نود أن نشكر الدكتور س. ريسلر (قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية ، وكلية بايلور للطب) ليشير الى ان استخدام مركزات البروتين لزيادة تركيز MMPs supernatants في ثقافة الخلية. وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من الصندوق المسنين السيدة كليفورد غراهام الابيض بحوث وهبوا NIAMS المعاهد الوطنية للصحة / (AR059838) لبناء القدرات. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. تحميل وتشغيل جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يكون مستعدا على نحو كاف جميع العينات للحفاظ على وظيفة الأنزيمات واستخدامها على الفور بعد ان جمع أو تخزينها في المجمد -80 درجة مئوية. يجب أن العينات لا تحتوي على الحد من عوامل (مثل هذا β - المركابتويثانول) أو أن يغلى قبل تحميل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الحقيبة التي تحتوي على مادة هلامية داخل الكاسيت ، كاسيت شطف مع الماء منزوع الأيونات. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط الواقية من الجزء السفلي من الكاسيت والمشط من أعلى الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ثلاث مرات مع العازلة تشغيل الآبار (مخفف ل1X في الماء منزوع الأيونات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل في الخلوي البسيطة ، وضمان أن أصغر جانب الكاسيت تواجه الداخل. القفل في مكانه مع جل إسفين التوتر. ميني سيل يسمح لتشغيل واحد أو اثنين الهلام بشكل متواز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل أعلى (في الداخل) مع الغرفة العازلة 1X فوق مستوى تشغيل الآبار ، وتحقق من وجود أي تسرب. في حالة حدوث تسرب ، وإزالة المنطقة العازلة وإعادة الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة السفلى مع 1X العازلة على التوالي. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر من علامة البروتين الجزيئي في واحدة أيضا. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج مبلغ مساو من هلام تحميل العازلة والعينة وتحميل في الآبار لاستخدام هلام هلام تحميل نصائح (تغيرت بين كل عينة). يمكن تحميل هذه الآبار مع ما يصل مجموعه إلى 20 ميكرولتر. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على خلية صغيرة وأسلاك توصيل كهربائي لتزويد الطاقة. التبديل إمدادات الطاقة على وضعه للتشغيل عند 125 V المستمر لمدة 90 دقيقة. تحقق من تشكيل فقاعات صغيرة على السلك من مجلس النواب ، مشيرا الى التداول الحالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تشغيل هلام الأولى ، ورصد التقدم المحرز في الهجرة كل 15 دقيقة ، وذلك باستخدام اللون الأزرق bromophenol المدرجة في المنطقة العازلة تحميل كمؤشر. السماح للتشغيل حتى هلام الصبغة المؤشر يصل إلى الجزء السفلي من هلام. </li></ol> 2. Renaturing وتطوير جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جيل ، وإعداد 100 مل من 1X renaturing العازلة و 200 مل من تغيير طبيعة العازلة ، سواء في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تتبع bromophenol صبغة زرقاء تصل إلى الجزء السفلي من هلام ، والتبديل إمدادات الطاقة إيقاف ، افتح الخلية البسيطة ، وإزالة هلام. فصل الجانبين من الكاسيت باستخدام سكين هلام (أو ملعقة وزنها). قطع الزاوية للاحتفال في اتجاه الجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الجل من الكاسيت ووضع في وعاء مع 100 مل renaturing العازلة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة renaturing وإضافة 100 مل من تطوير العازلة إلى هلام. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة النامية وإضافة أكثر من 100 مل العازلة النامية إلى هلام. يحضن بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة النامية وشطف ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) مع الماء منزوع الأيونات في إطار التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح هلام لحفظ المواقع الدقيقة للفرق القياسية البروتين لأنها سوف تصبح أقل وضوحا أو لا بعد تلطيخ هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الجل وذلك بإضافة 20 مل من Safestain SimplyBlue إلى هلام. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة SafeStain SimplyBlue وإزالة وصمة عار في جل 100 مل أو أكثر منزوع الأيونات الماء لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على أفضل النتائج ، مع استبدال الماء منزوع الأيونات الطازجة واحتضان لمدة ساعة أو أكثر في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الجل من الماء ووضعه في حامية ورقة من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح هلام مع دقة 300 نقطة في البوصة أو أعلى. حفظ الصورة بتنسيق TIFF (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة الموجات مع ImageJ (أو برامج أخرى مشابهة). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف TIFF في ImageJ (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور بالأبيض والأسود عن طريق اختيار &quot;&gt; صورة نوع&gt; 8 بت&quot; (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة التحديد المستطيل لمخطط الفرقة الأولى ، رسم مستطيل على الأقل مرتين أعلى مما هو عليه واسعة (وهذا هو شرط البرمجيات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;1&quot; أو حدد &quot;تحليل&gt; الهلام&gt; تحديد المسار الأول&quot; سيتم تحديدها ، والفرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يظهر مستطيل جديدة ، نقله إلى الفرقة القادمة ، وحدد &quot;تحليل&gt; الهلام حارة تحديد&gt; المقبلة&quot;. تكرار حتى يتم تحديد جميع نطاقات (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;3&quot; أو حدد &quot;تحليل&gt; الهلام مسارب الأرض&gt;&quot; لإنشاء ملف لكل مؤامرة فرقة (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار استخدام خط مستقيم (يجب أن يكون بالفعل تحديد تلقائيا) لرسم خطوط الأساس بحيث ذروة الفائدة هي منطقة مغلقة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أداة العصا فوق وداخل كل الذروة لتحديده. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تحليل&gt; الهلام قمم تسمية&gt;&quot; للحصول على طاولة المفاوضات مع كل منطقة لتحديد الذروة. يمكن رسم هذه البيانات على هذا النحو (Fويمكن تطبيع igure 1D) أو إلى قيمة الشريط الذي تم اختياره. هذا التطبيع مهم خصوصا عندما تجمع القيم من المواد الهلامية نسخ عديدة لتحديد الدلالة الإحصائية للنتائج. </li></ul></li></ol> 4. ممثل النتائج نظهر هلام مع 11 بئرا محملة supernatants ثقافة مختلفة الخلية التي تحتوي على كميات مختلفة من MMP - 2 (الشكل 1A). الملاحظة المباشرة لهذا الهلام يظهر اختلافات واضحة في MMP - 2 التركيزات بين بعض الآبار. على سبيل المثال ، فإنه من الواضح أن آبار # 4 و 5 تحتوي على أكثر بكثير من MMP - 2 جيدا أو جيدا # 11 حتى 10 #. الهدف من القياس الكمي للنطاقات استخدمنا قياس كثافة مع برنامج ImageJ (الشكل 1B - D) ، مؤكدا وجود فرق ما يقرب من 4 أضعاف في MMP - 2 كميات جيدة بين 11 و # # الآبار 4 و 5 و فرق ما يقرب من 2 أضعاف في MMP - 2 كميات جيدة بين # 10 # والآبار 4 و 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الكشف عن MMP - 2 بواسطة zymography الجيلاتين. صورة ، الممسوحة ضوئيا من جل الجيلاتين. وأشارت الأرقام بشكل جيد في الجزء العلوي من هلام. ب ، الجل نفسه كما في هو موضح في بالأبيض والأسود لقياس كثافة. وقد تم اختيار كل الفرقة مع مستطيل في ImageJ. C ، وهناك مثالان لمحات عن كثافة الجل هو مبين في ألف وباء (العصابات # # 4 و 11). وقد رسم خط مستقيم عند قاعدة كل الذروة إلى إنشاء منطقة مغلقة. D قطعة من المناطق الذروة للهلام هو مبين في ألف وباء التطبيع (يمين) قبل (يسار) وبعد أن كثافة الفرقة رقم 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 ، وهذا الرقم يوضح كيف يمكن استخدام zymography كأسلوب نصف الكمية. وقد حملت لنا التخفيفات المتسلسلة (الخطوات من التخفيفات 01:01) في 7 آبار على التوالي ، وقياس كثافة الموجات على حد سواء المؤيدة - 2 - MMP و MMP - 2.

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد أثبتت لنا كيفية تنفيذ تحليل zymographic من MMP - 2 في supernatants ثقافة الخلية. يجب تحديد كمية العينة ليتم تحميلها اعتمادا على هلام تجريبيا في الأصل وMMP من الفائدة. قد تحميل القليل جدا سوف يمنع الكشف أثناء تحميل الكثير يؤدي إلى تشبع وهناك ركيزة فقط بقدر ما هو البروتيني يمكن هضم في مجال الفرقة. يمكن إذا لزم الأمر ، يمكن أن تضعف العينة في الماء منزوع الأيونات قبل الاختلاط العازلة التحميل أو الوقت النامية من خفض دي بين عشية وضحاها إلى 4 ساعات. ومن الممكن أيضا أن تركز البروتينات في حل باستخدام مركزات (مثل ميليبور التسويقي UFC803024 #). إذا نطق تبقى مرئية بالكاد ، قد يكون من الضروري لتطوير المواد الهلامية لفترة أطول من الزمن ، حتى تصل إلى 48 ساعة. عند إعداد عينات من supernatants زراعة الأنسجة ، ينبغي الإشارة إلى أن مصل بقري جنيني (والأمصال الأخرى) يحتوي على MMPs التي يمكن أن تؤثر على النتائج. لهذا السبب ، نقوم بجمع كافة supernatants لدينا ثقافة في المصل بعد خالية من المتوسط. ويغسل وصفها في الفقرتين 2.9 و 2.10 للبروتوكول ضرورية لإزالة الخلفية من تلطيخ العصابات هضمها. وسوف يعد مرات غسل إزالة أكثر الخلفية ، ولكن قاتمة أيضا تلون الركيزة في جميع أنحاء هلام. إذا غسل أوقات أطول ضرورية ، نوصي مسح هلام كل بضع ساعات لتحديد تفحص مع أفضل التباين. ويمكن استخدام هذه التقنية لكشف MMPs الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن MMP - 9 على الجيلاتين الهلام ، وأيضا إلى انخفاض مدى MMP - 1 ، MMP - 8 ، 13 - MMP والجيلاتين وليس الركيزة المفضل لديهم. تم الكشف عن أفضل MMP - 1 و MMP - 13 على zymography الكولاجين بينما الكازين هو الركيزة المفضل لMMP - 11 ويسمح أيضا للكشف عن MMP - 1 ، MMP - 3 ، MMP - 7 ، MMP - 12 ، و 13 - MMP 9. MMP - 7 (matrilysin) وcollagenases (MMP - 1 و MMP - 13) يصعب الكشف عندما تكون موجودة عند مستويات منخفضة في الكازين المواد الهلامية أو الجيلاتين. إضافة إلى نموذج الهيبارين في وقت التحميل جل تحسن كبير في الحد من الكشف عن MMP - 7. لMMP - 1 و 13 - MMP ، والهيبارين يحتاج إلى إضافته إلى هلام بعد تشغيل الكهربي جار بالفعل 12. منذ zymography تدابير النشاط الأنزيمي بعد تمسخ واستعادة الطبيعة من الإنزيمات ، فإنه سيتم قياس نشاط كل MMPs موجودة في العينة. وتشمل هذه الانزيمات ، والانزيمات المؤيدة ، والانزيمات منضمة إلى مثبطات الذاتية (على سبيل المثال TIMP - 2). ومع ذلك فمن الممكن لتحديد مستوى التنشيط MMP في العينة من خلال مقارنة الكثافة عصابة من الإنزيم النشط وذلك لإنزيم للمحترفين ، والتي سوف يكون لها وزن جزيئي أعلى قليلا. Zymography غالبا ما تكون غير كافية لتحديد هوية MMP. مقارنة بين مستوى الهجرة من MMP مع معايير معروفة الوزن الجزيئي لا يساعد في تحديد الهوية ولكن تجدر الإشارة إلى أن بعض هذه المعايير تتضمن خفض عامل ، وأنه عندما تستخدم في ظل عدم الحد من الظروف التي قد تشير إلى أوزان جزيئية مختلفة 9. الخيار هو لتحميل MMP المؤتلف للذوبان في هلام نفس عينات الاختبار. ولكن قد تكون مرتبطة MMPs مع بروتينات أخرى ، الأمر الذي أدى إلى تغيير في الوزن الجزيئي واضح. يمكن إضافة مثبطات انتقائية لMMP الجل (أو جزء من قطع هلام في نصف) خلال حضانة في المخزن النامية كأدوات الدوائية للهوية يوصى MMP تقنية interest.A الثاني (الغربية وصمة عار ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، أو ELISA) ل المساعدة في تحديد هوية MMP من الفائدة. وتجدر الإشارة إلى أن حدود الكشف عن البقع الغربية غالبا ما تكون أقل بكثير من تلك المواد الهلامية zymographic ، مما قد يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة عند استخدام هذه التقنية.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

metalloproteinases المصفوفة (MMPs) هي التي تحتوي على الزنك endopeptidases. انها تتحلل البروتينات التي تشطر سندات ببتيد. وقد تم تحديد أكثر من عشرين MMPs ويتم فصل إلى ست مجموعات على أساس بنيتها التحتية ونوعية (collagenases ، gelatinases ، نوع الغشاء [MT - MMP] ، stromelysins ، matrilysins ، وغيرها). MMPs تلعب دورا حاسما في غزو الخلية ، وتدهور الغضاريف ، إعادة تشكيل الأنسجة والتئام الجروح ، والتخلق. ولذلك كانت تشارك في كل العمليات الطبيعية والمرضية في كثير من الأمراض ، مثل التهاب المفاصل الروماتيزمي ، والسرطان ، أو مرض الانسداد الرئوي المزمن 1-6. هنا ، سوف نركز على MMP - 2 (جيلاتيناز A ، النوع الرابع كولاجيناز) ، وأعرب عن MMP على نطاق واسع. سوف نقوم شرح كيفية الكشف عن MMP - 2 في خلية ثقافة supernatants zymography ، وهي شائعة الاستخدام ، وتقنية بسيطة ، وحتى الآن حساسة للغاية لأول مرة في عام 1980 من قبل المجلس التنفيذي وHeussen جيم Dowdle 70-10. هذا الأسلوب هو نصف الكمية ، ويمكن بالتالي استخدامها لتحديد مستويات MMP في عينات الاختبار عندما يتم تحميل تركيزات المعروفة MMP المؤتلف على نفسه جل 11. يتم تحميل محاليل تحتوي على MMPs (مثل supernatants خلية ثقافة والبول ، أو مصل) إلى مادة هلامية تحتوي على كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد دوديسيل (SDS ؛ ليصبح خطي البروتينات) ، والجيلاتين (الركيزة لMMP - 2). تم تصميم العينة عازلة لزيادة اللزوجة عينة (لتسهيل التحميل هلام) ، وتوفير صبغة التتبع (أزرق bromophenol ؛ لمراقبة الهجرة العينة) ، وتقديم الجزيئات تغيير طبيعة (ليصبح خطي البروتينات) ، والتحكم في درجة الحموضة في العينة. ويسمح للبروتينات ثم إلى الهجرة تحت تيار كهربائي في منطقة عازلة مصممة لتوفير تشغيل معدل الهجرة المستمرة. يرتبط ارتباطا عكسيا المسافة للهجرة مع الوزن الجزيئي للبروتين (بروتينات صغيرة تتحرك بشكل أسرع من خلال هلام من البروتينات ، وبالتالي لا كبيرة ترحيل مزيد من أسفل الجل). بعد الهجرة ، ويتم وضع الجل في renaturing عازلة للسماح للبروتينات لاستعادة بنيتها العالي ، واللازمة لنشاط الأنزيمي. ثم يتم وضع الجل في منطقة عازلة مصممة النامية للسماح للبروتياز لهضم ركيزة لها. المخزن يحتوي أيضا على تطوير ف aminophenylmercuric خلات (APMA) لتنشيط بروتين غير الموالية للMMPs في MMPs النشطة. الخطوة التالية يتكون من تلطيخ الركيزة (الجيلاتين في مثالنا). بعد غسل الصبغة قبالة هلام ، ومجالات الهضم البروتيني تظهر الفرق واضح. وأوضح الفرقة ، وأكثر تركيزا على البروتياز التي يحتوي عليها. ويمكن بعد ذلك الفرقة كثافة تلوين تحددها كثافة ، وذلك باستخدام برامج مثل ImageJ ، مما يسمح للمقارنة العينة.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography at JoVE.com

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

يصف هذا البروتوكول مقايسة على أساس النشاط لاكتشاف metalloproteinases مصفوفة في supernatants الثقافة أو سوائل الجسم.

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

83.4K Views.  Baylor College of Medicine. يصف هذا البروتوكول مقايسة على أساس النشاط لاكتشاف metalloproteinases مصفوفة في supernatants الثقافة أو سوائل الجسم.

Video: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي<em&gt; في المختبر</em&gt; RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.