalizar as relações de P / S obtidos a partir de emissão fez com o índice obtido com uma solução contendo 10 mM rhodamine 18. </li><li> Exocitose de DCV são individuais é evidente a partir de uma mudança brusca na intensidade de uma proteína fluorescente vesícula, tais como sinaptotagmina-1 pHluorin (Figura 2B). Determine mudanças em P / S e P 2 S pela média dos pixels em um raio de 240 nm ROI centrado sobre aumentos localizados na P / Sproporção em locais de exocitose. Quando a fusão ocorra sem um aumento evidente no P / S, o ROI é centrado sobre a região de fusão da DCV. </li><li> As simulações de computador pode ser realizada para interpretar P / S e P 2 S mudanças de intensidade de membrana em termos de geometrias simples de um poro de fusão de dilatação. Para mais informações sobre as simulações, consulte Anantharam et al. 18 </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

TIRFM baseado na polarização detecta alterações rápidas e submicroscópicas na topologia da membrana. Implementar a técnica é relativamente simples, especialmente se TIRF ótica já estão em vigor. Tudo o que é necessário é uma placa de quarto de onda, dois cubos de polarização, e persianas para separar p-pol e iluminação s-pol caminhos. A posição precisa destes componentes na tabela é geralmente ditado pelo espaço disponível. A fim de obter informação topológica de membrana, a sonda fluorescente utilizado deve intercala com uma orientação fixa, ou conhecido. A técnica, tal como descrito neste artigo, pressupõe o uso de corantes de carbocianina mas outros corantes, tais como FM1-43 14, pode também ser usado. O próprio procedimento de coloração membrana é simples. Células cultivadas exigem apenas uma breve exposição (menos de 10 segundos) a uma pequena quantidade de DII / fez para obter a rotulagem exuberante da membrana. Adicionando o excesso de corante leva à dispersão de luz AGGREGates no vidro que diminuem a qualidade de imagem. Over-incubação de células com corante leva a tingir interiorização que tem efeitos prejudiciais sobre a qualidade da imagem e, possivelmente, a viabilidade celular. Se uma célula é bem coradas, haverá distinção clara nas imagens de emissão de P e S. Como mostrado na Figura 2A, a emissão de P será nitidamente destacar as áreas da membrana que são oblíqua lamela (isto é, as bordas da pegada da célula), enquanto que a intensidade da emissão S será de aproximadamente uniforme ao longo da pegada da célula. Se uma distinção clara entre P e S não é aparente, então é possível que a célula é fracamente aderidas ao substrato ou a membrana celular não é saudável, e a célula não é usada para as experiências. Nossos estudos anteriores que descrevem pTIRFM utilizado DII como a sonda de membrana fluorescente. Aqui, utilizamos o fez porque ele é adequado para experimentos com imagens de duas cores que empregam GFP / pHluorin como o outro fluoróforo. Nós excitar fez with um laser de 561 nm, em vez de 640 a laser nm (o que está mais perto de seu pico de excitação), porque os alvejantes fluoróforo mais rapidamente em 640 nm. Apesar do facto de que o laser de 561 nm é a cauda de DID do espectro de excitação publicada, a fluorescência emitida de forma eficiente. Outra vantagem do laser nm 561 é que ela excita tanto Dii e fiz o que nos permite usar a mesma configuração de polarização para ambas as sondas. Note-se que a orientação do fluoróforo na membrana irá afectar a interpretação de topologia de membrana. Por exemplo, se um fluoróforo foram orientadas com os seus dipolos transição perpendicular ao plano da membrana (em vez de em paralelo, ou aproximadamente paralelo, como é o caso com DII ou fiz), então as regiões não planares da membrana será mais facilmente destacada pelo S em vez a emissão de P. Também foram descritas técnicas para o isolamento e a electroporação de células cromafins supra-renais de origem bovina. A célula chromaffin bovina é um excelente secretory modelo. Tem a vantagem de ser fácil de manter em cultura, em resposta a uma variedade de secretagogos, e possuindo grandes vesículas secretoras que podem ser facilmente visualizadas por microscopia de luz convencional. Para expressar as proteínas fluorescentes, as células são electroporados na suspensão antes do plaqueamento em placas de cultura tratadas com colagénio. Na nossa experiência, a eficiência de expressão é muito mais elevado do que com a electroporação tanto com Ca 2 +-fosfato ou reagentes LipofectAMINE. A desvantagem de electroporação é que ele requer mais células (como muitos não sobrevivem ao processo) e reagentes comerciais caros. Por razões que não são claras para nós, nem todos os membrana incorpora fez. Além disso, apenas uma fracção das células sobre o prato são transfectadas. Encontrar células que são transfectadas e estão manchados bem com DID pode ser demorado e é por isso otimizando as condições para coloração e eletroporação vale bem a pena o esforço. Em resumo, este umArtigo descreve como pTIRFM é implementado para monitorar as deformações de membrana rápidas e localizadas que ocorrem durante a fusão de vesículas de núcleo denso em células cromafins bovina. Embora uma única aplicação é discutida, a técnica é ideal para o estudo de outros processos biológicos que envolvem alterações em forma de membrana, incluindo endocitose, a citocinese e a motilidade celular.

A execução adequada de exocitose requer mudanças radicais na forma de bicamada de membrana para ser precisamente orquestrada. Antes da fusão, dobra local da membrana do plasma sob o grânulo ocorre, em parte para reduzir a barreira de energia para a interacção de bicamadas. Mais tarde, como membranas de fusão, as áreas de elevado grau de curvatura são geradas e devem ser estabilizados. Finalmente, as membranas fundidas devem ser dobradas para fora de sua forma inicial para expandir o poro de fusão e permitir liberação de conteúdo 1. Porque as membranas por si só não são susceptíveis de sofrer tais mudanças dramáticas e coordenadas, as proteínas são necessárias para mediar eventos. Mas como eles agem para influenciar mudanças na topologia da membrana durante o processo de fusão continua muito uma questão em aberto. Excelente em modelos in vitro, existe a visualizar a curvatura da membrana. O uso do EM negativo mancha, por exemplo, tem sido importante para moldar modelos moleculares atuais para as ações de dois grandes tráfico proteins - sinaptotagmina e dynamin (para revisões, ver Chapman 2 e Henshaw 3). A maioria dos ensaios em tempo real de exocitose não detectam curvatura diretamente. Em vez disso, a curvatura é inferida a partir de ensaios que informam sobre a cinética da libertação da carga de lúmen 4-8 ou mudanças na área de membrana 9-11. PTIRFM preenche a lacuna entre in vivo e in vitro, permitindo, medições diretas em tempo real das mudanças na micromorfologia membrana. PTIRFM, em um modo nonimaging, foi iniciada por Axelrod e colegas para medir a orientação do NPD-PE incorporados dentro de um modelo de membrana 12. A técnica foi então aplicado a visualizar as alterações dinâmicas em células vivas marcadas com DII e FM1-43 13-18. Em pTIRFM, duas polarizações campo evanescente são utilizados para excitar sequencialmente uma sonda incorporado à membrana: p-polarização (no plano de incidência) e s-polarização (perpendicular ao plano de incidência). Antes da imagiologia, a sonda - neste caso, fez - se rapidamente adicionados ao meio extracelular, e é permitido intercala nas membranas plasmáticas das células a serem estudadas. Nas regiões onde a membrana não é paralelo à lamela (como em um plissado membrana ou recuo), o fez também será não paralela. Portanto, tais regiões estarão excitável pelo feixe de p-pol. O feixe de p-pol será menos eficaz excitar fez em regiões da membrana que são na sua maioria paralelas à lamela. Imagens rácio pixel a pixel (P / S) relatórios sobre a emissão de seqüencial de excitação e p-s-pol de fez, portanto, destacar especificamente as regiões de deformação da membrana. Em teoria, as imagens relação P / S são sensíveis a pequenos ângulos de desvio da membrana plasmática da lamela, com a amplitude das mudanças previstas por simulações de computador 18. Imagens P / S são também independentes da distância a partir da superfície do fluoróforo e lamela fluoróforo locaisconcentração. Concentração de fluoróforo local em vez disso é fornecido por meio de imagens de relatórios sobre a soma de pixel-a-pixel da emissão P e duas vezes a emissão S (P 2 S). A medição P 2 S é sensível à geometria precisa da reentrância, com algumas, pouca, ou nenhuma alteração possível. Isto pode ser demonstrado por meio de simulações de computador que modelo transições de um poro de fusão a partir de um início (ou seja, com um gargalo estreito) para um estado mais tarde 16,18. A P 2 S de uma vesícula fundido ligado à membrana do plasma através de um pescoço estreito (e com mais fez nas proximidades da interface) está previsto para ser maior, por exemplo, do que a de uma vesícula fundida com uma poro muito mais larga (onde a Será que está dentro da parte mais fraca do campo evanescente). Neste artigo, discutimos como pTIRFM é implementada e utilizada para estudar as mudanças rápidas, localizadas em forma de membrana que ocorrem durante a fusão dos poros dilatação. Embora apenas uma aplicação é explicitamente discussed, os métodos podem ser estendidos para uma variedade de outros processos biológicos das células que directa ou indirectamente envolvem a remodelação da membrana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:277px;">iXon3 EMMCD Camera</td>
			<td style="width:179px;">Andor</td>
			<td style="width:147px;">897</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Side-mounted Filtercube Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">43 Series Ar-Ion Laser</td>
			<td>CVI Milles Griot Laser Optics</td>
			<td>543-AP-A01</td>
			<td>Tunable to 488nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sapphire 561 LP Diode Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>561nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scanning Galvo Mirror System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">VC3 Channel Focal Perfusion System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA VC3X4PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">QMM Quartz MicroManifold</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA QMM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10 PSI Pressure Regulator</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PR10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Manipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>TS 5000-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Six Station Neutral Density Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Stepper-motor Driven SmartShutter</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>IQ25-1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HQ412lp Dichroic Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC255583</td>
			<td>Joins 488nm and 561nm beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 100mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 488nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 250mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 561nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 125mm VIS 0</td>
			<td>Focuses both beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 50mm VIS 0</td>
			<td>Cemented to filter cube assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561rpc Dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561rpc</td>
			<td>Filtercube dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561_TIRF Emission Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561m_TIRF</td>
			<td>Filtercube emission</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UIS2 60x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td>NA 1.37</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MetaMorph Imaging Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiI Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>For Alignment Purposes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TH Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401135001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TL Liberse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DNAse I Type IV from bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiD Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">.22 &#956;m Membrane Syringe Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507</td>
			<td>0.5 microns</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Immersion Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Controlls galvo mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1965-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging plasma membrane deformations with ptirfm

Para ganhar novos insights sobre a dinâmica de exocitose, o nosso grupo se concentra sobre as mudanças na forma de bicamada lipídica que devem ser precisamente regulados durante a fusão das membranas das vesículas e plasma. Essas mudanças rápidas e localizadas são alcançados por meio de interações dinâmicas entre lipídios e proteínas especializadas que controlam a curvatura da membrana. A ausência de tais interações não só teria conseqüências devastadoras para a fusão da vesícula, mas uma série de outras funções celulares que envolvem o controle da forma de membrana. Nos últimos anos, a identidade de um certo número de proteínas com propriedades de formação de membrana foi determinada. O que continua faltando é um roteiro de quando, onde e como eles agem como fusão e progresso de liberação de conteúdo. A nossa compreensão dos eventos moleculares que permitem a remodelação da membrana tem sido historicamente limitada pela falta de métodos analíticos que são sensíveis à curvatura da membrana ou com a resolução temporal de track mudanças rápidas. PTIRFM satisfaz ambos os critérios. Discutimos como pTIRFM é implementado para visualizar e interpretar mudanças rápidas e submicrométricas na orientação das membranas das células cromafins durante denso núcleo vesícula (DCV) fusão. As células cromafins que usamos são isolados a partir de glândulas supra-renais de bovinos. A membrana é marcadas com um corante de carbocianina lipofílico, 1,1 &#39;-dioctadecilo-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-clorobenzenosulfonato, ou fez. DiD intercala no plano da membrana com uma orientação &quot;fixo&quot; e, portanto, é sensível à polarização do campo evanescente. A membrana celular fez-marcadas, seja sequencialmente animado com polarizações ortogonais de um laser de 561 nm (p-pol, s-pol). Um laser de 488 nm, é usado para visualizar os componentes de vesícula e tempo do momento de fusão. A exocitose é desencadeada por localmente perfusing células com uma solução de KCl despolarizante. A análise é realizada off-line utilizando software escrito sob medida para entender como é quemudanças de intensidade de emissões relacionadas com a fusão dos poros dilatação.

Técnicas de imagem TIRFM convencionais e polarizadas são implementados na mesma mesa de ar. A configuração dos elementos ópticos é semelhante, com a principal diferença de que a luz de excitação está polarizada (Figura 1A). A luz polarizada preferencialmente excita fluoróforos com dipolos de absorção na direção de polarização. Assim, para pTIRFM ser eficaz no acompanhamento membrana mudanças topológicas, a sonda que é usada tem de se intercalar na membrana com uma orientação fixa. Os corantes de carbocianina fluorescentes (DII, fez) intercalar em bicamadas lipídicas de forma orientada com dipolos de transição no plano da membrana (Figura 1B). Iluminação polarizada-P (Figura 1C) das membranas fez-rotulados excita seletivamente fluorophores lamela oblíqua (vermelho nas Figuras 1B e 1D). Rotulagem membrana exuberante de células cromafins é alcançada após abincubação com rief fez Figura 2A. mostra um exemplo de uma membrana celular que é corado bem. A, células aderentes saudável irá apresentar diferenças distintas nas emissões de P e S. A imagem mostra uma emissão P fronteira celular mais brilhante em relação ao resto da célula. A imagem de emissão S mostra fluorescência aproximadamente uniforme em toda a pegada de celular. Calculado de pixel-a-pixel P / S e P 2 S imagens são sensíveis à curvatura da membrana e a concentração de corante, respectivamente. A célula cromafina mostrado também foi transfectada com sinaptotagmina-1 pHluorin (Syt-1) para rotular vesículas secretoras (Figura 2B). A célula cromafina são estimuladas com KCl 56 mM para despolarizar a membrana da célula e desencadear a exocitose. Um número de pontos brilhantemente fluorescentes Syt-1 pHluorin de repente se tornam evidentes como as DCV são fusível (Figura 2B, painel direito). Uma caixa branca é desenhada em torno de um evento de fusão (Figura 2B, painel direito). Este evento i fusãos analisados ​​nas Figuras 2C e 2D. Figura 2C mostra quadro a quadro mudanças na Syt-1-pHluorin, P / S, e P 2 imagem S intensidades. A intensidade de fluorescência de Syt-1 diminui rapidamente como a proteína se difunde para longe do local de fusão (Figura 2D). O recuo que representa o complexo da membrana da vesícula / plasma fundido diminui a uma velocidade relativamente lenta (Nota gráficos na Figura 2D). A ilustração (Figura 2E) mostra uma interpretação dessas medidas. As deformações de membrana rápidas e localizadas mostrados na Figura 2 é um resultado de evocado-estímulo influxo de Ca2 +. Isto é mostrado na Figura 3A. Uma célula cromafina é transfectada com a genética de Ca 2 + indicador GCaMP5G 21,22 e estimuladas com KCl 56 mM. Membrana despolarização provoca um aumento significativo na fluorescência GCaMP5G ( <stro<html> ng&gt; As Figuras 3A e 3B), significando um aumento subplasmalemmal de Ca 2 +. Uma região de 30 x 20 pixels da célula seleccionada e quadro-por-quadro mudanças na GCaMP5G, P / S e P 2 S intensidades de pixel são mostrados nas imagens (Figura 3B) e os gráficos (Figura 3C). Time &quot;0&quot; designa o quadro antes de uma mudança de P / S é evidente (ou seja, o quadro antes de exocitose). As setas brancas indicam que a deformação da membrana (aumento de P / S) é acompanhada por uma redução na emissão de P 2 S. Proteína GCaMP5G citosólica é excluído área pelo DCV fundida. Note-se também a diminuição repentina na GCaMP5G intensidade no tempo 0 na Figura 3C, o painel esquerdo. O aumento de longa duração em P / S e diminuição de P 2 S sugerir um poro de fusão que dilata lentamente (Figura 3D). / Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Ilustrações para a técnica pTIRFM. A) Um esquema de combinação convencional com baseado na polarização TIRF de imagem é mostrado. Um quarto de onda (QW) placa é colocada na frente de uma safira do laser 561-nm para polarizar elipticamente o feixe de laser. Um cubo polarizador (PC1) é usado para separar as polarizações em componentes lineares verticais (V) e horizontal (H). As componentes vertical e horizontal tornam-se os p-pol e feixes de excitação s-pol, respectivamente, na superfície de TIR. Os caminhos p-pol e s-Pol estão fechadas de forma independente (S1 e S2). Eles são recombinados com espelhos e um segundo cubo polarizador (PC2). Juntam-se ao feixe de 488 nm (também fechou de forma independente, S3) por meio de um elemento da direcção do feixe consistindo de um espelho e nonpolarizing espelho dicróico (DC). As lentes (L) são utilizadas para expandir e concentrar as vigas. Combinado 488 nm e 561 nm vigas são dirigidos a uma porta lateral iluminação do microscópio via Galvanoespelhos metros (GM). Eles se concentram ao plano focal posterior (BFP) do objetivo. Rotulagem fotões emitidos a partir de fluoróforos são captadas com uma câmara EMCCD ligado a um PC. B) DiD é realizado através da incubação de células brevemente com o corante e lavar repetidamente para remover o excesso. DiD intercala na membrana com momentos de dipolo transição aproximadamente no plano da membrana. C) A luz incidente polarizado no plano de incidência (p-pol) cria um campo evanescente que é predominantemente polarizado normal, para a interface, como mostrado. D) Iluminação de uma membrana fez marcado com-p luz polarizada vai excitar seletivamente aqueles fluoróforos que são lamela oblíqua (RED). Se este fosse um campo evanescente polarizada s, esses fluoróforos que são paralelas à lamela que ser excitados em vez (PRETO). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig2.jpg" /> Figura 2. </s<html> trong&gt; celulares Monitoramento deformações de membrana com pTIRFM. A) Raw P e S imagens de emissões calculado juntamente com P / S e P 2 imagens de emissão S são mostrados. Barra de escala, 3,2 mM. B) Uma célula chromaffin expressar Syt-1 pHluorin é despolarizada com KCl. Um número de manchas fluorescentes luminosos (painel direito) indicam a fusão de DCV são individuais. Barra de escala, 3,2 mM. C) imagens quadro a quadro de uma fusão Syt-1 pHluorin DCV. Times (acima imagens) estão em segundos. Tempo 0 designa quadro antes da fusão da DCV. Correspondente P / S e P 2 S imagens de emissões também são mostrados. . Barra de escala é 1 mícron D) Gráficos para imagens em linha C. pontilhada é no tempo 0 -. Quadro fusão E) Uma possível interpretação dos resultados em C e D é mostrado.<html> blank &quot;&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig3.jpg" /> Figura 3. Deformações são um resultado do estímulo evocados influxo de Ca2 +. A) Uma célula chromaffin transfectadas com GCaMP5G é despolarizada com KCl 56 mM. O aumento resultante em GCaMP5G fluorescência significa um aumento na subplasmalemmal Ca 2 + níveis. B) imagens quadro-a-quadro de 30 x 20 pixels área de célula A. vezes acima as imagens são em segundos. Setas brancas indicam uma região de P / S aumento e diminuição P 2 S. Proteína citosólica GCaMP5G é excluído da região pela DCV fusão. Barra de escala, 1 mícron. C) Os gráficos de imagens mostradas em B. D) Uma possível interpretação dos resultados em B e C é mostrado.3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> iXon3 EMMCD Camera </td><td> Andor </td><td> 897 </td><td></td></tr><tr><td> IX81 Microscópio invertido </td><td> Olimpo </td><td></td><td> Montado na lateral Assembléia Filtercube </td></tr><tr><td> Laser Série 43 Ar-Ion </td><td> CVI Milles Griot Laser Optics </td><td> 543-AP-A01 </td><td> Ajustável para 488 nm </td></tr><tr><td> Safira 561 LP Diode Laser </td><td> Coerente </td><td></td><td> 561 nm </td></tr><tr><td> Digitalizando Galvo Espelho Sistema </td><td> Thorlabs </td><td> GVS102 </td><td></td></tr><tr><td> VC 3 Channel Focal Perfusão Sistema </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA VC3X4PP </td><td></td></tr><tr><td> QMM Quartz MicroManifold </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA QMM-4 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Regulador de pressão de 10 psi </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA PR10 </td><td></td></tr><tr><td> Manipulador </td><td> Burleigh </td><td> TS 5000-150 </td><td></td></tr><tr><td> Montada Achromatic Placa Quarter-Wave </td><td> Thorlabs </td><td> AQWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> 420-680 nm Polarização Refletor Cube </td><td> Thorlabs </td><td> PBS201 </td><td></td></tr><tr><td> Seis Estação Roda Densidade Neutra </td><td> Thorlabs </td><td> FW1AND </td><td></td></tr><tr><td> Stepper motor Impulsionada SmartShutter </td><td> Instrumentos Sutter </td><td> IQ25-1219 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro HQ412lp dicróica </td><td> Chroma </td><td> NC255583 </td><td> Junta-se 488 nm e 561 nm vigas </td></tr><tr><td> Revestido Plano-Concave Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCV 100 milímetros VIS 0 </td><td> Diverge 488 nm feixe </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Revestido Plano-Concave Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCV 250 milímetros VIS 0 </td><td> Diverge 561 nm feixe </td></tr><tr><td> Revestido Plano-Convex Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCX 125 milímetros VIS 0 </td><td> Concentra-se ambos os feixes </td></tr><tr><td> Revestido Plano-Convex Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCX 50 milímetros VIS 0 </td><td> Cimentada para filtrar montagem cubo </td></tr><tr><td> z488/561rpc dicróica </td><td> Chroma </td><td> z488/561rpc </td><td> Filtercube dicróica </td></tr><tr><td> Filtro z488/561_TIRF Emission </td><td> Chroma </td><td> z488/561m_TIRF </td><td> Emissão Filtercube </td></tr><tr><td> UIS2 60X Objective </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XO </td><td> NA 1,37 </td></tr><tr><td> Neon transfecção Sistema </td><td> Invitrogen </td><td> MPK 5000 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph Software Imaging </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> DII Membrane Dye </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Para o alinhamento Fins </td></tr><tr><td> TH Liberase </td><td> Roche </td><td> 5401135001 </td><td></td></tr><tr><td> TL Liberse </td><td> Roche </td><td> 5401020001 </td><td></td></tr><tr><td> DNAse I Tipo IV de bovinos </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Pescador </td><td> 0267110 </td><td></td></tr><tr><td> DiD Membrane Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D-7757 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine </td><td> Invitrogen </td><td> R634 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Filtro de 0,22 de membrana Seringa </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite policromático Microesferas vermelhos </td><td> Polysciences </td><td> 19507 </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Óleo de Imersão </td&gt; <td> Sigma </td><td> 56822 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td></td><td> Controles galvo espelhos </td></tr><tr><td> Spinner Flask </td><td> Bélico </td><td> 1965-00250 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Equipamento pTIRF Microscopia. <table><tbody><tr><td> Conteúdo </td><td> Prep-PSS </td><td> Basal-PSS </td><td> Stim-PSS </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 145 mM </td><td> 145 mM </td><td> 95 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,6 mM </td><td> 5,6 mM </td><td> 56 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> - </td><td> 2,2 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 15 mM </td><td> 15 mM </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 2,8 mM </td><td> 5,6 mM </td><td> 5,6 mM </td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> 1x </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Perfusão e soluções de preparação de células cromafins. <table><tbody><tr><td> Conteúdo </td><td> Electroporating Mídia </td><td> Normal chapeamento de mídia </td><td> 2x antibiótico Mídia </td></tr><tr><td> 1x DMEM/F-12 </td><td> 1 ml / placa </td><td> 2 ml / prato </td><td> 1 ml / placa </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> 10% </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Cytosine arabinofuranoside (CAF) </td><td> - </td><td> 1 ul / ml de 10 mM da </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicilina </td><td> - </td><td> 100 unidades / ml </td&gt; <td> 200 unidades / ml </td></tr><tr><td> Estreptomicina </td><td> - </td><td> 100 ug / ml </td><td> 200 ug / ml </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> - </td><td> 25 ng / mL </td><td> 50 ng / mL </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Mídia celular Cromafim. <table><tbody><tr><td> Conteúdo </td><td> TH-PSS </td><td> TL-PSS </td></tr><tr><td> Liberase TH </td><td> 2 ml </td><td> - </td></tr><tr><td> Liberase TL </td><td> - </td><td> 0,85 ml </td></tr><tr><td> Prep-PSS </td><td> 98,0 ml </td><td> 84,0 ml </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 8,75 mg </td><td> 7,4 mg </td></tr></tbody></table> Tabela 4. TH-PSS e TL-PSS Soluções.

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Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.5K visualizações.  Wayne State University.  Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana. 

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biologia

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinação da membrana plasmática de particionamento para proteínas associadas perifericamente

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.

Caracterização da ruptura de membrana de Plasma MLKL-mediada em Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

Isolando e Imagens Ao Vivo, Regiões de Marcapasso Intacta da Pelve Renal do Rato por Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...