فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتنانهم للدعم المالي من مؤسسة باستور نيويورك (دينار، CS، CS)، والاتحاد الأوروبي FP7 برنامج &quot;أتمتة&quot; (لSLS)، وبرنامج معهد كارنو 11 (دينار، ه ، AR، RT، SLS) ومشروع IMNOS (لRT، SLS)، ومؤسسة كوني-مافي الخيرية (SLS)، والماجستير الأوروبي في التصوير الجزيئي (لتقنية المعلومات)، وبرامج منطقة إيل دو فرانس MODEXA (SLS)، السمسم (SLS) وDimMalInf (SLS، RT)، وكالة الاستخبارات الوطنية برنامج جراند INVESTISSEMENT DE L&#39;AVENIR البنى التحتية Nationales أون البيولوجيا-سانتي: فرنسا LifebioImaging (FLI) فرنسا الحياة التصوير (RT، SLS)، فرنسا Bioimaging (دينار، SLS) و معهد باستور في باريس. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر، خوسيه Bengoechea وهربرت شفايتزر للمواد. علاوة على ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر سيندي فيفر الذي ولدت الأجسام المضادة.

1. الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء أو تطوير البكتيريا الانارة وسائل الإعلام والثقافة المناسبة مثل تعديل القولونية التعبير عن ABCDE لوكس 21، الضمة fischeri، اللميعة س. الكلبسيلة الرئوية 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المالحة الفسيولوجية (0.9٪ كلوريد الصوديوم) والحلول سائل الإعلام والثقافة وفقا لصفات القياسية. E. القولونية وK. كانت تزرع في لوريا BERTANI الرئوية (LB) عند 37 درجة مئوية، وV. fischeri واللميعة س في LB تستكمل مع 0.5 M كلوريد الصوديوم في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء أو الاستحواذ على تحقيقات الفلورسنت مثل Q-705 تعقب (40 نانومتر قطر، ويشار إلى QD705)، Q-800 تعقب (40 نانومتر قطر، ويشار إلى QD800)، فلوري (40 نانومتر قطر) والمجهرية البوليسترين غير الفلورسنت ( 48 قطرها نانومتر)، والأصباغ الفلورية التقليدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكواشف اللازمة لوضع العلامات البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان الوصول إلىككل تصوير تلألؤ بيولوجي الحيوان، مثل الطيف IVIS، التي هي قادرة على الكشف عن إشارة تحت مجموعة واسعة من الأطوال الموجية الانبعاثات ومرات التعرض. وهناك قارئ لوحة قادرة على قياسات تلألؤ بيولوجي تكفي لمعظم التجارب الموصوفة هنا. </li></ol> 2. خلاصة أساسية FUEL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من المستعمرات الفردية على لوحات ثقافة القياسية، بدء الثقافات بين عشية وضحاها من البكتيريا الانارة. هنا، V. واستخدمت fischeri. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم من التجريب، والشروع في ثقافات فرعية جديدة، والسماح لهم للتقدم حتى يتحقق على OD 600 من 1-1.5. من أجل تحقيق نتائج قابلة للمقارنة فمن الأفضل لاستخدام البكتيريا في نمو مماثل في الدول التي تنتج إشارات مكثفة. هذا لا يمكن ضمانه عن طريق الحفاظ على OD 600 ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين aliquots من 100 ميكرولتر من كل سواء مع 5 ميكرولتر من QD705 أو المالحة الفسيولوجية (PS)، ثم قم بإضافة إلى 895 ميكرولتر من PS إلى standacuvettes الثالثة الطيفية. ضع cuvettes شغل في الطيف IVIS وتأخذ القياسات تحت مجموعات التصفية المناسبة. هنا، تم استخدام تصفية الانبعاثات 710-730 نانومتر. </li></ol> 3. FUEL أكثر متفاوتة المسافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء اثنين من انخفاض حجم (1 مل) cuvettes الضوئية البلاستيكية التي تحتوي على إما 50 ميكرولتر من QD705 أو 97.2 ميكرولتر من غير الفلورسنت 48 نانومتر المجهرية البوليسترين في إجمالي حجم 1 مل PS. وهذا يضمن مساحة مماثلة الصلبة في الحجم الكلي بين الكيانين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كفيت مصدر الضوء عن طريق التغليف كوفيت الثالث مع الشريط الأسود القياسي أو بعض المواد الأخرى مبهمة قادرة على حجب الضوء. إعداد بعناية نافذتين البصرية متطابقة على طرفي نقيض من كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع cuvettes شغل في السابق مباشرة على جانبي كفيت مصدر الضوء. إضافة قسامة 1 مل من V. ثقافة fischeri أو غيرها (أي كولاي أو الانارة اللميعة قع) من ثقافة فرعية جديدة في كفيت مصدر الضوء، وتغطية ذلك مع مادة مبهمة، مثل ورقة سوداء للحد من أي تلوث الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور cuvettes الثلاث في إطار المرشحات الانبعاثات المناسبة مثل ضوء إجمالي و710-730 المرشحات الانبعاثات نانومتر، مع أوقات التعرض لل10، 30، و 30 ثانية، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة كلا cuvettes الخارجية على مسافات أبعد ما يعادلها من كفيت المركزية، ومن ثم تصور مرة أخرى. كرر حتى يتم التوصل إلى مسافة النهائي وجها لوجه (المركزي إلى انخفاض حجم كفيت) من 3CM. في كل خطوة، والحصول على صورة مضان (450-480 نانومتر الإثارة، 710-730 الانبعاثات نانومتر) للتحقق من صحة موقع QD705. </li></ol> 4. التحقيق أزواج FUEL المحتملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء اثنين من خفض حجم cuvettes مع 1 مل تحتوي على حلول إما fluorophore أو جسيمات متناهية الصغر الفلورسنت من الفائدة في واحد، وPS أو PS مع الجسيمات النانوية غير الفلورسنت مثل سيطرة سلبية في الآخر. في الأظهرت أعمال الإلكترونية هنا، تم التحقيق في مجموعة متنوعة من إمكانات fluorophores FUEL المتاحة تجاريا والنانوية الفلورسنت على النحو المبين في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قسامة 1 مل من V. جديدة fischeri أو البكتيريا الانارة أخرى إلى كفيت ثالث ظلام دامس تحتوي على نافذتين الضوئية تساوي جسديا تقع على طرفي نقيض. تغطية كفيت مع مادة مبهمة مثل قطعة من الورق الأسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مكان بعد مسافة قصيرة ولكن على قدم المساواة انخفاض اثنين من حجم cuvettes على جانبي كفيت-ظلام دامس وتصور تحت الفلاتر المناسبة. هنا، تم استخدام مسافة 0.7 سم. أكرر مع fluorophores الأخرى. </li></ol> 5. FUEL المستهدفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة البيروكسيديز محددة للبكتيريا الانارة. على سبيل المثال، الأجسام المضادة الأولية هنا محددة لK. تم المعقدة البيروكسيديز الرئوية (α-كيمبرلي) باستخدام محلول يحتوي على EZ-رابط سلفو-NHS-LC-البيوتين. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كاشف الزائدة من الأجسام المضادة باستخدام الأعمدة تحلية تحت الطرد المركزي (1،500 x ج) لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برادفورد مقايسة القياسية لتحديد تركيز البروتين وتحديد درجة الضد biotinylation بواسطة HABA الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الضد البيروكسيديز α-KP-بيو (أب) دفعات عن طريق خلط 100 ميكرولتر (10 ملي، وحلت في برنامج تلفزيوني 1X) مع 40 ميكرولتر α-كيمبرلي الأجسام المضادة، مما أدى إلى درجة النهائي إحلال 16 بقايا البيوتين في أب والنهائي تركيز البروتين من 10 ملغ مل -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام متعددة الثقافات بين عشية وضحاها تكرار، تستهدف البكتيريا غسلها مع الأجسام المضادة المذكورة آنفا التالية البروتوكول المناسب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على وجه التحديد، وغسل K. الرئوية في برنامج تلفزيوني 1X، وresuspend في برنامج تلفزيوني 1X إلى OD من 4 (حوالي 4 × 10 8 كفو مل -1 OD -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تكرار، واحتضان 100 ميكرولتر PBS، α -الأجسام المضادة KP (10 ميكرولتر α-KP-biotB أو 10 ميكرولتر PBS للتحكم)، و 100 ميكرولتر الخلايا لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية. غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X، وresuspend في 196 ميكرولتر PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية الخلايا مع المكورات QD705 streptavidin وتقسيمها إلى مجلدين ما يعادلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل حل واحد ثلاث مرات وresuspend ثم فإنه في حجم مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع 100 ميكرولتر من الحلول غسلها وغير مغسولة في الآبار الفردية للأسود لوحة 96 جيدا. قياس التلألؤ الناتجة تحت الضوء إجمالي، 490-510 نانومتر، والمرشحات 710-730 نانومتر. يمكن تحديد تركيز Fluorophore باستخدام 450-480 نانومتر الإثارة وانبعاث 710-730 نانومتر. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

يعلن الكتاب المصالح المالية المتنافسة. ساهم دينار، SB، KLR وSLS لEP10290158.4 الأوروبي للبراءات والمنظمة العالمية للملكية الفكرية براءات الاختراع التطبيق WO/2011/117847.

لا يمكن أن يتحقق المظاهرة الأساسية للFUEL ببساطة عن طريق خلط البكتيريا مع الانارة الفلورسنت النانوية أو QDS. سيتم الكيانين المنفصلين جسديا وتظل أبعد من أي مسافة RET كفاءة. أكثر صعوبة هو الوقود إشارة الأمثل سواء في التجارب المختبرية والحية. تحت ظروف في المختبر، مع ودون امتصاص البصرية الحاضر على حد سواء، وعادة إضافة fluorophore الزائدة سوف تكون كافية لتحقيق أقصى قدر من الاستجابة FUEL. ومع ذلك، في تركيزات عالية ظواهر مثل تبريد ثابت أو الاصطدامية يمكن أن يؤدي إلى فقدان إشارة الفلورسنت. سوف إجراء سلسلة التخفيف بشكل مستقل من قبل متفاوتة تركيز مصدر الانارة وfluorophore تساعد على تحسين تركيز المطلوب. إنشاء والأمثل للوقود تحت تركيزات في الجسم الحي هو أكثر صعوبة وتحتاج إلى معالجة على أساس كل حالة على حدة. يمكن أن يكون من الصعب خلق التعاون<html> ndition حيث يمكن الوصول إلى كيان الفلورسنت بصريا من المصدر الانارة. على هذا النحو، بدءا شارك الحقن المباشر للالأنصاف اثنين يمكن أن توفر معلومات بشأن نجاح FUEL تحت الظروف المثلى. وجود بروتوكولات موحدة لوضع العلامات البكتيريا والخلايا حقيقية النواة مع الكيانات الفلورسنت مثل سلسلة اليكسا وQDS. وغالبا ما يتطلب هذا functionalization السطح أو التنشيط مع الأجسام المضادة، التي يمكن أن تؤدي إلى آثار غير مرغوب فيها مثل تخفيض بقاء الخلية أو تغيير النشاط الأيضي. للتغلب على هذا، فمن المهم لتحديد المبلغ الأمثل من الأجسام المضادة أو وكيل التنشيط اللازمة التي تقلل من الاضطرابات الخلوية مع تعظيم وضع العلامات الفلورية. استخدام QDS هو مفيد لما لها من أطياف واسعة مميز الإثارة والضيقة والانضباطي أطياف الانبعاثات، وإمكانية تحول كبير ستوكس. ومع ذلك، يمكن أن تكون سامة للخلايا وQDS قد لا يكون مرغوبا فيه في بعض الحالات. الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL هو ظاهرة موجودة في العديد من التجارب بريت 13 وينطبق على مجموعة متنوعة من الانارة ومصادر الفلورسنت. حتى الآن، كانت تعتبر الفوتونات الناتجة عن الوقود المنتج من التفاعلات غير محددة أو إشارة الخلفية المؤسفة الناتجة عن سوء تصميم التجارب بريت. مع أنها ليست سوى نوع من التجارب أظهرت هنا أن كنا قادرين على تحديد مدى فائدة هذه الإشارة غير المرغوب فيها. في الأمثلة المعروضة، والبكتيريا الانارة بمثابة مصدر الإثارة منتشر قادرة على انتزاع استجابة الفلورسنت القياسية من مجموعة واسعة من الكيانات الفلورسنت. علاوة على ذلك، نظرا لبعد المسافة عمل كبيرة، وأنها آمنة لإبرام أنه في حين أن وقود يمكن بناؤها دون وقوع بريت، بريت في العام لا يمكن ملاحظتها دون مساهمة من الوقود. الأهم من ذلك، نظرا لعدم وجود شرط الاستهداف، FUEL يمكن استخدامها لتغطية الفجوة المكانية القائمة بين بريت وجتقنيات التصوير كله والحيوان onventional.

التعديل الجيني للكائنات، مثل الفيروسات 1، 2، 3 البكتيريا، أو الثدييات الصغيرة 4 إلى إما لحث أو تلألؤ بيولوجي صريحة جوهري، كان ناجحا للغاية وأظهر على نطاق واسع 5-7. تلألؤ بيولوجي، رد فعل في الجسم الحي chemiluminescent تنطوي على الكواشف التي تحدث بشكل طبيعي، لديه ميزة إنتاج الضوء دون الحاجة إلى مصدر ضوء خارجي. على هذا النحو، لا تعاني التصوير إضاءة الحيوية من العيوب شيوعا من السيارات وغير محددة وجدت إشارة من مضان التصوير 8. بالتالي، تلألؤ بيولوجي لديها نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء لأن أي إشارة الكشف عن تنبع فقط من مصدر المقصود. بينما العديد من النماذج استغلت الاوبرون لوكس من luminescens Photorhabdus (الحد الأقصى الانبعاثات تركزت بين 480 و 490 نانومتر) لفي المختبر والمجراة في التطبيقات 9، واستخدامه في مام الصغيرةوكان المرض إشكالية نظرا لطبيعة الظروف التصوير؛ وجود السائد من امتصاص البصرية، مثل الهيموجلوبين، وكلاء نثر، مثل الأنسجة والعظام، وتؤثر بقوة الأزرق لموجات الأصفر 3. تعبير عن يراعة luciferase هندسيا (الحد الأقصى للانبعاثات في 617nm) تم تطويره مؤخرا وأدرجت، وتوفير الأداة التي يتغلب بشكل كبير امتصاص البصرية 10، ولكن لا تزال تخضع لنثر الآثار. ردا على ذلك، كانت هناك محاولات متعددة لتحويل الحمراء المنبعثة إشارة إلى إطار بصري المطلوب من 650-900 نانومتر، وهي منطقة من امتصاص التقليل والتشرذم، وذلك باستخدام الرنين تلألؤ بيولوجي نقل الطاقة (بريت) 11-13. كأداة لتعزيز الكشف عن إشارة، بريت، والذي يستخدم مصدرا للإضاءة الحيوية مثل المانحة وأضاف fluorophore كما متقبل، وقد وجدت نجاحا محدودا. كمثال المنوية من هذه الظاهرة &quot;، أو النقاط الكم إلقاء الضوء على النفس4؛ (SIQDs) 14 تتكون من تعديل Renilla كلوية الشكل luciferases منضمة إلى طبقة البوليمر يسين الخارجية نقاط الكم المتاحة تجاريا (QDS). بالإضافة إلى ذلك على الركيزة، فإن رد الفعل للإضاءة الحيوية الناتجة يدفع الانبعاثات مضان من QDS، وتوليد إنتاج كبير من الفوتونات الحمراء. ومع ذلك، فإن هذه SIQDs تقتصر على تطبيق التصور في الجسم الحي من الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومن المرجح نظرا لصعوبة ربط التحقيق المزدوج إلى الجهاز، الخلية أو الجينات في المصالح، لأن SIQDs لا يمكن ترميز وراثيا وبالتالي يتطلب تعديل الثانوية للقذيفة البوليمر هذا محدودة التطبيق. لتحسين قابليتها للتطبيق، SIQDs البديلة، حيث لا بد من luciferases مباشرة إلى جوهر الانارة، وقد تم مؤخرا توظيف 15. بناء الخروج من مفهوم SIQD، تم التوصل إلى نظام بريت أكثر قابلية للتطبيق عن طريق ربط Cypridina luciferase المراسل إلى فيdocyanine صبغ 16، والتي كانت قادرة على استهداف تحديدا الاورام في الفئران بينما تنتج تحولا حمراء كبيرة من 460 نانومتر إلى 675 نانومتر. للخضوع لنقل الطاقة غير الإشعاعية، بريت يتبع نفس القيود الأولية مثل نظيرتها الفلورسنت: يجب أن يكون هناك تداخل الطيفية القوية بين الانبعاثات المانحة ومتقبل أطياف الإثارة والمسافة العمل بين الأنصاف اثنين يجب أن يكون بناء على أمر من فورستر دائرة نصف قطرها (5-14 نانومتر اعتمادا على الزوج المانحين متقبل، مع أقصى مسافة الفعال لضعف نصف قطر فورستر 17). هذا الاعتماد مسافة يحد كثيرا من أنواع الأحداث التي يمكن ملاحظتها باستخدام بريت كوسيلة لتعزيز الكشف. مؤخرا تم تحديد نهج جديد وتظاهر تحت حد سواء في المختبر وفي ظروف الجسم الحي. بناء قبالة أساس بريت، الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) 18، 19 </suع&gt; أيضا يتطلب التداخل الطيفي قوية بين الانارة ومكونات الفلورسنت. ولكن، خلافا بريت، FUEL هو عملية الإشعاعي تماما حيث يتم امتصاص الفوتون المنبعث من مصدر الانارة من قبل fluorophore الوصول بصريا، والتي تنبعث بعد ذلك الفوتون الأحمر تحول وفقا لالكم العائد fluorophore. أقرب إلى بريت، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج من أجل التغلب على معوقات التصوير في وجود امتصاص البصرية. يوفر التحول الأحمر مما أدى إلى زيادة شاملة وخصوصية في إشارة الكشف يرجع ذلك إلى تراجع في تخفيف والحد من آثار تشتت بصري. وقد تم الإبلاغ عن وقود لتحدث بين القولونية إضاءة الحيوية معربا عن الاوبرون لوكس وQDS 18، 19. بينما مماثلة تجريبيا لSIQDs، والفرق الأساسي موجود: في FUEL، فإنه ليس من الضروري لمصدر الانارة ليكون جسديا منضمة إلى fluorophore، والذي يسمح للص الترميز الوراثي لجنة التحقيق الانارة. ويرجع ذلك إلى الكشف الناجح لFUEL بين البكتيريا الانارة وQDS، فمن الممكن أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على كلا سطحي (الجلد) والأنسجة العميقة (الرئة، الكبد) مثل التهابات المكورات العنقودية الذهبية وKlebsiellia الرئوية. منذ تقرير أهميتها التجريبية، تطورت لتشمل FUEL نموذج رياضي قوي 20 التي يمكن استخدامها للتنبؤ الانارة مقبولة وأزواج الفلورسنت، وتوسعت لتشمل تطبيقاتها استخدامها في تحديد خصائص photophysical مثل العائد الكم. وصفنا أدناه بعض التقنيات الأساسية من الوقود. الأولى، وتبين لنا الدليل على هذه الظاهرة على حد سواء قصيرة (ميكرون) والطويلة (سم) المسافات العمل، والذي يميز جوهريا FUEL من بريت. الثانية، ونوسع على أزواج FUEL ممكن من خلال دراسة مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. حجابهند، ويتم التحقيق تطبيقات FUEL بمقارنة أزواج FUEL المستهدفة وغير المستهدفة.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; expressing the &lt;em&gt;lux&lt;/em&gt;ABCDE operon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>kindly provided by Jos&amp;eacute; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Klebsiella pneumoniae&lt;/em&gt; 52145&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 is a serotype K2 reference strain</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>standard growth media</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&amp;nbsp;</td><td>Life Sciences</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>Life Sciences</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>Life Sciences</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>Life Sciences</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>Life Sciences</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>Life Sciences</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>Non-fluorescent microspheres</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Pink microspheres</td><td>Life Sciences</td><td>F8887</td><td>40 nm diameter</td></tr><tr><td>Yellow microspheres</td><td>Life Sciences</td><td>F8888</td><td>40 nm diameter</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

مضان من قبل غير منضم الإثارة من التلألؤ (FUEL) هو عملية الإثارة الانبعاثات الإشعاعية التي تنتج زيادة إشارة وتعزيز التباين في التجارب المختبرية والحية. أسهم FUEL الكثير من نفس المبادئ الأساسية كما نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت)، ولكن يختلف كثيرا في العمل لمسافات مقبولة بين مصدر الانارة والكيان الفلورسنت. بينما بريت تقتصر على نحو فعال إلى حد أقصى قدره 2 مرات في دائرة نصف قطرها فورستر، عادة أقل من 14 نانومتر، ويمكن أن يحدث FUEL على مسافات تصل الى ميكرون أو حتى سم في حالة عدم وجود امتصاص البصرية. نحن هنا على اساس توسيع وتطبيق FUEL من خلال استعراض المبادئ ذات الصلة وراء هذه الظاهرة وإظهار توافقه مع مجموعة واسعة من fluorophores والنانوية الفلورسنت. أبعد من ذلك، هو استكشاف جدوى استهداف الأجسام المضادة FUEL. الأمثلة المعروضة هنا تقدم دليلا على أن وقود يمكن استخدامها لتطبيق ورقةications حيث بريت غير ممكن، وملء الفراغ المكاني القائم بين بريت والتصوير الحيوان كله التقليدية.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

توسيع المؤسسة وتطبيق الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) من خلال المسح إلى المبادئ ذات الصلة ومما يدل على توافقه مع العديد من fluorophores وظروف استهداف الأجسام المضادة.

خطوة أبعد بريت: الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K Views.  Institut Pasteur.  توسيع المؤسسة وتطبيق الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL) من خلال المسح إلى المبادئ ذات الصلة ومما يدل على توافقه مع العديد من fluorophores وظروف استهداف الأجسام المضادة. 

Video: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Synthesis of Luminol

Chemical reactions can be classified as endothermic or exothermic depending on whether the reactions absorb or release heat when they change to products. The difference in energy between reactants and products is known as the enthalpy of the reaction. This is found by calculating the difference in energies between the products and the reactants, or &#916;H. If &#916;H is positive, the reaction is endothermic; if it is negative, the reaction is exothermic. While chemical reactions are traditionally thought of as a conversion of reactants into products, many reactions take place in multiple steps, forming intermediates. In chemiluminescent reactions, these intermediates transition from a high energy state to the ground state, releasing a photon of light that may be visible as the reaction progresses.
<h4>Atomic Energy Levels</h4>
Niels Bohr, a Danish physicist, proposed the theory that an electron orbiting the nucleus of the atom can occupy only certain orbits or energy levels. An atom with all of its electrons in the lowest possible energy level is said to be at its ground state. When an electron occupies an energy level higher than the ground state, the atom is in its excited state.
A key assumption in Bohr&#8217;s theory is that an electron remains in the ground state until it is disturbed. Thus, an electron is only elevated to an excited state by absorbing energy. When the electron relaxes back down to the ground state, it releases that energy. Often, this is in the form of a photon of light, whose wavelength is directly related to the energy difference between the excited and ground states.
When an electron is excited to a higher energy level by absorbing light of a certain energy or wavelength, the phenomenon is called fluorescence. This effect can be seen if you expose a laundered white T-shirt to a black light or UV-light. The characteristic glow is caused by the fluorescence of the detergent and bleaching compounds in the shirt, which make it look white under regular light.
<h4>Chemiluminescence</h4>
In a chemiluminescent reaction, an electron is excited by absorbing heat that is released during a reaction. Then, light is released when the electron relaxes back down to the ground state. The major difference between chemiluminescence and fluorescence is that the energy that excites the electrons in chemiluminescence comes directly from the reaction.
One practical application of chemiluminescence is in commercial glow sticks. A glow stick contains two separate solutions: one containing peroxide and the other containing diphenyl oxalate and a color dye. When the two solutions are mixed, which occurs upon activating the glow stick, the resulting reaction between the peroxide and diphenyl oxalate produces energy that excites the dye to a higher energy state. As the reactants are exhausted, the dye returns to the ground state and releases light. This is what gives glow sticks their characteristic color.
<h4>Luminol</h4>
Luminol is a chemical that exhibits chemiluminescent properties and is utilized in a wide range of applications, most notably in forensics. Luminol (C8H7N3O2) emits blue when it is mixed with an oxidizing agent. In the case of forensics, luminol reacts with the iron in hemoglobin, enabling forensic scientists to identify very small traces of blood.
Luminol is synthesized by the dehydration reaction of 3-nitrophthalic acid with hydrazine. The reaction is heated to remove water, and triethylene glycol is added to further increase the temperature. The nitro group of the 3-nitrophthalhydrazide is then reduced using sodium dithionite to form an amino group at high pH. In basic conditions, the 3-nitrophthalhydrazide is soluble. The addition of glacial acetic acid precipitates the luminol.
With potassium hydroxide, luminol forms a dianion. The hydroxide anions deprotonate the two hydrogens that are attached to the nitrogens in the luminol. Oxygen gas oxidizes luminol to its excited state. As it relaxes back to the ground state, it releases a blue-white light.
<h4>References</h4>
<ol>
	<li style="font-size:17px">Kotz, J.C., Treichel Jr, P.M., Townsend, J.R. (2015). Chemistry and Chemical Reactivity. Belmont, CA: Brooks/Cole, Cengage Learning.</li>
</ol>

Synthesis of Luminol and Chemiluminescence - Concept

تخليق لومينول

Chemical reactions can be classified as endothermic or exothermic depending on whether the reactions absorb or release heat when they change to products. ...

Education

JoVE Lab Manual

Chemistry

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely manipulate neural firing, hormonal secretion and genetically-reprogrammed cells. However, the translation of this technology for medical applications is currently hampered by a lack of biophysical mechanisms by which targeted tissues sense and respond to LIPUS. A suitable approach to identify these mechanisms would be to use optical biosensors in combination with LIPUS to determine underlying signaling pathways. However, implementing LIPUS to a fluorescence microscope may introduce undesired mechanical artefacts due to the presence of physical interfaces that reflect, absorb and refract acoustic waves. This article presents a step-by-step procedure to incorporate LIPUS to commercially-available upright epi-fluorescence microscopes while minimizing the influence of physical interfaces along the acoustic path. A simple procedure is described to operate a single-element ultrasound transducer and to bring the focal zone of the transducer into the objective focal point. The use of LIPUS is illustrated with an example of LIPUS-induced calcium transients in cultured human glioblastoma cells measured using calcium imaging.

Low-Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation (LIPUS) is a modality for non-invasive mechanical stimulation of endogenous or engineered cells with high spatial and temporal resolution. This article describes how to implement LIPUS to an epi-fluorescence microscope and how to minimize acoustic impedance mismatch along the ultrasound path to prevent unwanted mechanical artefacts.

الإرسال المتعدد وركزت التحفيز بالموجات فوق الصوتية مع الفحص المجهري الأسفار

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

Engineering

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate light-gated ion channels and pumps in neurons. While this bioluminescent optogenetics (BL-OG) approach confers a chemogenetic component to optogenetic tools, it is not limited to use in neuroscience. Rather, bioluminescence can be harnessed to activate any photosensory protein, thus enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells. A variety of luciferase-luciferin pairs can be matched with photosensory proteins requiring different wavelengths of light and light intensities.
Depending on the specific application, efficient light delivery can be achieved by using luciferase-photoreceptor fusion proteins or by simple co-transfection. Photosensory proteins based on light-dependent dimerization or conformational changes can be driven by bioluminescence to effect cellular processes from protein localization, regulation of intracellular signaling pathways to transcription. The protocol below details the experimental execution of bioluminescence activation in cells and organisms and describes the results using bioluminescence-driven recombinases and transcription factors. The protocol provides investigators with the basic procedures for carrying out bioluminescent optogenetics in vitro and in vivo. The described approaches can be further extended and individualized to a multitude of different experimental paradigms.

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence-light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small-molecule substrate, a luciferin-can be harnessed to activate photosensory proteins, thereby adding another dimension to light stimulation and enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells across temporal and spatial scales.

علم البصريات الحيوي 2.0: تسخير التلألؤ الحيوي لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية في المختبر وفي الجسم الحي

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

Biochemistry

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

Biology

Introduction to Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is a very powerful analytical tool that combines the magnifying properties of light microscopy with visualization of fluorescence. Fluorescence is a phenomenon that involves absorbance and emission of a small range of light wavelengths by a fluorescent molecule known as a fluorophore. Fluorescence microscopy is accomplished in conjunction with the basic light microscope by the addition of a powerful light source, specialized filters, and a means of fluorescently labeling a sample. This video describes the basic principles behind fluorescence microscopy including the mechanism of fluorescence, the Stoke&#x2019;s shift, and photobleaching. It also gives examples of the numerous ways to fluorescently label a sample including the use of fluorescently tagged antibodies and proteins, nucleic acid fluorescent dyes with, and the addition of naturally fluorescent proteins to a specimen. The major components of the fluorescence microscope including a xenon or mercury light source, light filters, the dichroic mirror, and use of the shutter to illuminate the sample are all described. Finally, examples of some of the many applications for fluorescence microscopy are shown.

Fluorescence Microscopy: Concept, Instrumentation, and Applications

Fluorescence microscopy is a very powerful analytical tool that combines the magnifying properties of light microscopy with visualization of fluorescence. ...

JoVE Science Education

Basic Biology

General Laboratory Techniques

Photoluminescence: Fluorescence and Phosphorescence

Photoluminescence is a process where a molecule absorbs light energy and re-emits it in the form of light. This phenomenon occurs when a substance absorbs photons, promoting its electrons to higher energy level excited states, followed by a relaxation process in which the electrons return to their original ground state energy levels and emit light. Photoluminescence is widely observed in various materials, including semiconductors, and organic and inorganic compounds.
A pair of electrons in a singlet spin state occupy the same electronic ground state with opposite spins, while a triplet excited state occurs when an electron&#39;s spin is no longer paired with that of the ground state. There are two main types of photoluminescence based on the electron spin states involved: fluorescence and phosphorescence.
Fluorescence is a type of photoluminescence characterized by rapid decay time, typically ranging from nanoseconds to microseconds. In fluorescence, the excited and ground states have the same electron spin multiplicity, meaning that the electron spin remains unchanged during the transition. The process involves singlet-singlet transitions, where both the excited and ground states are singlet states where all electrons are paired.
Phosphorescence is another type of photoluminescence characterized by significantly longer decay times, extending from milliseconds to minutes. In phosphorescence, the excited and ground states have different electron spin multiplicities. The process involves triplet-singlet transitions, where the excited state is a triplet state (two unpaired electrons with parallel spins), and the ground state is a singlet state. These transitions are &#39;spin-forbidden,&#39; meaning the electron spin must change during the transition.
Both fluorescence and phosphorescence can be used in various applications, such as optical sensors, bioimaging, and organic light-emitting diodes. Photoluminescence spectra are recorded by measuring the intensity of emitted radiation in relation to either the excitation wavelength or the emission wavelength. Excitation spectra are obtained by monitoring emission at a fixed wavelength while varying the excitation wavelengths. Emission spectra are obtained by using a fixed wavelength to excite molecules.

التألق الضوئي: الفلورية والفسفورية

Photoluminescence is a process where a molecule absorbs light energy and re-emits it in the form of light. This phenomenon occurs when a substance absorbs ...

JoVE Core

Analytical Chemistry

Unit 1

Introduction to Molecular Spectroscopy

KEY TERMS AND CONCEPTS

التلألؤ الضوئي: التألق والفسفور

Photoluminescence: Applications

Photoluminescence offers a wide range of applications due to its inherent sensitivity and selectivity. This technique allows for both direct and indirect analyses of the analyte. Direct quantitative analysis is possible when the analyte exhibits a favorable quantum yield for fluorescence or phosphorescence. However, an indirect analysis may be feasible if the analyte is not fluorescent or phosphorescent, or if the quantum yield is unfavorable. Indirect methods include reacting the analyte with a reagent to form a fluorescent product or measuring the decrease in fluorescence upon adding the analyte to a solution containing a fluorescent molecule.
Inorganic ions, with a few exceptions like UO2+, are generally not sufficiently fluorescent for direct analysis. These ions can be analyzed with an organic ligand to form a fluorescent or phosphorescent metal-ligand complex. Organic compounds containing aromatic rings are typically fluorescent, while aromatic heterocycles tend to be phosphorescent. If the organic analyte is not naturally fluorescent or phosphorescent, it can sometimes be incorporated into a chemical reaction to produce a fluorescent or phosphorescent product. For instance, the enzyme creatine phosphokinase can be determined by catalyzing the formation of creatine from phosphocreatine, which then reacts with ninhydrin to yield a fluorescent product of unknown structure.
Phosphorescence and fluorescence methods are complementary as strongly fluorescing compounds exhibit weak phosphorescence and vice versa. Phosphorimetry has been used to determine a variety of organic and biochemical species. However, it is not as widespread as fluorometry, possibly due to the need for low temperatures and the generally poorer precision of phosphorescence measurements. In recent years, considerable effort has been put into developing phosphorimetric methods that can be carried out at room temperature. These include methods where the analyte is bound to a solid support, such as filter paper or silica gel, or incorporated into the core of micelles or cyclodextrin molecules. In most room-temperature experiments, heavy atoms, such as Tl(I), Pb(II), Ag(I), and halide ions, are used to promote intersystem crossing.

التلألؤ الضوئي: التطبيقات

Photoluminescence offers a wide range of applications due to its inherent sensitivity and selectivity. This technique allows for both direct and indirect ...

خطوة أبعد بريت: الإسفار عن طريق الإثارة غير منضم من التلألؤ (FUEL)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تخليق لومينول

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

الإرسال المتعدد وركزت التحفيز بالموجات فوق الصوتية مع الفحص المجهري الأسفار

علم البصريات الحيوي 2.0: تسخير التلألؤ الحيوي لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية في المختبر وفي الجسم الحي

تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

Introduction to Fluorescence Microscopy

التألق الضوئي: الفلورية والفسفورية

التألق الضوئي: الفلورية والفسفورية

التلألؤ الضوئي: التطبيقات