Questa ricerca è supportata da una Scientist Development Grant National (13SDG14420049) per AA dalla American Heart Association e fondi di start-up dalla Wayne State University. Siamo in debito con il dottor Ronald W. Holz e il Dr. Mary Bittner per fornire consulenza per quanto riguarda i preparativi surrenali bovina e Dr. Daniel Axelrod per l&#39;assistenza con il pTIRFM set-up e utili commenti sul manoscritto. Syt-1 pHluorin è stato utilizzato con permesso del Dr. Gero Miesenböck (Università di Oxford). GCAMP5G è stato ottenuto attraverso Addgene. Ringraziamo James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, e Praneeth Katrapti con l&#39;aiuto sull&#39;ottimizzazione varie fasi delle procedure descritte.

1. Configurazione PTIRF sistema La tecnica pTIRFM è costruito su una piattaforma microscopio invertito. I raggi laser sono diretti attraverso una porta illuminazione laterale e una nonpolarizing orientati lateralmente filtro cubo, e poi concentrati sul piano focale posteriore di un obiettivo 60X 1,49 NA TIRF. Due lenti addizionali (1,6 x e 2x) nel percorso di emissione tra il microscopio e telecamera EMCCD danno una dimensione finale del pixel di circa 80 nm. I raggi laser sono guidati mediante specchi galvanometro software controllata per un rapido passaggio tra riflessione interna-epi e totale (TIR) ​​illuminazione. Il protocollo descritto di seguito presuppone che ottiche per TIRF sono già posizionati sul tavolo aria nelle posizioni ottimali per eccitazione fluoroforo e imaging. Esso descrive come ottiche di polarizzazione vengono aggiunti ad un esistente microscopio TIRF set-up per consentire l&#39;imaging di deformazioni della membrana cellulare. Uno schema di set-up ottico del nostro laboratorio per la generazione sia per TIR e polarizatTIR base ION è mostrato nella Figura 1A. Il protocollo presuppone l&#39;utilizzo di un laser a 488 nm per l&#39;eccitazione di proteine ​​vescicole fluorescenti e un laser 561 nm per l&#39;imaging del colorante carbocyanine, DID. <ol><li> Accendere tutti i componenti del microscopio, laser e computer. </li><li> Dirigere un fascio dal laser 488 nm al piano focale posteriore (BFP) della lente 1,49 NA come illustrato nella Figura 1A. Se il fascio laser viene focalizzato sulla BFP, esso emergerà collimato e appaiono come piccolo punto ben definito sul soffitto direttamente sopra l&#39;obiettivo. </li><li> Regolare lo specchio X galvanometro (specchio situato nel piano del campione equivalente) in modo che il raggio laser viene spostato fuori asse e fuoriesce dall&#39;obiettivo del perpendicolarmente progressivamente più ripidi al normale obiettivo. </li><li> Avanti, verificare che TIR è raggiunto. Aggiungere 10 ml di microsfere fluorescenti ad un volume di 1 ml PSS in un piatto fondo di vetro. Fluorescenza solo da microsfere sul fondo of il piatto, più vicino all&#39;interfaccia TIR, dovrebbe essere rilevata. Rilevamento di microsfere flottanti significa che l&#39;angolo tra la luce incidente e la normale obiettivo è insufficiente. La sezione seguente descrive la configurazione dei componenti ottici necessari per l&#39;imaging basato polarizzazione. </li><li> Utilizzando il fascio allineato 488 nm come guida, regolare la posizione del greggio raggio laser 561 nm per cui sta viaggiando lungo un percorso ottico identico. Il laser 561 nm verrà utilizzata per l&#39;imaging del colorante carbocyanine, DID. </li><li> Inserire una lente divergente e specchi valle del laser 561 nm. Utilizzando gli specchi, regolare il fascio in modo che sia coaligned con il fascio 488 nm e il punto è a fuoco sul soffitto quando gli specchi galvanometro sono in posizione &quot;0&quot;. </li><li> Centrare una lamina a quarto d&#39;onda (QW) nel percorso ottico immediatamente a valle dell&#39;apertura laser. Utilizzare un QW che è o acromatica o sintonizzato sulla lunghezza d&#39;onda di eccitazione.Un QW sarà circolarmente polarizzare qualsiasi luce linearmente polarizzata che entra ad un angolo di 45 ° con l&#39;asse ottico. Alcuni componenti ottici, come i cubetti di polarizzazione, vi è una propensione attenuazione verso un asse di polarizzazione. Il QW può essere ruotata per compensare questa distorsione. Tale adeguamento si tradurrà in un fascio ellitticamente polarizzato. Un QW è necessario perché il fascio laser stesso altamente è polarizzata linearmente (verticale) come emerge dalla apertura. </li><li> Collocare un cubo polarizzazione (PC1) a valle del fascio polarizzato ellitticamente. Il cubo polarizzazione riflette la (y) componente verticale del campo elettrico e passa il (x) componente orizzontale. Il cubo polarizzazione è posto su un piccolo palco traslante per facilitare la successiva allineamento dei percorsi ottici di polarizzazione. </li><li> Utilizzare un secondo cubo polarizzatore (PC2) e specchi (Figura 1A) per ricombinare le travi. </li><li> Posizionare un otturatore tra il primo cubo di polarizzazione (PC1) e il co verticalespecchio mponent. Posizionare un secondo scatto tra lo specchio componente orizzontale e secondo cubo di polarizzazione (PC2). Queste persiane sono controllati dal software di imaging che consente all&#39;utente di selezionare rapidamente tra polarizzazioni fascio. </li><li> Utilizzare un filtro polarizzatore per verificare l&#39;orientamento del campo elettrico in ciascun percorso ottico. Un filtro polarizzatore solo consentirà trasmissione in linea con l&#39;asse del filtro. </li><li> Verificare che i componenti verticale ed orizzontale del fascio laser sono allineati tra loro e il fascio 488 nm. Effettuare le regolazioni necessarie. I tre fasci dovrebbero essere concentrati sul BFP ed emergono collimata dall&#39;obiettivo allo stesso punto sul soffitto. Questo punto può essere contrassegnato da una X per facilitare l&#39;allineamento futuro. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sull&#39;obiettivo. Porre la capsula contenente microsfere fluorescenti (vedi punto 4) sull&#39;obiettivo. </li><li> Inserisci TIR spostando lo specchio X galvanometro. In TIR, la componen verticalet del fascio è la s-pol e la componente orizzontale del fascio è ora il p-pol. Regolare l&#39;intensità relativa tra le travi ruotando la piastra QW. Visualizzare ogni campo evanescente polarizzata con un campione rodamina, che si prevede sia orientato in modo casuale. Ruotare la piastra QW per abbinare le intensità media dei pixel. Se necessario, aggiungere un filtro neutro in un percorso di fascio polarizzato per attenuare l&#39;intensità. </li></ol> 2. Isolamento delle cellule cromaffini Una procedura per isolare cellule cromaffini sane dalla ghiandola surrenale vitello è il seguente. Si è adattato da protocolli precedentemente pubblicati da Wick, Senter, et al. 19 e O&#39;Connor, Mahata et al. 20 Dopo l&#39;isolamento, le cellule sono elettroporate con il plasmide (s) di interesse utilizzando un sistema di elettroporazione. Risultati di questo sistema in 20-30% di cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti desiderati. In genere, il 70% delle cellule sopravvivono elettiprocesso roporation. I dettagli dei componenti PSS e multimediali sono ottenute nelle tabelle 2, 3 e 4. <ol><li> Due giorni prima della preparazione delle cellule, il trattamento di 35 mm piatti con fondo di vetro qualità ottica (0,17 mm di spessore) con 1 ml di poli-D-lisina (0,1 mg / ml) seguita da 1,25 ml collagene bovino. Lasciare asciugare i piatti in cappa di coltura tissutale. </li><li> Ottenere ghiandole surrenali bovini da macello. Mantenere le ghiandole sul ghiaccio mentre sono trasportati al laboratorio. Le ghiandole surrenali bovina possono essere racchiusi in uno spesso strato di grasso. Usare le forbici chirurgiche per rimuovere il grasso in eccesso ed esporre l&#39;apertura vena surrenalica. Profumato la vena con prep-PSS ripetutamente fino a quando la ghiandola viene spurgato di sangue. </li><li> Successivamente, pipettare lentamente 2 ml di soluzione TH-PSS nell&#39;apertura vena fino agli ghiandola si gonfia. Incubare le ghiandole gonfiate a 37 ° C per 15 min. Ripetere il trattamento TH-PSS e incubare di nuovo. </li><li> Tagliare attraverso la corteccia surrenale esterno intorno al bordo della ghiandola con scissors e sbucciare la ghiandola a parte per esporre il midollo. Utilizzare un bisturi per raschiare delicatamente e separare il midollo dal tessuto corticale. </li><li> Tritare il midollo con una coppia di lame di bisturi per 5-10 min. </li><li> Una fase di digestione finale è necessario isolare cellule cromaffini individuali. Versare la sospensione cellulare macinata in un pallone filatrice. Riempire parzialmente il pallone con un rapporto 2:1 di TH-PSS (30 ml) di TL-PSS (15 ml) e incubare per 30 min a 37 ° C, mentre la filatura a circa 100 rpm. </li><li> Separare le singole cellule cromaffini dal tessuto non digerito filtrando attraverso una maglia 400 micron. Raccogliere il filtrato. Centrifugare a 200 xg per far sedimentare le cellule e risospendere in ghiaccio PSS freddo. </li><li> Filtrare le cellule attraverso una maglia 250 micron, pellet, e, infine, risospendere in tampone elettroporazione (vedi passo 2.9). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare per la trasfezione. </li><li> Trasfettare cellule con il sistema di elettroporazione secondoraccomandazioni del fabbricante. Le condizioni precise per l&#39;elettroporazione devono essere determinati empiricamente. Nota: Le impostazioni che offrono il miglior rapporto tra efficienza di trasfezione e la cella tasso di sopravvivenza per questa preparazione di cellule bovine cromaffini sono 1.100 V, 40 msec e 1 impulso. Stimiamo che con queste condizioni, il 20-30% delle cellule sono transfettate. Circa il 30% delle cellule non sopravvivono al processo di elettroporazione. </li><li> Cellule piastra delicatamente su poli-D-lisina e collagene trattati piatti in 1 ml di mezzi di comunicazione electroporating riscaldati. </li><li> Posizionare piatti in un incubatore a 37 ° C (5% CO 2). Aggiungere 1 ml di mezzi di antibiotici 2x per ogni piatto dopo 6 ore. Modificare il supporto ai media normale il giorno successivo. </li><li> Cellule cromaffini sono tipicamente esposte 2-5 giorni dopo l&#39;elettroporazione. </li></ol> 3. pTIRF Acquisizione Immagine <ol><li> Accendere il sistema di imaging e avviare il software di acquisizione. </li><li> Verificare che i laser siano allineati. Controllare evanescenteProfilo campo utilizzando microsfere. </li><li> Preparare il sistema di perfusione globale e locale. Serbatoi di soluzione puliti con filtrata deionizzata H 2 O e si riempiono di basale e stimolanti soluzioni PSS. </li><li> Prima di imaging cellule cromaffini, verificare che i p-pol e s-pol eccitazioni illuminano la stessa regione del campo visivo e che le intensità di illuminazione sono più o meno equivalenti. A tale scopo, riempire un piatto fondo di vetro con 2 ml di PSS contenenti rodamina ad una concentrazione finale di 10 mM. Sequenzialmente eccitare il campione rhodamine con p-pol e la luce s-pol e catturare le immagini. In pratica, le emissioni P e S da DID sono normalizzati per la media della P e S emissioni rodamina. Vedere le sezioni di analisi di immagine e di discussione per ulteriori dettagli. </li><li> Ora procedere alla colorazione delle cellule cromaffini bovine con DID. Risciacquare coltura dal piatto contenente le cellule cromaffini e sostituire con 2 ml di basal-PSS. Aggiungere 10 ml di 10 mM DID (diluito in etanolo)direttamente al piatto contenente le cellule. Agitare delicatamente piatto per 2-10 secondi e rimuovere la DID soluzione + PSS. </li><li> Lavare il piatto 3-4x con basale-PSS per rimuovere eventuali residui DID. Le cellule sono ora macchiati e pronto all&#39;uso. </li><li> Aggiungere una goccia di olio di immersione all&#39;obiettivo. Porre piatto contenente cellule cromaffini DID colorate sulla parte superiore dell&#39;obiettivo. </li><li> Visualizzazione del piatto sia attraverso l&#39;obiettivo o la fotocamera, trovare una cella che è trasfettate con la proteina di interesse e colorate con DID. Una cella ben colorato presenta un&#39;emissione P che evidenzia vividamente i bordi della cella; l&#39;emissione S dovrebbe essere all&#39;incirca uniforme attraverso l&#39;impronta cella (cioè la regione della cella che si aderisce al vetro e ripreso in TIRF). </li><li> Posizionare l&#39;ago perfusione locale in modo che sia circa 100 micron dalla cella. </li><li> Concentrarsi sulla membrana cellulare ed attivare l&#39;hardware autofocus immediatamente prima dell&#39;acquisizione stimolazione cellulare / immagine. &lt;/ Li&gt; <li> Inizia l&#39;acquisizione delle immagini. Perfusione cellule per 10 secondi con una soluzione basale e poi per 60 secondi con una soluzione depolarizzante 56 mM KCl. Acquisire immagini mentre rapidamente casseforme tra 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (per monitorare i cambiamenti in P e S emissione di fatto) e 488 nm di eccitazione (per l&#39;immagine della sonda vescicola transfettate). Esempi di immagini acquisite durante gli esperimenti sono mostrati in Figura 2 e Figura 3. </li></ol> 4. Image Analysis I calcoli per l&#39;elaborazione delle immagini possono essere effettuate con ImageJ, ma gli script che utilizzano in un linguaggio di programmazione flessibile come IDL o Matlab possono aumentare notevolmente la velocità di analisi automatizzando il compito. Due tipi di immagini devono essere calcolati per ottenere informazioni topologiche da immagini di emissione prime. - P / S e P +2 S P / S riferisce su deformazioni della membrana locali mentre il P +2 S somma riferisce sulla colorante membrana totale in una data regionedel campo. <ol><li> Tutte le immagini devono essere sottratti sfondo. Scegliere un ROI off-cella, misurare l&#39;intensità media dei pixel nella ROI, e sottraendo tale valore da tutti i pixel della serie di immagini. </li><li> Per calcolare P / S, dividere ogni &quot;P&quot; frame emissione dal successivo frame &quot;S&quot; emissione (pixel-per-pixel). P / S varia con le intensità relative dei p-e s-pol eccitazioni, distorsioni nel sistema ottico, e frange di interferenza. Per ridurre questi effetti, normalizzare i rapporti P / S dal ottenuti da Lo emissione al rapporto ottenuto con una soluzione contenente rodamina mm 10 18. </li><li> Esocitosi dei singoli DCVs è evidente da un improvviso cambiamento di intensità di una proteina fluorescente vescicola, come sinaptotagmina-1 pHluorin (Figura 2B). Determinare le variazioni di P / S e P +2 S facendo la media dei pixel in una ROI raggio 240 nm centrata su aumenti localizzati di P / Srapporto in siti di esocitosi. Quando si verifica la fusione senza un evidente aumento P / S, il ROI sia centrato sulla regione del DCV fusione. </li><li> Simulazioni al computer possono essere eseguite per interpretare +2 S membrana variazioni di intensità P / S e P in termini di semplici forme geometriche di un poro dilatazione fusione. Per i dettagli delle simulazioni, vedere Anantharam et al 18. </li></ol>

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Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

TIRFM base di polarizzazione rileva cambiamenti rapidi e submicroscopici nella topologia di membrana. Implementare la tecnica è relativamente semplice, soprattutto se l&#39;ottica TIRF sono già in atto. Tutto quello che serve è un piatto a quarto d&#39;onda, due cubi polarizzatori, e tapparelle per separare i percorsi p-pol e illuminazione s-pol. La posizione precisa di questi componenti sul tavolo è solitamente dettata dalla spazio disponibile. Per ottenere informazioni membrana topologica, la sonda fluorescente utilizzato deve intercalare con un orientamento fisso o conosciuto. La tecnica, come descritto in questo articolo, presuppone l&#39;utilizzo di coloranti carbocyanine ma altri coloranti, come FM1-43 14, possono anche essere utilizzati. La procedura di colorazione membrana stessa è semplice. Cellule coltivate richiedono solo una breve esposizione (meno di 10 sec) ad una piccola quantità di DII / DID per ottenere l&#39;etichettatura esuberante della membrana. L&#39;aggiunta di colorante in eccesso porta alla luce dispersione AGGREGAtes sul vetro che diminuiscono la qualità dell&#39;immagine. Over-incubando le cellule con colorante porta a tingere di interiorizzazione che ha effetti dannosi sulla qualità dell&#39;immagine e possibilmente la vitalità cellulare. Se una cella è macchiato bene, ci sarà chiara distinzione nelle immagini di emissione P e S. Come mostrato in Figura 2A, l&#39;emissione P sarà vividamente evidenziare aree della membrana che sono oblique coprioggetto (cioè i bordi del footprint cella) mentre l&#39;intensità di emissione S sarà all&#39;incirca uniforme su impronta cella. Se una chiara distinzione tra P e S non è evidente, allora è possibile che la cellula è scarsamente aderire al substrato o la membrana cellulare non è sano, e la cella non viene utilizzato per esperimenti. Nostri studi precedenti che descrivono pTIRFM utilizzati Dii come la sonda fluorescente membrana. Qui, utilizziamo fatto perché è adatto per gli esperimenti di imaging a due colori che impiegano GFP / pHluorin come l&#39;altro fluoroforo. Si eccitano DID wi° Un laser 561 nm anziché 640 nm laser (che è più vicino al suo picco eccitazione) perché i candeggianti più rapidamente fluoroforo a 640 nm. Nonostante il fatto che il laser 561 nm è sulla coda Lo spettro di eccitazione pubblicato, la fluorescenza emessa efficiente. Un altro vantaggio del laser 561 nm è che si eccita entrambi i Dii e ha fatto ci permette di utilizzare la stessa configurazione di polarizzazione per entrambe le sonde. Notare che l&#39;orientamento del fluoroforo nella membrana influenzerà l&#39;interpretazione della topologia membrana. Ad esempio, se un fluoroforo erano orientati con i suoi dipoli di transizione perpendicolare al piano di membrana (anziché parallelo, o quasi parallelo, come è il caso con DII o DID), poi regioni di membrana non planari saranno più facilmente evidenziata dalla S anziché l&#39;emissione P. Abbiamo anche descritto le tecniche per l&#39;isolamento e l&#39;elettroporazione di cellule cromaffini surrenali bovine. La cella cromaffine bovina è un ottimo smodello ecretory. Ha il vantaggio di essere facile da mantenere in coltura, sensibile ad una varietà di secretogogues, e possedendo grandi vescicole secretorie che sono prontamente visualizzabili alla microscopia ottica convenzionale. Per esprimere proteine ​​fluorescenti, le cellule sono elettroporati in sospensione prima di placcatura sulla cultura piatti collagene trattati. Nella nostra esperienza, efficienza espressione è molto più alto con elettroporazione che sia con Ca 2 +-fosfato o reagenti lipofectamina. Lo svantaggio di elettroporazione è che richiede più celle (come molti non sopravvivere al processo) e reagenti commerciali costosi. Per ragioni che non sono chiare per noi, non ogni membrana incorpora DID. Inoltre, solo una frazione delle cellule sul piatto vengono transfettate. Trovare cellule che sono transfettate E sono macchiati bene con Lo può richiedere molto tempo, che è il motivo per ottimizzare le condizioni per la colorazione ed elettroporazione è valsa la pena. In sintesi, unArticolo descrive come pTIRFM viene implementato per monitorare le deformazioni della membrana rapidi e localizzati che si verificano durante la fusione delle vescicole nucleo denso di cellule cromaffini bovine. Anche se una sola applicazione è discusso, la tecnica è ideale per lo studio di altri processi biologici che coinvolgono cambiamenti nella forma di membrana, tra cui l&#39;endocitosi, citochinesi, e la motilità cellulare.

La corretta esecuzione della esocitosi richiede cambiamenti estremi di forma doppio strato di membrana deve essere orchestrato con precisione. Prima della fusione, curvatura locale della membrana plasmatica sotto il granulo si verifica, in parte per ridurre la barriera di energia per l&#39;interazione di bistrati. Più tardi, come le membrane si fondono, zone di alta curvatura vengono generate e devono essere stabilizzati. Infine, le membrane fusi devono essere piegati dalla loro forma iniziale per espandere il poro di fusione e permettere il rilascio dei contenuti 1. Poiché le membrane da soli è improbabile di sottoporsi a tali cambiamenti drammatici e coordinate, le proteine ​​sono necessarie per mediare eventi. Ma come si comportano influenzare cambiamenti di topologia di membrana durante il processo di fusione rimane molto una questione aperta. Eccellente in modelli in vitro esistono per visualizzarne la membrana curvatura. L&#39;uso di colorazione negativa EM, per esempio, è stato importante per plasmare modelli molecolari correnti per le azioni di due grandi traffici proteins - synaptotagmin e dynamin (per le recensioni, vedere Chapman 2 e 3 Henshaw). La maggior parte delle analisi in tempo reale di esocitosi non rilevano direttamente curvatura. Invece, la curvatura è dedotto da saggi che riportano sulla cinetica di rilascio lumenal carico 4-8 o cambiamenti nella zona della membrana 9-11. PTIRFM colma il divario tra in vivo e in vitro, consentendo diretti, misure in tempo reale dei cambiamenti nella membrana micromorfologia. PTIRFM, in un modo nonimaging, è stato lanciato da Axelrod e colleghi per misurare l&#39;orientamento della NPD-PE incorporato all&#39;interno di un modello di membrana 12. La tecnica è stata poi applicata per visualizzare i cambiamenti dinamici nelle cellule viventi etichettati con DII e FM1-43, 13-18. In pTIRFM, due polarizzazioni campo evanescente sono utilizzate per eccitare sequenzialmente una sonda membrana incorporato: p-polarizzazione (nel piano di incidenza) e s-polarizzazione (perpendicolare al piano di incidenza). Prima di imaging, la sonda - in questo caso, DID - viene brevemente aggiunto al mezzo extracellulare ed è permesso di intercalare nelle membrane plasmatiche delle cellule da studiare. Nelle regioni in cui la membrana è non paralleli al coprioggetti (come in un volant membrana o rientro), il DID sarà anche non paralleli. Pertanto, tali regioni saranno eccitabile dal fascio p-pol. Il fascio p-pol sarà meno efficacemente eccitare ha fatto nelle regioni di membrana che sono per lo più paralleli al coprioggetti. Immagini rapporto pixel-to-pixel (P / S) relazioni sulle emissioni da sequenziale p-e s-pol eccitazione Lo sarà quindi in particolare evidenza le regioni di membrana deformazione. In teoria, le immagini rapporto P / S sono sensibili anche a piccoli angoli di deviazione dalla membrana plasmatica coprioggetti, con l&#39;ampiezza dei cambiamenti previsti da simulazioni al computer 18. Immagini P / S sono indipendenti le fluoroforo distanza dalla superficie coprioggetti e fluoroforo localeconcentrazione. Concentrazione del fluoroforo locale è invece fornito da segnalare immagini sulla somma pixel-per-pixel dell&#39;emissione P e 2 volte l&#39;emissione S (P +2 S). Il P +2 misure S è sensibile alla geometria precisa del rientro, con qualche, poco o nessun cambiamento possibile. Questo può essere dimostrato da simulazioni al computer che modellano le transizioni di un poro di fusione da un precoce (cioè con un collo stretto) ad uno stato più tardi 16,18. Il P +2 S di una vescicola fuso attaccato alla membrana plasmatica tramite un collo stretto (e con più DID vicino all&#39;interfaccia) è previsto per essere maggiore, ad esempio, a quella di una vescicola fuso con un poro molto più ampia (dove l&#39; Lo è all&#39;interno della parte più debole del campo evanescente). In questo articolo, vedremo come pTIRFM viene implementato e utilizzato per studiare i cambiamenti rapidi e localizzati in forma di membrana che si verificano durante la fusione dei pori dilatazione. Mentre una sola applicazione è esplicitamente discussed, i metodi sono generalizzabili a una varietà di altri processi biologici cellulari che coinvolgono direttamente o indirettamente membrana rimodellamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:277px;">iXon3 EMMCD Camera</td>
			<td style="width:179px;">Andor</td>
			<td style="width:147px;">897</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Side-mounted Filtercube Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">43 Series Ar-Ion Laser</td>
			<td>CVI Milles Griot Laser Optics</td>
			<td>543-AP-A01</td>
			<td>Tunable to 488nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sapphire 561 LP Diode Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>561nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scanning Galvo Mirror System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">VC3 Channel Focal Perfusion System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA VC3X4PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">QMM Quartz MicroManifold</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA QMM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10 PSI Pressure Regulator</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PR10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Manipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>TS 5000-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Six Station Neutral Density Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Stepper-motor Driven SmartShutter</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>IQ25-1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HQ412lp Dichroic Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC255583</td>
			<td>Joins 488nm and 561nm beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 100mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 488nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 250mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 561nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 125mm VIS 0</td>
			<td>Focuses both beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 50mm VIS 0</td>
			<td>Cemented to filter cube assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561rpc Dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561rpc</td>
			<td>Filtercube dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561_TIRF Emission Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561m_TIRF</td>
			<td>Filtercube emission</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UIS2 60x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td>NA 1.37</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MetaMorph Imaging Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiI Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>For Alignment Purposes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TH Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401135001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TL Liberse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DNAse I Type IV from bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiD Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">.22 &#956;m Membrane Syringe Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507</td>
			<td>0.5 microns</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Immersion Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Controlls galvo mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1965-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging plasma membrane deformations with ptirfm

Per ottenere nuove intuizioni le dinamiche di esocitosi, il nostro gruppo si concentra sui cambiamenti di forma doppio strato lipidico che devono essere regolati proprio durante la fusione delle membrane delle vescicole e di plasma. Questi cambiamenti rapidi e localizzati sono raggiunti da interazioni dinamiche tra lipidi e proteine ​​specializzate che controllano membrana curvatura. L&#39;assenza di tali interazioni non solo avrebbe conseguenze devastanti per la fusione delle vescicole, ma una miriade di altre funzioni cellulari che coinvolgono control forma di membrana. Negli ultimi anni, l&#39;identità di un numero di proteine ​​con proprietà membrane-shaping è stata determinata. Ciò che rimane manca è una tabella di marcia di quando, dove e come agiscono, come la fusione e il progresso di rilascio dei contenuti. La nostra comprensione degli eventi molecolari che consentono il rimodellamento della membrana è stato storicamente limitato dalla mancanza di metodi analitici che sono sensibili a membrana curvatura o hanno la risoluzione temporale di track rapidi cambiamenti. PTIRFM soddisfa entrambi i criteri. Discutiamo come pTIRFM viene implementato per visualizzare e interpretare i cambiamenti rapidi e inferiori al micron nell&#39;orientamento delle membrane delle cellule cromaffini durante nucleo denso di vescicole (DCV) fusion. Le cellule cromaffini che usiamo sono isolati dalle ghiandole surrenali bovini. La membrana viene trattato con un colorante carbocyanine lipofila, 1,1 &#39;-dioctadecil-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate, o fatto. DiD intercala nel piano membrana con un orientamento &quot;fisso&quot; ed è quindi sensibile alla polarizzazione del campo evanescente. La membrana cellulare DID macchiato è sequenziale eccitato con polarizzazioni ortogonali di un laser a 561 nm (p-pol, s-pol). Un laser 488 nm è usato per visualizzare costituenti vescicole e tempo il momento della fusione. Esocitosi è innescato da localmente perfusione delle cellule con una soluzione di KCl depolarizzante. L&#39;analisi viene eseguita offline utilizzando software personalizzato scritto per capire come ha fattoemissione cambiamenti di intensità riguardano la fusione dei pori dilatazione.

Tecniche di imaging TIRFM convenzionali e polarizzati sono implementati sullo stesso tavolo aria. La configurazione degli elementi ottici è simile, con la differenza che la luce di eccitazione è polarizzato (Figura 1A). La luce polarizzata eccita preferenzialmente fluorofori con dipoli di assorbimento in direzione di polarizzazione. Così, per pTIRFM sia efficace a monitorare membrana cambiamenti topologici, la sonda utilizzata deve intercalare nella membrana con un orientamento fisso. I coloranti fluorescenti carbocyanine (DII, DID) intercalare in doppi strati lipidici in modo orientato con dipoli di transizione nel piano della membrana (Figura 1B). P-polarizzato illuminazione (Figura 1C) di membrane DID-etichettati eccita selettivamente coprioggetto-obliquo fluorofori (RED nelle figure 1B e 1D). Etichettatura membrana esuberante di cellule cromaffini si raggiunge dopo abincubazione rief con DID. Figura 2A mostra un esempio di una membrana cellulare che è macchiata bene. A, di cellule aderenti sano esporrà differenze tra le P e S emissioni. L&#39;immagine emissione P presenta un bordo cella luminoso rispetto al resto della cellula. L&#39;immagine emissione di S mostra fluorescenza all&#39;incirca uniforme su tutta l&#39;impronta delle cellule. +2 Immagini elaborate P pixel-per-pixel / S e P s sono sensibili a membrana curvatura e concentrazione di colorante, rispettivamente. La cella cromaffini visualizzato è stato anche trasfettate con sinaptotagmina-1 pHluorin (Syt-1) per etichettare vescicole secretorie (Figura 2B). La cella cromaffini viene stimolato con 56 mM KCl per depolarizzare la membrana cellulare e innescare esocitosi. Una serie di vivaci macchie fluorescenti Syt-1 pHluorin improvvisamente diventato evidente come fusibile DCVs (Figura 2B, pannello di destra). Una casella bianca è disegnato intorno a un evento di fusione (Figura 2B, pannello di destra). Questo evento i fusions analizzato nelle figure 2C e 2D. figura 2C mostra i cambiamenti fotogramma per fotogramma in Syt-1-pHluorin, P / S e P 2 intensità di immagine S. Intensità di fluorescenza di Syt-1 diminuisce rapidamente la proteina diffonde lontano dalla sede di fusione (Figura 2D). Il rientro rappresenta il complesso membrana della vescicola / plasma fuso diminuisce a un ritmo relativamente lento (Nota grafici nella Figura 2D). L&#39;illustrazione (Figura 2E) raffigura una interpretazione di queste misure. Le deformazioni della membrana rapide e localizzate mostrati nella Figura 2 sono il risultato di stimolo evocato Ca 2 + afflusso. Ciò è mostrato nella Figura 3A. Una cella cromaffini è trasfettate con la genetica Ca 2 + indicatore GCaMP5G 21,22 e stimolate con 56 mM KCl. Depolarizzazione della membrana provoca un aumento significativo GCaMP5G fluorescenza ( <stro<html> ng&gt; Figure 3A e 3B) significa un aumento subplasmalemmal Ca 2 + livelli. Una regione 30 x 20 pixel della cella viene selezionata e cambia fotogramma per fotogramma in GCaMP5G, P / S e P 2 S intensità dei pixel sono presenti nelle immagini (Figura 3B) e grafici (Figura 3C). Time &quot;0&quot; indica telaio prima un modificare un P / S evidente (ossia telaio prima esocitosi). Le frecce bianche indicano che la deformazione della membrana (aumento di P / S) è accompagnato da una diminuzione della P +2 emissione S. La proteina citoplasmatica GCaMP5G è esclusa dalla zona del DCV fuso. Si noti anche l&#39;improvviso calo di intensità GCaMP5G al tempo 0 in figura 3C, pannello di sinistra. La lunga durata aumento di P / S e la diminuzione in P 2 S suggeriscono un poro di fusione che dilata lentamente (Figura 3D). / Files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Illustrazioni per la tecnica pTIRFM. A) è mostrato uno schema per combinare convenzionale con base polarizzazione-imaging TIRF. Una piastra a quarto d&#39;onda (QW) è posto di fronte a un laser zaffiro 561-nm per polarizzare ellitticamente il fascio laser. Un cubo di polarizzazione (PC1) viene utilizzato per separare le polarizzazioni in (v) e orizzontale (h) componenti verticali lineari. I componenti verticali e orizzontali diventano il p-pol e travi eccitazione s-pol, rispettivamente, alla superficie TIR. I percorsi p-pol e s-Pol sono chiuse in modo indipendente (S1 e S2). Essi sono ricombinati con specchi e un secondo cubo polarizzatore (PC2). Si uniscono il fascio di 488 nm (anche indipendentemente persiane, S3) tramite un elemento a trave direttivo composto da uno specchio e nonpolarizing specchio dicroico (DC). Lenti (L) sono utilizzati per espandere e mettere a fuoco le travi. Combinata 488 nm e 561 nm travi sono guidate da una porta illuminazione laterale del microscopio via galvanospecchi metro (GM). Essi si concentrano al piano focale posteriore (BFP) dell&#39;obiettivo. Etichettatura fotoni emessi da fluorofori vengono catturati su una fotocamera EMCCD collegato ad un PC. B) DID viene eseguita incubando brevemente cellule con il colorante e lavare ripetutamente per rimuovere l&#39;eccesso. DiD intercala nella membrana con i suoi momenti di dipolo di transizione all&#39;incirca nel piano di membrana. C) La luce incidente polarizzata nel piano di incidenza (p-pol) crea un campo evanescente che è prevalentemente polarizzata normale all&#39;interfaccia, come mostrato. D) L&#39;illuminazione di una membrana DID marcato con la luce p-polarizzata selettivamente eccitare i fluorofori che sono coprioggetti-obliqua (RED). Se questo fosse un campo evanescente s-polarizzata, tali fluorofori che sono parallele alla coprioggetti sarebbero eccitati invece (NERO). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig2.jpg" /> Figura 2. </s<html> trong&gt; cellulari Monitoring deformazioni della membrana con pTIRFM. A) sono mostrati Raw P e S immagini emissioni insieme calcolato P / S e P 2 immagini emissioni S. Barra della scala, 3.2 micron. B) Una cellula cromaffine esprime Syt-1 pHluorin è depolarizzata con KCl. Un certo numero di macchie fluorescenti vivaci (pannello di destra) indica la fusione di singoli DCVs. Barra della scala, 3.2 micron. C) frame-by-frame immagini di una fusione Syt-1 pHluorin DCV. Tempi (sopra le immagini) sono in secondi. Tempo 0 indica fotogramma prima fusione del DCV. Sono indicate anche due immagini di emissione S corrispondente P / S e P. . Bar scala è 1 micron D) Grafici per le immagini in linea C. tratteggiata è al tempo 0 - mostra il fotogramma di fusione E) Una possibile interpretazione dei risultati in C e D..<html> blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig3.jpg" /> Figura 3. Deformazioni sono il risultato di stimolo evocato Ca 2 + afflusso. A) Una cellula cromaffini trasfettate con GCaMP5G è depolarizzata con 56 mM KCl. Il conseguente aumento GCaMP5G fluorescenza indica un aumento subplasmalemmal Ca 2 + livelli. B) le immagini fotogramma per fotogramma di 30 x 20 pixel nell&#39;area di cellula in A. I tempi di cui sopra sono immagini in pochi secondi. Frecce bianche indicano una regione di incremento P / S e P +2 diminuzione S. Proteina citoplasmatica GCaMP5G è escluso dalla regione dal DCV fusione. Barra della scala, 1 micron. C) grafici per le immagini mostrate in B. D) viene mostrata Una possibile interpretazione dei risultati in B e C.3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Camera iXon3 EMMCD </td><td> Andor </td><td> 897 </td><td></td></tr><tr><td> IX81 invertito Microscopio </td><td> Olimpo </td><td></td><td> Laterale Filtercube Assemblea </td></tr><tr><td> Laser 43 Serie Ar-Ion </td><td> CVI Milles Griot ottica laser </td><td> 543-AP-A01 </td><td> Sintonizzabile a 488 nm </td></tr><tr><td> Sapphire 561 LP diodo laser </td><td> Coerente </td><td></td><td> 561 nm </td></tr><tr><td> Scansione Galvo sistema di Mirror </td><td> Thorlabs </td><td> GVS102 </td><td></td></tr><tr><td> VC 3 Channel Focal sistema di perfusione </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA VC3X4PP </td><td></td></tr><tr><td> QMM quarzo MicroManifold </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA QMM-4 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> 10 psi Regolatore di pressione </td><td> ALA Scientific Instruments </td><td> ALA PR10 </td><td></td></tr><tr><td> Manipolatore </td><td> Burleigh </td><td> TS 5000-150 </td><td></td></tr><tr><td> Montato acromatico Quarter-Wave Piatto </td><td> Thorlabs </td><td> AQWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> 420-680 nm polarizzante beamsplitter Cube </td><td> Thorlabs </td><td> PBS201 </td><td></td></tr><tr><td> Sei Stazione Wheel Neutral Density </td><td> Thorlabs </td><td> FW1AND </td><td></td></tr><tr><td> Motore passo-passo Driven SmartShutter </td><td> Strumenti Sutter </td><td> IQ25-1219 </td><td></td></tr><tr><td> HQ412lp Dichroic Filter </td><td> Chroma </td><td> NC255583 </td><td> Unisce 488 nm e 561 nm travi </td></tr><tr><td> Coated Plano-Concave Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCV 100 millimetri VIS 0 </td><td> Diverge 488 fascio nm </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Coated Plano-Concave Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCV 250 millimetri VIS 0 </td><td> Diverge 561 fascio nm </td></tr><tr><td> Coated Plano-Convex Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCX 125 millimetri VIS 0 </td><td> Si concentra entrambi i fasci </td></tr><tr><td> Coated Plano-Convex Lens </td><td> Edmund Optics </td><td> PCX 50 millimetri VIS 0 </td><td> Cementato per filtrare l&#39;assemblaggio del cubo </td></tr><tr><td> z488/561rpc Dichroic </td><td> Chroma </td><td> z488/561rpc </td><td> Filtercube dicroici </td></tr><tr><td> z488/561_TIRF Emission Filter </td><td> Chroma </td><td> z488/561m_TIRF </td><td> Emissione Filtercube </td></tr><tr><td> UIS2 60X Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XO </td><td> NA 1.37 </td></tr><tr><td> Neon Transfezione sistema </td><td> Invitrogen </td><td> MPK 5000 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph software di imaging </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> DII membrana Dye </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Ai fini dell&#39;allineamento </td></tr><tr><td> TH Liberase </td><td> Roche </td><td> 5401135001 </td><td></td></tr><tr><td> TL Liberse </td><td> Roche </td><td> 5401020001 </td><td></td></tr><tr><td> DNAse I Tipo IV da bovini </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Pescatore </td><td> 0267110 </td><td></td></tr><tr><td> DiD membrana Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D-7757 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine </td><td> Invitrogen </td><td> R634 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 micron Unità filtro a membrana siringa </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite policromatici Red Microspheres </td><td> Polysciences </td><td> 19507 </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Immersione in olio </td&gt; <td> Sigma </td><td> 56.822 </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td></td><td> Controlli Galvo specchi </td></tr><tr><td> Spinner Flask </td><td> Bellco </td><td> 1965-00250 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. attrezzature pTIRF Microscopia. <table><tbody><tr><td> Contenuto </td><td> Prep-PSS </td><td> Basale-PSS </td><td> Stim-PSS </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 145 mm </td><td> 145 mm </td><td> 95 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.6 mM </td><td> 5.6 mM </td><td> 56 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> - </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,5 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> - </td><td> 2,2 mm </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 15 MM </td><td> 15 MM </td><td> 15 MM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 2,8 mm </td><td> 5.6 mM </td><td> 5.6 mM </td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> 1x </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Perfusione e soluzioni di preparazione delle cellule cromaffini. <table><tbody><tr><td> Contenuto </td><td> Electroporating media </td><td> Normale placcatura media </td><td> 2x Antibiotico media </td></tr><tr><td> 1x DMEM/F-12 </td><td> 1 ml / piastra </td><td> 2 ml / piastra </td><td> 1 ml / piastra </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> 10% </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Citosina arabinofuranoside (CAF) </td><td> - </td><td> 1 ml / ml di 10 mM Archivio </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicillina </td><td> - </td><td> 100 unità / ml </td&gt; <td> 200 unità / ml </td></tr><tr><td> Streptomicina </td><td> - </td><td> 100 pg / ml </td><td> 200 mg / ml </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> - </td><td> 25 mcg / ml </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Media Cella cromaffini. <table><tbody><tr><td> Contenuto </td><td> TH-PSS </td><td> TL-PSS </td></tr><tr><td> Liberase TH </td><td> 2 ml </td><td> - </td></tr><tr><td> Liberase TL </td><td> - </td><td> 0.85 ml </td></tr><tr><td> Prep-PSS </td><td> 98,0 ml </td><td> 84,0 ml </td></tr><tr><td> DNasi </td><td> 8.75 mg </td><td> 7.4 mg </td></tr></tbody></table> Tabella 4. TH-PSS e TL-PSS Solutions.

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Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Basato polarizzazione-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) permette un rilevamento in tempo reale della dinamica della membrana cellulare. Questo articolo descrive l&#39;implementazione di pTIRFM per lo studio della membrana rimodellamento durante l&#39;esocitosi regolata. La tecnica è generalizzabile ad altri processi in biologia cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente cambiamenti di forma della membrana.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.5K Views.  Wayne State University.  Basato polarizzazione-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) permette un rilevamento in tempo reale della dinamica della membrana cellulare. Questo articolo descrive l'implementazione di pTIRFM per lo studio della membrana rimodellamento durante l'esocitosi regolata. La tecnica è generalizzabile ad altri processi in biologia cellulare che coinvolgono direttamente o indirettamente cambiamenti di forma della membrana. 

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

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Biologia

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.