وقد تم تمويل هذا العمل من قبل بالتتابع حدود NCCR في جائزة رائد علم الوراثة، الأحداث السكري أبحاث مؤسسة جرانت 41-2009-775 والمنح 12-126875 من ديت Frie Forskningsråd / Sundhed عوج Sygdom. المؤلفين أشكر مختبر Spagnoli لاستضافة تصوير الفيديو.

ويهدف هذا البروتوكول لتنمو organoids البنكرياس المستمدة من الفئران E10.5 فصل الخلايا الظهارية البنكرياس. البروتوكول يتطلب موافقة أخلاقية لإجراء التجارب على الحيوانات. 1. تشريح الظهرية البنكرياس برعم من E10.5 أجنة الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران توقيت الحوامل في اليوم الجنينية (E) 10.5، وفتح البطن مع زوج من مقص، وإزالة قرني الرحم ووضعها في طبق بتري 10 سم مليئة الفوسفات عازلة المالحة الباردة (PBS) أو تعديل Dulbecco المتوسطة الأساسية (DMEM) أبقى على الجليد. يتم التجربة الإجمالية من التضحية لبذر خلية في 60-90 دقيقة لمنع تلف الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الرحم إلى أجزاء الجنين الفردية باستخدام مقص صغير. نقل جنين واحد إلى طبق بيتري 35 ملم مع PBS الباردة وتصور تحت المجهر تشريح مع إضاءة من فوق. مع ملقط تشريح إزالة المحيطة العضلات، والساقط وصفار ساج وفضح الجنين. وضع الجنين مرة أخرى إلى الباردة المتوسطة DMEM. يمكن بسهولة نقل الأجنة باستخدام 3 مل ماصة نقل البلاستيك / بالقطارة. عزل كل فرد الجنين بطريقة مماثلة قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين في طبق بتري 35 مم نظيفة في برنامج تلفزيوني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط رقيقة (0.05 ملم عرض) لإزالة forelimb. إدراج بلطف ملقط في افتتاح لفصل الجهاز الهضمي من منطقة النخاع الشوكي (الشكل 1). اختياري: لمشاهدة أكثر سهولة المعدة، وإزالة الجزء العلوي من الجسم للجنين، وصولا الى قلب ومنطقة الذيل أدناه ساق صفار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع المعدة والكبد والأمعاء. باستخدام ملقط، عزل القناة الهضمية من المعدة إلى الأمعاء ووضعه في DMEM الباردة على الجليد (الشكل 1). يتم إرفاق برعم البنكرياس الظهرية ظهريا، الخلفي إلى المعدة (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل كل الجهاز الهضمي الفردية في سيميبطريقة لار قبل المتابعة. إذا في حاجة إلى أن الأجنة مرمزة بالجينات، وجمع الذيل في وقت تشريح والحفاظ على كل الجهاز الهضمي الفردية في بئر مختلفة في 24 لوحة جيدا مع DMEM الباردة على الجليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجهاز الهضمي واحدة في طبق بيتري 35 ملم نظيفة في برنامج تلفزيوني الباردة. الآن استخدام الإضاءة من الأسفل في حقل مشرق لتصور وتشريح الظهرية برعم البنكرياس تحت المجهر تشريح. هذه الشروط سوف تحسين التصور من وحدات التخزين. باستخدام الإبر التنغستن شحذ الكهربائي أو 20 G الإبر المحاقن، وعزل برعم البنكرياس مع اللحمة المتوسطة أقل قدر ممكن حول ظهارة (الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل برعم معزولة في طبق بتري تحتوي على حل dispase الباردة (1.25 ملغ / مل) لمدة 2-3 دقيقة. من هذه النقطة، يمكن لمعظم مريح أن يتم نقل مع انسحاب الشعلة 50 الشعيرات الدموية الزجاج ميكرولتر تعلق على أنبوب مرن التي تسيطر عليها الفم. بدلا من ذلك، ولكن مع مزيد من ريكورونا فقدان مهدها، استخدم 10 ميكرولتر ماصة أوتوماتيكية (Pipetman) مع نصائح البلاستيك المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء البنكرياس تطلع برعم وطرد تحت السيطرة المجهرية. وضع برعم البنكرياس مرة أخرى في برنامج تلفزيوني. مزيد من تنظيف برعم البنكرياس معزولة من اللحمة المتوسطة مع الإبر والتطلع لطيف باستخدام الزجاج الشعرية (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إزالة اللحمة المتوسطة بأكملها، شطف برعم البنكرياس في برنامج تلفزيوني الباردة؛ نقل كل برعم إلى DMEM الباردة في الآبار الفردية (60 جيدا صواني صغيرة مليئة 10 ميكرولتر من DMEM الباردة). فمن المهم عدم إزالة اللحمة المتوسطة في dispase، مما يجعل الأنسجة لزجة جدا. </li></ol></li></ol> 2. الطلاء وثقافة خلايا متناثرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ظهائر تشريح من جميع الأجنة مع كوب الشعرية سحبت اللهب في آبار المخروطية من 60 جيدا صواني صغيرة مليئة 10 ميكرولتر PBS للشطف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل برعم في 10 ميكرولتر من التربسين 0.05٪ لالثانية السماح لها احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. إبطال نشاط التربسين عن طريق نقل برعم في بئر مع 10 ميكرولتر DMEM + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل في تعليق خلية بواسطة الطموح من خلال الشعيرات الدموية رقيقة وانسحبت مع ساحبة ماصة. من المهم تجنب فقاعات في هذه المرحلة في حين pipetting صعودا وهبوطا لفصل الخلايا. organoids البنكرياس تبدأ على النحو الأمثل من مجموعات صغيرة من 5-15 الخلايا وينصح بالتالي التفكك الجزئي (الشكل 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الخلايا من العديد من الأجنة في أنبوب إيبندورف من أجل تقليل الاختلافات بسبب المعالجة الفردية. تمييع تعليق خلية في Matrigel المبردة بنسبة 01:03. قسامة هذا الخليط لوحة 96 جيدا، 8 ميكرولتر / جيد أو في لوحة الأمثل للتصوير (انظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والسماح للMatrigel لرشاقته. ملء الآبار مع 70 ميكرولتر من المتوسط ​​من خيار (عضوي أو المجال، راجع تبويبليه 1 و 2) وترك في بيئة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة كل يوم 4 ال. رصد المستعمرات البنكرياس يتزايد يوميا وتوثيق هذه العملية عن طريق التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جزيئات صغيرة من البروتينات أو الفائدة يمكن أن تضاف إلى وسيلة في هذه المرحلة للتجارب التدخل، كما ذكرت سابقا 28. </li></ol> الجدول 1: متوسط ​​عضوي. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> الأسهم تركيز </td><td> التركيز في النهائي المتوسطة </td><td> حجم المخزون </td></tr><tr><td> البنسلين، الستربتوميسين </td><td> 100٪ </td><td> 1٪ </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> خروج المغلوب استبدال المصل (تكملة) </td><td> 100٪ </td><td> 10٪ </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 2 المركابتويثانول </td><td> 14.3 M </الدفتيريا&gt; <td> 0.1 ملي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Phorbol ميريستيت خلات (سلطة النقد الفلسطينية) </td><td> 16 ميكرومتر </td><td> 16 نانومتر </td><td> 5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK المانع) </td><td> 50 ملي </td><td> 10 ميكرومتر </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> صندوق تعديل العولمة الأوروبي </td><td> 50 ميكروغرام / مل </td><td> 25 نانوغرام / مل </td><td> 2.5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> المؤتلف الإنسان R-spondin 1 </td><td> 250 ميكروغرام / مل </td><td> 500 نانوغرام / مل </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr><tr><td> - أو - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> المؤتلف ماوس R-spondin 1 </td><td> 250 ميكروغرام / مل </td><td> 500 نانوغرام / مل </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr><tr><td> المؤتلف FGF1 الإنسان (aFGF) </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td><td> 25 ميكروغرام / مل </td><td> 1.25 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الهيبارين (Liquemin) </td><td> 2500 U / مل </td><td> 2.5 U / مل </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الذي أوصتbinant FGF10 الإنسان </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td><td> 100 نانوغرام / مل </td><td> 5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4،412.25 ميكرولتر </td></tr><tr><td> مجموع </td><td></td><td></td><td> 5،000 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 2: المجال المتوسطة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> الأسهم تركيز </td><td> التركيز في النهائي المتوسطة </td><td> حجم المخزون </td></tr><tr><td> البنسلين، الستربتوميسين </td><td> 100٪ </td><td> 1٪ </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> B27 X50 (تكملة) </td><td> 100٪ </td><td> 10٪ </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td> المؤتلف FGF2 الإنسان (bFGF) </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td><td> 64 نانوغرام / مل </td><td> 3.2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK المانع) </td><td> 50 ملي </td><td> 10 ميكرومتر </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845.8 ميكرولتر </td></tr><tr><td> مجموع </td><td></td><td></td><td> 5000 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> 3. التصوير من التقدم التنمية عضوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids الصورة إما يوميا أو حسب وقت الفاصل بين المجهري باستخدام المجهر الفلورسنت مرور الزمن. لوقت التصوير مرور، استخدم XY (Z) الآلي المجهر الفلورسنت المقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطرات صغيرة من إيداع 3 ميكرولتر في لوحات 4 جيدا أو لوحات من الزجاج السفلي مليئة 2-5 مل المتوسطة. صورة مع الهدف 10X لمسافات طويلة. ملاحظة: الفئران المعدلة وراثيا معربا عن استشفاف الفلورسنت يمكن استخدامها. الفيلم 1 يبين على سبيل المثال التوسع الأولي لorganoids من Pdx1-Ngn3-ER-TM-IRES nGFP + الفئران 4. وGFP النووية تمكن المستخدم من تتبع الخلايا ككائنات فردية ولكن مبادئ مماثلة يمكن تطبيقها على تتبع الخلايا مع مضان غشاء مثلكما طن / ملغ الفئران 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الوقت الفاصل بين التصوير 3 ساعة بعد البذر الخلايا لتجنب الانجرافات التركيز وضبط برامج التحكم في التشغيل الآلي لالتقاط صور 1 / ساعة لمدة 3 أيام أو أكثر في مواقع محددة يدويا. لكل موقف، والحصول على المقابل تدخل الفرق (DIC) صورة فضلا عن إشارة GFP، وتقديم التقارير الفلورسنت التعبير علامة. </li></ol> 4. استرداد Organoids لعلم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة 96 جيدا على الجليد وإزالة المتوسطة، والاستعاضة عنها مع PBS الباردة الجليد. هذا depolymerizes جزئيا Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف كل عضوي الفردية، وإزالة Matrigel المحيطة باستخدام تلميح 1،000 ميكرولتر من أجل عدم تعطيل العمارة بشكل عام. نقل كل عضوي لبئر مع الثلج الباردة PBS. الحفاظ على لوحة على الجليد. التثبيت المباشر في Matrigel هو ممكن أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح عضوي لمدة 15 دقيقة في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، cryopreserve في السكروز وتضمين ذلك في الجيلاتين. معالجة كلعضوي لcryosectioning والأنسجة كما هو موضح سابقا (يوهانسون وآخرون، 2007) 4. </li></ol> 5. استرداد Organoids لPCR والكيمياء الحيوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة 96 جيدا على الجليد وإزالة المتوسط. إضافة 60 ميكرولتر من RNAlater لكل بئر من أجل تحقيق الاستقرار وحماية الحمض النووي الريبي الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل هلام في كل ميكانيكيا بشكل جيد من قبل depolymerizing ذلك جزئيا على الجليد. إما استرداد organoids الفردية باستخدام تلميح 1،000 ميكرولتر من أجل عدم تعطيل البناء الشامل أو استرداد كامل جيدا (مع Matrigel) عن طريق تعطيل هلام ميكانيكيا مع 200 ميكرولتر غيض. استخدام غيض 1،000 ميكرولتر لنقل المحتويات جيدا إلى ريبونوكلياز خالية من غير لزجة أنبوب إيبندورف أبقى على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار مع 60 ميكرولتر RNAlater وإضافة المحتويات المتبقية لنفس أنبوب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنابيب لمدة 5 دقائق في 500-1،000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، ولم يتبق سوى 20-30 ميكرولترمن RNAlater في الأنبوب جنبا إلى جنب مع بيليه. لالكيمياء الحيوية، وتخزين العينات جافة قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تجميد العينات في RNAlater فورا؛ تخزينها في 4 درجات ثاني / N (للسماح RNAlater لاختراق الأنسجة بدقة). ويمكن تخزين الأنسجة في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل ويمكن أن تتم معالجتها في وقت لاحق لتعطيل الأنسجة واستخراج كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+functional+beta-cell.">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li><li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme.">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li><li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types.">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li><li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells.">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development.">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979 (2012).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+interrogation+of+stem+cells.">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li><li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS.">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation.">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الإنتاج على نطاق واسع من خلايا بيتا وظيفية في المختبر لا تزال غير فعالة 1. في هذا السياق الصعب، قد تساعد الدراسات البيولوجيا التطورية فك رموز الإشارات الدقيقة التي مطلوبة من أجل تمايز الخلايا بيتا وظيفية. هذا البروتوكول يسمح للصيانة وتوسعة والتفريق بين ال?...

يوفر الجهاز الثقافة نموذجا مفيدا أن يسد الفجوات بين المجمع ولكن ذات أهمية كبيرة في التحقيقات المجراة والمحاكاة مريحة ولكن التقريبية للنماذج خط الخلية. في حالة البنكرياس، وليس هناك خط الخلية يعادل تماما لالأسلاف البنكرياس على الرغم من أن هناك يتم تحويل خطوط الخلايا محاكاة خلايا الغدد الصماء وإفرازات. لا يمكن تربيتها الكبار البنكرياس كله؛ يمكن الحفاظ على الجزر المعزولة الغدد الصماء لبضعة أسابيع دون تكاثر الخلايا ويمكن أن تظل شرائح الأنسجة في المختبر لبضع ساعات 5. وقد الثقافة البنكرياس الجنينية المستخدمة على نطاق واسع ليس فقط لدراسة تطورها، ولكن أيضا للتحقيق في الظهارة الوسيطة التفاعلات 4،6،7، لصورة يعالج 8 أو التدخل كيميائيا معهم 9. وتستخدم طريقتين ثقافة الجهاز أساسا: الأول يتمثل في زراعة براعم البنكرياس على فبرونيكتين المغلفة لوحات 2، وهو محول،nient لأغراض التصوير؛ الخيار الثاني هو الثقافة الأجهزة على مرشحات في واجهة الهواء السائل 3،4 الذي يحافظ على أفضل التشكل. على الرغم من المفيد جدا، وهذه الأساليب تؤدي إلى درجة معينة من تسطيح؛ توسيع الأسلاف محدودة جدا بالمقارنة مع التطور الطبيعي والسكان بدءا معقد يضم جميع أنواع خلايا البنكرياس وخلايا اللحمة المتوسطة. القدرة على الثقافة، وتوسيع الخلايا الأولية فرقت هو قيمة لدراسة علاقات النسب وكشف الخصائص الذاتية من أنواع الخلايا المعزولة 10. سوغيياما وآخرون 11 يمكن الحفاظ على الأسلاف البنكرياس والغدد الصماء الأسلاف التي احتفظت بعض الشخصيات الفنية لمدة 3-5 أيام في الثقافة على طبقات المغذية. Pancreatospheres، أقرب إلى neurospheres 12 و 13 mammospheres، تم توسيع من الجزر الكبار وخلايا الأقنية على الرغم من أن طبيعة الأسلاف / الخلايا الجذعيةالتي تولد هذه المجالات ليست واضحة. بالإضافة إلى ذلك، في تناقض مع التنمية الفسيولوجية، تضمن pancreatospheres بعض الخلايا العصبية 14،15. كما أنتجت مؤخرا المجالات من الأسلاف البنكرياس الجنينية 16،17 وتجديد 18 بنكرياسات جيدة مع التوسع السلف والتمايز لاحقة لكنها فشلت في ألخص التشكل. 3D نماذج من الخلايا المتفرقة وغالبا ما تعرف أن تنظيم الذاتي في الأجهزة المنمنمة ازدهرت مؤخرا ومحاكاة تطوير أو الكبار دوران أجهزة متعددة مثل الأمعاء 19،20، 21 المعدة، والكبد 22، 23 البروستاتا والقصبة الهوائية 24. في بعض الحالات، وقد لخص التشكل التنموية والتمايز في 3D من خلايا ES، كما هو الحال بالنسبة للأكواب البصرية 25، 26 الأمعاء أو الدماغ 27. هنا، ونحن قصرcribe طريقة لتوسيع فصلها الأسلاف البنكرياس متعددة القدرات في سقالة 3D Matrigel حيث يمكنهم تمييز وتنظيم الذات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3148-25ML</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>524400-1MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644-2MG</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4645-RS-025/CF</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;- or -&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C- do not include to increase beta cell production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (Liquemin)</td>
			<td>Drossapharm</td>
			<td></td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 x50 (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater - RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA for reconstitution</td>
			<td>Milipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td>
			<td>For reconstituition of cytokines&#160; - Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141079</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 well MicroWell trays</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0815-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well plates F bottom</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>6555180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas bottom plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal micropittes</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>708745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

E10.5 الظهرية الأسلاف البنكرياس فصلها والمصنفة في 3D Matrigel ألخص التنمية البنكرياس. الأسلاف يمكن اتباعها بسهولة أكثر مع صحفيين الفلورسنت. في حالتنا استخدمنا الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين GFP النووية التي تسيطر عليها Pdx1 المروج (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (فيلم ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors at JoVE.com

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

طريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول يلخص التنمية البنكرياس من الأسلاف المتفرقة الجنينية الماوس البنكرياس، بما في ذلك توسعها الكبير، والتمايز والتشكل في هيئة متفرعة. هذا الأسلوب هو قابل للتصوير، والتدخل الوظيفية والتلاعب في مكانه.

في المختبر البنكرياس توالد من تفرقوا الجنينية الماوس أسلاف

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

13.7K Views.  Swiss Institute for Experimental Cancer Research.  طريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول يلخص التنمية البنكرياس من الأسلاف المتفرقة الجنينية الماوس البنكرياس، بما في ذلك توسعها الكبير، والتمايز والتشكل في هيئة متفرعة. هذا الأسلوب هو قابل للتصوير، والتدخل الوظيفية والتلا...

Video: In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...