עבודה זו מומנה ברצף על ידי גבולות NCCR בפרס טייס גנטיקה, Juvenile Diabetes Research Foundation גרנט 41-2009-775 וגרנט 12-126875 מDet Frie Forskningsråd / עוג Sundhed Sygdom. המחברים מודים המעבדה Spagnoli לאירוח וידאו הירי.

פרוטוקול זה נועד לגדול organoids לבלב שמקורם E10.5 העכברי ניתק תאי לבלב אפיתל. הפרוטוקול דורש אישור אתי לניסויים בבעלי חיים. 1. Dissection של גב הלבלב באד מE10.5 עוברי עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום חיוני להקריב את העכברים בעיתוי בהריון ביום עוברי (E) 10.5, פתח את הבטן עם זוג מספריים, להסיר את שתי קרנות הרחם ומניח אותם בצלחת פטרי 10 סנטימטר מלא מלוח פוספט הקר חיץ (PBS) או שונה Dulbecco (DMEM) שמר על קרח. הניסוי הכולל מההקרבה לזריעת תאים נעשה ב60-90 דקות על מנת למנוע נזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הרחם למקטעי עובר בודדים באמצעות מספריים קטנים. העבר את העובר אחד לצלחת 35 מ&quot;מ פטרי עם PBS הקר ולדמיין אותו תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. עם מלקחיים נתיחה להסיר את sa שרירים, decidua וחלמון מסביבג ולחשוף את העובר. מניחים את העובר חזרה למדיום DMEM קר. בקלות ניתן להעביר עוברים באמצעות פיפטה / טפטפת העברת פלסטיק 3 מיליליטר. לבודד את כל עובר בודד בצורה דומה לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לעובר 35 מ&quot;מ צלחת פטרי נקי ב-PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים דקים (0.05 רוחב מ&quot;מ) כדי להסיר את forelimb. הכניסו בעדינות את המלקחיים בפתיחה לנתק את מערכת עיכול מאזור חוט השדרה (איור 1). אופציונלי: כדי לראות בצורה נוחה יותר בבטן, להסיר את החלק העליון של גופו של העובר, עד ללב ובאזור הזנב מתחת לגבעול החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הקיבה, הכבד ומעי. באמצעות המלקחיים, לבודד את מערכת העיכול מהקיבה למעי ולמקם אותו בDMEM הקר על קרח (איור 1). ניצן הלבלב הגבי מצורף dorsally, אחורי אל הקיבה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד כל אדם מערכת עיכול בסימיאופן lar לפני שתמשיך. אם העוברים צריכים להיות genotyped, לאסוף את הזנב בעת הנתיחה ולשמור על כל מערכת עיכול בודדת בבאר שונה בצלחת 24 גם עם DMEM הקר על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בדרכי עיכול באחד 35 מ&quot;מ צלחת פטרי נקייה בקור PBS. עכשיו להשתמש בתאורה מלמטה בשדה בהיר כדי לחזות ולנתח את ניצן הלבלב הגבי תחת מיקרוסקופ לנתיחה. תנאים אלה יהיו לייעל את ההדמיה של כרכים. באמצעות מחטי טונגסטן חדדו אלקטרוליטים או 20 מחטי מזרק G, לבודד את ניצן הלבלב עם mesenchyme מעט ככל האפשר סביב אפיתל (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הניצן המבודד לתוך צלחת פטרי שמכילה תמיסה קרה dispase (1.25 מ&quot;ג / מיליליטר) ל2-3 דקות. מנקודה זו, העברה יכולה ביותר נוחות להיעשות עם 50 נימי זכוכית μl-משך להבה מחוברת לצינור גמיש שבשליטת פה. לחלופין, אבל עם יותר ריsk לאבד הניצן, השתמש פיפטה אוטומטית 10 μl (Pipetman) עם טיפים פלסטיק מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שאיפת ניצן לבלב ופליטה תחת שליטה מיקרוסקופית. שים ניצן הלבלב בחזרה ב-PBS. בהמשך לנקות את ניצן הלבלב המבודד מmesenchyme עם המחטים ושאיפה עדינה באמצעות נימי הזכוכית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל mesenchyme מוסר, יש לשטוף את ניצן הלבלב בקור PBS; להעביר את כל ניצן לDMEM הקר בבארות בודדות (60 היטב מיני מגשים מלא ב10 μl של DMEM הקר). חשוב שלא להסיר את mesenchyme בdispase, מה שהופך את הרקמה דביקה מאוד. </li></ol></li></ol> 2. ציפוי ותרבות של תאים מפוזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר האפיטל גזור מכל העוברים עם נימי זכוכית משכה להבה לתוך בארות חרוטי של 60 היטב מיני מגשים מלא ב10 μl PBS לשטיפה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הניצן ל10 μl של 0.05% טריפסיןnd לתת לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. להשבית טריפסין על ידי העברת הניצן להיטב עם 10 DMEM μl 10% עוברי עגל בסרום + (FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ההשעיה התא על ידי שאיפה דרך נימים דקות משכו עם חולץ פיפטה. זה חשוב כדי למנוע בועות בשלב זה תוך pipetting למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים. organoids הלבלב להתחיל בצורה אופטימלית מקבוצות קטנות של 5-15 תאים ולכן ניתוק חלקי מומלץ (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת תאים מכמה עוברים לתוך צינור Eppendorf על מנת למזער את ההבדלים בשל עיבוד פרט. לדלל את ההשעיה התא בMatrigel המצונן ביחס 1:3. Aliquot את התערובת לצלחת 96 היטב, 8 μl / טוב או בצלחת מותאמת להדמיה (ראה להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב-C ° 37 למשך 5 דקות, ומאפשרת Matrigel להתעבות. למלא את הבארות עם 70 μl של מדיום של בחירה (organoid או כדור, ראה לשוניתles 1 ו -2) ולהשאיר בסביבת humidified המכילה 5% CO 2 ו95% אוויר ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום בכל יום 4 ה. לפקח על מושבות לבלב גדלה מדי יום ולתעד את התהליך על ידי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להוסיף מולקולות או חלבונים קטנים של עניין למדיום בשלב זה לניסויי הפרעה, כפי שדווחו בעבר 28. </li></ol> טבלה 1: בינוני Organoid. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של חומר </td><td> ריכוז מניות </td><td> ריכוז במדיום סופי </td><td> נפח של המניה </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> החלפת סרום נוקאאוט (תוסף) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> 14.3 M </td&gt; <td> 0.1 מ&quot;מ </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> Phorbol Myristate אצטט (PMA) </td><td> 16 מיקרומטר </td><td> 16 ננומטר </td><td> 5 μl </td></tr><tr><td> Y-27632 (מעכב ROCK) </td><td> 50 מ&quot;מ </td><td> 10 מיקרומטר </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 25 ng / ml </td><td> 2.5 μl </td></tr><tr><td> האנושי רקומביננטי R-spondin 1 </td><td> 250 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> - או - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> רקומביננטי עכבר 1 R-spondin </td><td> 250 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> FGF1 האנושי רקומביננטי (aFGF) </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 25 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 1.25 μl </td></tr><tr><td> הפרין (Liquemin) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2.5 U / ml </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> מלFGF10 אדם binant </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 100 ng / ml </td><td> 5 μl </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 μl </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td></td><td></td><td> 5,000 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 2: בינוני כדור. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של חומר </td><td> ריכוז מניות </td><td> ריכוז במדיום סופי </td><td> נפח של המניה </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> x50 B27 (תוסף) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> FGF2 האנושי רקומביננטי (bFGF) </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 64 ng / ml </td><td> 3.2 μl </td></tr><tr><td> Y-27632 (מעכב ROCK) </td><td> 50 מ&quot;מ </td><td> 10 מיקרומטר </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845.8 μl </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td></td><td></td><td> 5000 μl </td></tr></tbody></table> 3. הדמיה של ההתקדמות של פיתוח Organoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids תמונה אחת ביום, או על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות ניאון. עבור זמן לשגות הדמיה, השתמש XY מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך אוטומטי (Z). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפות קטנות פיקדון של 3 μl בצלחות 4 היטב או צלחות זכוכית תחתונה מלאות ב2-5 בינוני מיליליטר. תמונה עם מטרה למרחקים ארוכים 10x. הערה: ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים מבטא קליעים נותבים ניאון. סרט 1 מופעים למשל ההתרחבות הראשונית של organoids מPdx1-Ngn3-ER עכברי TM-ires-nGFP + 4. GFP הגרעיני מאפשר למשתמש לעקוב אחר תאים כיכולים להיות מיושמים אובייקטים בודדים אבל עקרונות דומים כדי לעקוב אחר תאים עם הקרינה קרום כזהכמו עכברי MT / מיליגאוס 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל זמן לשגות הדמיה שעה 3 לאחר זריעת התאים, כדי למנוע סחף להתמקד ולהגדיר האוטומציה שליטה בתוכנה כדי לצלם את 1 / שעה למשך 3 ימים או יותר בעמדות שהוגדרו באופן ידני. לכל תפקיד, לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת תמונה (DIC), כמו גם את אות ה-GFP, דיווח ביטוי סמן פלואורסצנטי. </li></ol> 4. שחזור של Organoids להיסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 96 היטב על קרח ולהסיר את המדיום, והחלפתו עם PBS הקר כקרח. זה depolymerizes חלקית Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות כל organoid פרטני, הסרת Matrigel מקיף באמצעות קצה 1,000 μl על מנת שלא לשבש את הארכיטקטורה הכוללת. העבר כל organoid להיטב עם קרח הקר PBS. שמור את הצלחת על קרח. קיבעון ישיר בMatrigel הוא גם אפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן organoid במשך 15 דקות paraformaldehyde 4% (PFA), cryopreserve זה בסוכרוז ולשבץ אותה בג&#39;לטין. לעבד כלorganoid לcryosectioning והיסטולוגיה כמתואר (ג&#39;והנסון et al. 2007) 4 בעבר. </li></ol> 5. שחזור של Organoids לPCR וביוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 96 היטב על קרח ולהסיר את המדיום. הוסף 60 μl של RNAlater בכל טוב על מנת לייצב ולהגן על RNA התאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את הג&#39;ל בכל אחד גם באופן מכאני על ידי באופן חלקי depolymerizing אותו על קרח. כך או לשחזר organoids הבודד באמצעות טיפ 1,000 μl על מנת שלא לשבש את הארכיטקטורה הכוללת או לשחזר גם כולו (עם Matrigel) ע&quot;י שיבוש ג&#39;ל מכאני עם טיפ μl 200. השתמש קצה 1,000 μl להעביר את התוכן גם לתוך צינור Eppendorf חופשי לא דביק RNAse שמר על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות עם 60 RNAlater μl ולהוסיף תוכן שנותר לאותו הצינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הצינורות במשך 5 דקות ב500-1,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, רק עוזב 20-30 μlשל RNAlater בצינור יחד עם גלולה. לביוכימיה, לאחסן דגימות יבשות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להקפיא דגימות בRNAlater באופן מיידי; חנות ב 4 ° CO / N (כדי לאפשר RNAlater לחדור את הרקמה ביסודיות). הרקמה יכולה להיות מאוחסנת ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך ובהמשך יכולה להיות מעובד לשיבוש והפקה של כמויות קטנות של RNA ברקמות. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+functional+beta-cell.">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li><li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme.">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li><li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types.">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li><li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells.">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development.">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979 (2012).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+interrogation+of+stem+cells.">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li><li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS.">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation.">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ייצור בקנה מידה גדולה של תאי הבטא תפקודיים במבחנה הוא עדיין לא יעיל 1. בהקשר זה מאתגר, לימודי ביולוגיה התפתחותית עשויים לעזור בפענוח האותות המדויקים הנדרשים להתמיינות של תאי הבטא תפקודיים. פרוטוקול זה מאפשר לתחזוקה, ההתרחבות וההתמיינות של תאי אב עובריים בלבלב במבחנה. זה כולל את היווצרותם של תאי הביתא המייצר אינסולין שאינו שיתוף להביע הורמונים אנדוקריניות אחרים, יש רמות גבוהות של Pdx1, להביע הפרו convertases שיבשיל לאינסולין ויש לי אינסולין מעובד 28. גורמי מפתח חשובים במערכת הם פעילותה של FGF (מגורה אקסוגני ידי FGF הוסיף potentiated ידי הפרין) וNotch (אנדוגני) איתות מסלולים, כמו גם ROCK-עיכוב על ידי Y-27632: בהעדר הגורמים אלה, אין או מאוד מספר מוגבל של organoids והתחומים נוצרו 28. הדרישה לFGF ולאפעילות פרק בקלות הבינה מבוססת על חשיבותם לפיתוח לבלב in vivo 28. מעכב ROCK ניתן להחליף על ידי blebbistatin, ובכך חושף היפר שדינמיקת microfilament על דיסוציאציה מובילה לשניהם מוות המוגבר של התאים, עיכוב חזק של Pdx1 גורם שעתוק אב ומחסור בהרחבה. מעניין לציין, שרבי מרכיבים נוספים של מדיום organoid הוכחו להיות בנפרד מיותר, אבל היעדר שילובם הביא להפסד של אפיתל הסתעפות 28. בנוסף לרכיבים חיוניים מסוימים של המדיום, חשוב לשלוט ברמה של דיסוציאציה של אבות. ואכן, ריבוי אב ותחזוקת Pdx1 מקודמים באופן משמעותי בקבוצות של יותר מ 4 תאים. דחיסה ניתן להבחין בתוך שעה הראשונה 12 וכישלון לתוצאות קומפקטיות בכישלון לשמור על Pdx1 ולהתרחב. מעכב ROCK הוא חיוני לכךתהליך. בorganoids הרגע לא יוצר לאחר FACS מיון, אבל היעילות של המערכת עלולה להיות משופרת על ידי reaggregating מספר מבוקר של תאי אב. עוד מרכיב קריטי של מערכת זו התרבות הוא מטריצת 3D. תאים לשים על Matrigel או בMatrigel הקרוב מדי לתחתית התפשטות הצלחת ולאבד את ביטוי Pdx1. Matrigel סביר להניח שמספק רכיבים ביוכימיים, בעיקר laminin כמו גם רמזים מכאניים 28. ואכן, את הנוקשות של מטריקס משחקת תפקיד מרכזי. הידרוג נוקשה אינו מתירנית לתחזוקת אבות לבלב והרחבה 28 וMatrigel המדולל הוא לא. כאשר Matrigel מדולל 1:10 אב לבלב לא יכול להיות מתורבת. מערכת organoid יכולה לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של מולקולות קטנות וחלבונים רקומביננטיים על אבות לבלב במונחים של הישרדות, התפשטות, התמיינות, קיטוב והסתעפות28. זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את שיתוף הפעולה של סוגי תאים שונים במהלך התפתחות לבלב 28. אנו בטוחים כי הנגישות של תאי לבלב תהיה גם לאפשר מניפולציות גנטיות, כגון מיקוד נגיפי, כפי שניתן לראות במערכות organoid אחרות 17,27. זה יכול לשמש לסינון 17 עם מערכת המאפשרת המורפוגנזה בניגוד לתחומים שתוארו לעיל, כמו גם כאן 16,17,28. תנאי התרבות שפיתחנו גם להציג את היתרון של להיות חופשי בסרום, ונטול mesenchyme וכלי דם ובכך להפחית את המורכבות והסלולריות ביוכימי ללא מזין. עם זאת, קיימת מגבלה ביכולת מעבר organoids ובכך להשיג כמויות גדולות של אבות. זה יכול לעקוף בעתיד על ידי התאמות של הפרוטוקול לשלבים מאוחרים יותר של התפתחות שבו אבות הם שופעים יותר, למקורות של אבות לבלב המופקים מembryonגזע ic (ES) תאים או גזע pluripotent מושרה תאים (iPS). זו סוללת את הדרך למודל 3D של פיתוח לבלב אנושי. מערכת זו יכולה גם עלולה לשמש לייצור של תאי לבלב בפרספקטיבה העתידית של טיפול. בהקשר זה, את הייצור של תאי הבטא תפקודיים להשתלה היה פוטנציאל לסייע בטיפול בסוכרת. ההתאמות של המערכת לES אדם או תאי iPS תהיה חשובות למטרה זו. זה עדיין לא ברור אם יש להשתמש בתנאי organoid או כדור. תנאי organoid יאפשרו הייצור של תאים שיש להם כמה מאפיינים של תאי הבטא בוגרים אבל תפקידם עדיין לא נבדק. עם זאת, תאים אלה הם כיום לא רבים ומעורבבים בין תאים אחרים. כמו כן סביר להניח כי ההופעה המוקדמת של הטרוגניות במערכת organoid מובילה לאיתות בין תאים בלתי מבוקרת ולכן הוא מזיק לייצור. Tהוא מערכת ששומרת על כדור אבות היא בעיקרון עדיפה להרחבה וpassaging מבוקרים של תאי אב אבל הבידול הבא שלהם עדיין לא בשליטה. אחרים לאחרונה הפיקו pancreatospheres שיכול להיות מובחן ביעילות. זה יהיה חשוב כדי להשוות את האופי של הספירות שהושגו בפרוטוקול הנוכחי נטול מתקני האכלה וסרום לתחומים שהושגו עם הפרוטוקולים האחרים 16,17. מנקודת המבט טיפולית, את המורכבות ואת המקור ביולוגי של Matrigel עלולות להוות בעיה של שחזור, בריאות ויכולת רחבה. תוצאות ראשוניות הראו שהידרוג רך פונקציונליות עם laminin הם מתירנית להתרחבות אב לבלב במבחנה. נדרשת אופטימיזציה נוספת כמו ג&#39;לי אלה עדיין אינו יעילים כמו Matrigel 28. הייצור של תאי הביתא בהקשר הטבעי שלהם גם עלול להיות שימושי לתרופות בדיקה שלהגביר בטאפעילות תא, או להגדיל את ההישרדות או התפשטותם, אלא למטרה זו חשוב יהיה קודם כל לבדוק את מידת הבשלות של התאים בטא, כדי להגביר את היעילות של הבידול שלהם וכדי לבדוק אם תנאי התרבות שהוצגו כאן טובים יותר לשמור על איים יותר מזו נוכחית תרבויות השעיה. ייצור הלבלב אקסוקרינית יכול להיות שימושי גם לפיתוח תרופות ליעד סרטן ודלקת לבלב לבלב. כאן, שוב, את מידת הבשלות של התאים אקסוקרינית הופקו צריכה להיחקר ביסודיות.

תרבות איבר מספקת מודל שימושי שמגשר על הפערים בין מורכב, אך רלוונטי מאוד בחקירות vivo וסימולציה הנוחה אבל משוערת של מודלים קו סלולרי. במקרה של הלבלב, אין שורת תאים שווה ערך לחלוטין לאבות לבלב למרות שיש הופכים שורות תאים לדמות תאים האנדוקרינית ואקסוקרינית. כל הלבלב המבוגר לא יכול להיות מתורבת; איונים האנדוקרינית מבודדים יכולים להישמר במשך מספר שבועות ללא התפשטות תאים ויכולים להישמר פרוסות רקמה במבחנה לכמה שעות 5. תרבות לבלב עוברי כבר בשימוש נרחב לא רק ללמוד הפיתוח שלה, אלא גם כדי לחקור אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 4,6,7, לתמונה מעבדת 8 או להתערב באופן כימי עימם 9. שתי שיטות תרבות איבר משמשות בעיקר: הראשון מורכב בculturing ניצני לבלב על צלחות פיברונקטין מצופה 2, שהוא convenient למטרות הדמיה; האפשרות השנייה היא תרבות האיברים במסננים בממשק האוויר הנוזלי 3,4 השומר הכי טוב המורפוגנזה. למרות שמאוד שימושי, שיטות אלה יביאו למידה מסוימת של השטחה; ההתרחבות של אבות היא מוגבלת מאוד בהשוואה להתפתחות התקינה ולאוכלוסייה מתחילה מורכבת הכוללת את כל הסוגים של תאי לבלב ותאי mesenchymal. יכולת התרבות ולהרחיב את התאים ראשוניים מפוזרים היא בעל ערך ללמוד יחסי שושלת ולחשוף את התכונות הפנימיות של סוגי תאים מבודדים 10. סוגיאמה ואח&#39; 11. יכול לשמור על אבות לבלב ואת אבות האנדוקרינית שמרה על כמה דמויות פונקציונליות ל3-5 ימים בתרבות בשכבות מזין. Pancreatospheres, בדומה לneurospheres 12 וmammospheres 13, הורחב מאיונים למבוגרים ותאי ductal למרות שטבעו של האבות / תאי גזעשיוצרים תחומים אלה אינו ברור. בנוסף, בניגוד להתפתחות פיזיולוגית, pancreatospheres הכיל כמה נוירונים 14,15. התחומים גם הופקו לאחרונה מאבות עובריים לבלב 16,17 והתחדשות pancreata 18 עם התרחבות אב טובה והבחנה שלאחר מכן, אך לא הצליחו לשחזר המורפוגנזה. המודלים 3D מהתאים מפוזרים ולעתים קרובות מוגדרים שעצמי לארגן את האיברים מוקטנים פרחו לאחרונה ולדמות את מחזור הפיתוח או מבוגר של איברים מרובים כגון המעי 19,20, הקיבה 21, הכבד 22, הערמונית 23 וקנה הנשימה 24. במקרים מסוימים, המורפוגנזה והתמיינות התפתחותיים כבר סכמו ב3D מתאי גזע עובריים, כמו במקרה של כוסות אופטיות 25, מעי 26 או מוח 27. כאן, אנו describe שיטה להרחיב אבות לבלב multipotent ניתק בפיגום 3D Matrigel בו הם יכולים לבדל ולארגן את עצמו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3148-25ML</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>524400-1MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644-2MG</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4645-RS-025/CF</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;- or -&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C- do not include to increase beta cell production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (Liquemin)</td>
			<td>Drossapharm</td>
			<td></td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 x50 (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater - RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA for reconstitution</td>
			<td>Milipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td>
			<td>For reconstituition of cytokines&#160; - Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141079</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 well MicroWell trays</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0815-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well plates F bottom</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>6555180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas bottom plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal micropittes</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>708745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

אבות לבלב הגבי E10.5 ניתקו וזורעים ב3D Matrigel לסכם פיתוח לבלב. יכולים בקלות להיות בעקבות אבות עם כתבי ניאון. במקרה שלנו השתמשתי בעכבר מהונדס המבטא את חלבון ה-GFP הגרעינית הנשלט על ידי אמרגן Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (סרט 1) בהעדר טמוקסיפן ובכך ללא הפעלת Neurog3 4 (איור 2). עם מדיום organoid, דחיסה ראשונית של אשכולות קטנים של תאים מתרחשת בשעות הראשונות. התרחבות אז יכולה להיות מזוהה על ידי הגדלה של האשכולות ב4 הימים הראשונים (איור 2 א). מיום 5, סניפים להיווצר בorganoids הגדול 20%. תאים בודדים לא להרחיב ולאבד את ביטוי Pdx1 אילו האשכולות הגדולים לשמר ביטוי Pdx1 28. בתנאים אלה, אבות עוברים מפרטהמורפוגנזה tacular עם הופעתה של מבני אפיתל מסועפים. תהליך זה מתרחש רק כאשר האבות הם זורעים ב≥ אשכולות 4 תאים, מה שמעיד על דרישה חזקה לאותות קהילה. ניתוח היסטולוגית מגלה כי לאחר יום 7 בתרבות, מיני איברים וכתוצאה מכך מורכבים של אבות לבלב (SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + תאים: איור 3 ב) ותאים מובחנים להביע או אקסוקרינית (עמילאז +) או האנדוקרינית (או אינסולין + סמני גלוקגון +) (איור 3 א, ג). הבידול לתאים האנדוקרינית הוא נמוך יותר מאשר בלבלב אנדוגני (סביב 0.1%) אך עלה ל -1% כאשר FGF1 לא הוסיפה למדיום התרבות 28. למרבה הפלא, לא רק שאבות seeded להתמיין שושלות לבלב הצפויות, אבל הם גם באופן ספונטני לאמץ את ארכיטקטורת הלבלב הנורמלית. למרות E10.5 אבות לבלב multipotent אינם מקוטבים, התאים בתרבית לקטב כפי שהודגמו על ידי הפרדה של Mucin1 וaPKC בקרום מול לומן המרכזי והם מארגנים לרשת צינורי קנים. תחומים &quot;קצה ותא מטען&quot; Regionalized לצוץ: HNF1B אבות + ותאים האנדוקרינית הם מקומיים באזור המרכז, ואילו תאי acinar ממוקמים בפריפריה ככתר חלקי או מלא של תאים. יכול להישמר organoids בתרבות ל10 ימים; לאחר תקופה זו, הם בדרך כלל להפסיד הארגון הארכיטקטוני שלהם ולהפוך לפיברוזיס (לא מוצג). Passaging יכול להיעשות לאחר ניתוק חלקי אבל במהירות מובילה להיווצרות ציסטה, תופעה שהוא מופחת על ידי התוספת של BMP מעכב Noggin 28. עם מדיום הכדור, התרחבות היא תכופה יותר והוא ראה מ 2% של תאים בודדים; אף על פי כן את היעילות של היווצרות כדור בקורלציה עם הגודל של seedeאשכולות ד 28. ביום 2/3, לומן הוא זוהה בקבוצות קטנות ומתרחב לאחר מכן, מה שמוביל למידה רבה תחומים חלולים מונו שכבתיים עם אזורים מזדמנים מקומיים רב שכבתיים (איור 2). תחומים אלה יקרסו כאשר נאספו מMatrigel (איור 3D-H). בתנאים אלה, וכתוצאה מכך המבנים מורכבים בעיקר מאבות לבלב, עם אחוז קטן של תאים אקסוקרינית ואנדוקריניות מובחנים ביום 7 (איור 3D-H). אבות בתחומי גם להיות apically מקוטבים, כפי שהודגמו על ידי הפרדה של aPKC בקרום מול לומן של כל התאים (איור 3F) המרכזי. ניתן passaged Pancreatospheres לפחות פעמיים (לא מוצג). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. ייצוג סכמטי של procedurדואר. דרכי העיכול תחילה גזור מן העובר ולאחר מכן ניצן הלבלב הגבי מבודד. Mesenchyme מוסר ואבות הלבלב הם ניתקו באמצעות טריפסין. לאחר מכן התאים באופן חלקי פיזור וכתוצאה מכך הם זורעים בצפיפות נמוכה בMatrigel מדולדל גורם גדילה. שינוי קנה מידה של ברים:. 1.00 מ&quot;מ פרט לתמונת organoid התוצאה שבו סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51725/51725fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. התקדמות של התרבות לאורך זמן. מקבץ קטן של אבות לבלב גדלו עם מדיום organoid ואחריו עם מיקרוסקופיה זמן לשגות מ3 שעות לאחר ציפוי, ל60 שעה (). בboלוחות ttom, organoid לאחר 7 ימים של התרבות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר; חל על כל הפנלים בא (ב) דוגמא של כדור ואחריו בזמן לשגות 60 שעות ונתפסה ביום 7 של התרבות. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר; חל על כל הפנלים בB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51725/51725fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51725/51725fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. היסטולוגיה. סעיפים סידוריים (AC) של 7 ימים organoid מוכתמים לאב (ב - HNF1B) ובידול סמנים (- אינסולין - עמילאז, C). Organoid מורכב מאפיתל (- E-cadherin) וapically מקוטב (ב - mucin1) תאים. הקו המקווקו מתאים לאזור המרכז אינו acinar (א &#39;), שבותאי HNF1B (ב &#39;) ומערכת האנדוקרינית (C) מזוהים סעיפים (DH) של תחומים 7 ימים מוכתמים עבור אב. (G - HNF1B; H - SOX9) ומערכת האנדוקרינית - סמנים (D אינסולין וגלוקגון). תחומים מורכבים apically מקוטב (D, F - aPKC) אפיתל (ה - E-cadherin) תאים. בר סולם:. 50 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51725/51725fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors at JoVE.com

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Google

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

13.7K Views.  Swiss Institute for Experimental Cancer Research.  שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה. 

Video: In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...