Bu çalışma Det sutable Forskningsråd / Sundhed og Sygdom Bir Genetik Pilot ödülü NCCR Frontiers, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 41-2009-775 ve Grant 12-126875 tarafından sırayla finanse edildi. Yazarlar video çekimi sahipliği için Spagnoli laboratuvar teşekkür ederim.

Bu protokol kemirgen E10.5 türetilen pankreas organoids epitel hücreleri pankreas ayrışmış büyümeyi hedeflemektedir. Protokol hayvan deney için etik kurul onayı gerektirir. E10.5 fare embriyoları Dorsal Pankreas Bud 1. Diseksiyon <ol><li> Bir makas ile karın açmak, embriyonik gün (E) 10.5 aşımına hamile fareler kurban, iki rahim boynuzları çıkarın ve soğuk fosfat tamponu (PBS) veya Dulbeccol ile dolu bir 10 cm Petri kabındaki koyun modifiye temel, orta (DMEM) buz üzerinde tutuldu. Hücre ekimi için kurban gelen toplam deney hücre zarar görmesini önlemek için, 60-90 dakika içinde yapılır. </li><li> Küçük bir makas kullanarak tek tek embriyo bölümler halinde rahim ayırın. Gibi soğuk PBS ile bir 35 mm Petri kabı, bir embriyo transfer ve üstten aydınlatma ile bir mikroskop altında görselleştirmek. Diseksiyon forseps ile çevreleyen kas, desidua ve yumurta sarısı sa kaldırmakc ve embriyo maruz. Lütfen soğuk DMEM ortama embriyo yerleştirin. Embriyolar kolayca 3 ml&#39;lik plastik transferi pipet / damlalık kullanarak transfer edilebilir. Devam etmeden önce benzer bir şekilde, her bir embriyonun izole edin. </li><li> PBS içinde temiz bir 35 mm Petri kabı içine bir embriyo yerleştirin. <ol><li> Ön ayakları kaldırmak için ince forseps (0.05 mm genişlik) kullanın. Yavaşça omurilik bölgesinden sindirim sistemi (Şekil 1) ayırmak için açılış forseps yerleştirin. İSTEĞE BAĞLI: daha rahat, mide görmek aşağı sarısı sap altında kalp ve kuyruk bölgeye, embriyonun üst vücut kaldırmak için. </li><li> Mide, karaciğer ve bağırsak bulun. Forseps kullanılarak, bağırsak mideden mide-bağırsak yolu izole etmek ve (Şekil 1), buz üzerinde, soğuk DMEM içine yerleştirin. Dorsal pankreatik bud mide dorsal, posterior (Şekil 1) takılır. </li><li> Bir simi her bireyin gastrointestinal izoleDevam etmeden önce lar şekilde. Embriyoların genotip gerekiyorsa, diseksiyon zamanda kuyruk toplar ve buz soğuk DMEM ile 24 kuyucuklu bir plaka içerisinde farklı bir kuyu içinde her bir mide-bağırsak yolu tutmak. </li></ol></li><li> Soğuk PBS ile temiz bir 35 mm Petri tabağına yerleştirin, bir mide-bağırsak yolu. Şimdi diseksiyon mikroskop altında dorsal pankreas tomurcuk görselleştirmek ve teşrih parlak alanda aşağıdan aydınlatma kullanın. Bu koşullar hacimlerinin görselleştirme optimize eder. Elektrolitik-bilenmiş tungsten iğne veya 20 G şırınga iğneleri kullanarak, epiteli etrafında mümkün olduğunca az mezenşimin ile pankreas tomurcuğu (Şekil 1) izole. <ol><li> 2-3 dakika boyunca, bir soğuk dispase çözeltisi (1.25 mg / ml) ihtiva eden bir petri çanağı içine izole edilmiş tomurcuk aktarın. Bu noktadan itibaren, transfer en uygun bir ağızdan-kontrol edilen esnek bir boru bağlanmış alev çekilmiş 50 ul bir cam kılcal ile yapılabilir. Alternatif olarak, ancak daha ritomurcuğu kaybetme sk, uygun plastik ipuçları ile 10 ul otomatik pipet (Pipetman) kullanın. </li><li> Mikroskopik kontrol altında pankreas tomurcuk aspirasyon ve fırlamasını gerçekleştirin. Geri PBS içinde pankreas tomurcuk koydu. Bundan başka, cam kılcal (Şekil 1) kullanılarak, iğnelerin ve yumuşak aspirasyon ile mezenşimin gelen izole edilmiş pankreas tomurcuk temizleyin. </li><li> Tüm mezenşimin çıkarıldığında, soğuk PBS içinde pankreatik tomurcuk durulama; (60-iyi mini tepsi soğuk DMEM 10 ul ile dolu) bireysel kuyularda soğuk DMEM&#39;ye her tomurcuk transfer. Bu doku çok yapışkan yapar, dispase yılında mezenşimi kaldırmak için önemli değildir. </li></ol></li></ol> Dağılmış hücreler 2. Kaplama ve Kültür <ol><li> Durulama için 10 ul PBS ile dolu 60-iyi mini kasetlerinden konik kuyuların içine alev-kapiller çekti cam ile tüm embriyolar disseke epitelyaya aktarın. <ol><li> Tripsin% 0.05 a 10 ul transfer tomurcuknd bu 4 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. 10 ul DMEM +% 10 fetal dana serumu (FCS) ile bir kuyuya tomurcuk aktararak tripsin etkisiz hale getirirler. </li><li> Bir pipet çektirmesi ile çekilmiş ince kılcal damar yoluyla aspirasyon ile hücre süspansiyonu ayrışır. Bu hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleme sırasında bu aşamada kabarcıkları önlemek için önemlidir. Pankreas organoids optimum 5-15 hücre küçük gruplar başlar ve bu nedenle kısmi ayrılma (Şekil 1) kullanılması tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Tek tek işleme nedeniyle farklılıkları en aza indirmek amacıyla bir Eppendorf tüpü içine birkaç embriyolarından hücreleri havuzda toplayın. , 1:3 oranında Matrigel soğutulmuş hücre süspansiyonu seyreltin. Kısım 96 oyuklu bir plaka, 8 ul / oyuk veya görüntüleme için optimize edilmiş bir plaka içinde (aşağıya bakınız) için bu karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> Matrigel kalınlaştırmak için izin veren, 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Seçim ortamı 70 ul ile kuyu doldurun (organoid veya küre, sekmesine bakınles 1 ve 2) ve 37 ° C de% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemlendirilmiş bir ortamda bırakmak </li><li> Her 4. günde orta yerine. Günlük büyüyen pankreas koloniler izlemek ve görüntüleme işlemini belgelemek. </li><li> Daha önce rapor edildiği gibi, 28 çıkar küçük moleküller ya da proteinler, girişim deneyleri için bu aşamada ortamına ilave edilebilir. </li></ol> Tablo 1: organoid ortamı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Son ortam içinde konsantre </td><td> Stokunun hacmi </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> % 100 </td><td> % 1 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Nakavt Serum değiştirme (ek) </td><td> % 100 </td><td> % 10. </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 14.3 M </td&gt; <td> 0.1 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Forbol Miristat Asetat (PMA) </td><td> 16 iM </td><td> 16 nM </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK inhibitörü) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 ug / ml </td><td> 25 ng / ml </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan 1 R-spondin </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> - Ya da - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant Fare R-1 spondin </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan FGF1 (aFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 25 ug / ml </td><td> 1.25 ul </td></tr><tr><td> Heparin (Liquemin) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2.5 U / ml </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Recombinant İnsan FGF10 </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 ul </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Küre ortamı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Son ortam içinde konsantre </td><td> Stokunun hacmi </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> % 100 </td><td> % 1 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> B27 x50 (ek) </td><td> % 100 </td><td> % 10. </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan FGF2 (bFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 64 ng / ml </td><td> 3.2 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK inhibitörü) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845,8 ul </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> Organoid Geliştirme İlerlemesi 3. Görüntüleme <ol><li> Görüntü organoids günlük veya zaman atlamalı mikroskopi bir floresan time-lapse mikroskop kullanılarak. Zaman atlamalı görüntüleme için, bir XY (Z) otomatik ters floresan mikroskop kullanın. </li><li> 4-çukurlu plakalara veya 2-5 ml ortam ile doldurulmuş olan cam-tabanlı plakalar içerisinde 3 ul&#39;lik Deposit küçük damlacıklar halinde. 10x uzun mesafe hedefi ile görüntü. Not: floresan izleyiciler ifade eden transjenik farenin kullanılabilir. Örneğin Movie 1 gösterileri Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP + farelerden 4 organoids ilk genişleme. Nükleer GFP tek nesneleri ancak benzer ilkeler zar floresan ile hücreleri izlemek için uygulanabilir olarak hücreleri izlemek için sağlar bumT / mG fareler 29 gibi. </li><li> Odak sürükleniyor önlemek ve elle tanımlanmış pozisyonlarda 3 veya daha fazla gün için 1 resim / saat almak için yazılım kontrol otomasyon ayarlamak için tohum hücreleri sonra time-lapse görüntüleme 3 saat başlayın. Her bir konumu için, floresan markör ifade raporlama, diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntü hem de GFP sinyali elde. </li></ol> Histoloji için Organoids 4. Recovery <ol><li> Buz üzerinde 96 oyuklu plaka koyun ve buz gibi soğuk PBS ile değiştirilmesi, orta çıkarın. Bu kısmen Matrigel depolimerize. </li><li> Yavaşça genel yapısını bozmayacak amacıyla 1.000 ul ucu kullanarak çevredeki Matrigel kaldırarak, her organoid aspire. Buz gibi soğuk PBS ile bir kuyuya her organoid aktarın. Buz üzerinde plaka tutun. Matrigel Doğrudan tespit de mümkündür. </li><li> ,% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde 15 dakika boyunca organoid saptamak sukroz içinde dondurularak saklanabilmesi ve jelatin içine gömmek. Her Süreçorganoid önce (Johansson et al., 2007) tarif edildiği gibi 4 cryosectioning ve histoloji için. </li></ol> PCR ve Biyokimya Organoids 5. Recovery <ol><li> Buz üzerinde 96 oyuklu plaka yerleştirin ve orta çıkarın. Hücresel RNA stabilize etmek ve korumak için oyuk başına RNAlater 60 ul ekle. </li><li> Kısmen buz üzerinde depolymerizing her iyi mekanik olarak jel bozar. Genel yapısını bozabilir veya 200 ul ucu ile mekanik jel bozarak (Matrigel ile) tüm iyileşmez için 1.000 ul uç kullanarak bireysel organoids kurtarmak ya. Bir RNAse serbest olmayan yapışkan Eppendorf tüpüne da içerik aktarmak için 1.000 ul ucu kullanın buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> 60 ul RNAlater ile kuyu yıkayın ve aynı Eppendorf tüpüne kalan içerik eklemek. </li><li> 4 ° C &#39;de 500-1000 x g&#39;de 5 dakika boyunca tüpleri Spin </li><li> Sadece 20-30 ul bırakarak, süpernatant kaldırmakbirlikte pelet ile tüp içinde RNAlater. Biyokimya için, mümkün olduğu kadar kuru numune saklayın. </li><li> Hemen RNAlater örnekleri dondurma etmeyin; 4 ° CO / N de mağaza (RNAlater iyice dokuya nüfuz sağlamak için). Doku, uzun süreli depolama için -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir ve daha sonra, doku bozulması ve RNA küçük miktarlarda çıkarılması için işlenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+functional+beta-cell.">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li><li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme.">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li><li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types.">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li><li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells.">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development.">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979 (2012).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+interrogation+of+stem+cells.">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li><li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS.">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation.">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In vitro fonksiyonel beta hücrelerinin büyük ölçekli üretim hala 1 etkisizdir. Bu zorlu bağlamda, gelişim biyolojisi çalışma fonksiyonel beta hücrelerinin farklılaşması için gerekli olan tam sinyalleri deşifre yardımcı olabilir. Bu protokol, in vitro embriyo pankreas progenitörlerin bakım, genişleme ve farklılaşması için izin verir. Bu, diğer endokrin hormon eş bildirilmemektedir insülin üreten beta hücrelerinin oluşumunu içeren, Pdx1 yüksek düzeyde, insül...

Organ kültür vivo araştırmalarda karmaşık ama son derece alakalı arasındaki boşlukları ve hücre çizgi modellerin uygun ama yaklaşık simülasyon köprü kullanışlı bir model sağlar. Pankreas durumunda, endokrin ve ekzokrin hücreleri taklit hücre çizgileri bulunmaktadır transforme edilir, ancak pankreas progenitörlerin mükemmel eşdeğer herhangi bir hücre hattı yoktur. Yetişkin Bütün pankreas kültüre olamaz; izole edilmiş endokrin adacık hücresi çoğalması olmadan birkaç hafta muhafaza edilebilir ve doku dilimleri birkaç saat 5 için in vitro olarak tutulabilir. Embriyonik pankreas kültürü yaygın gelişimini incelemek için sadece kullanılır olmuştur, ama aynı zamanda 8 işler görüntüye, epitelyal-mezenkimal etkileşimleri 4,6,7 araştırmak veya kimyasal onlarla 9 ile müdahale. İki organ kültürü yöntemleri ağırlıklı olarak kullanılır: İlk conve fibronektin kaplı plakalar 2, üzerinde pankreas tomurcukları kültürleme oluşurGörüntüleme amacıyla nient; İkinci seçenek kültürüne en morfogenetiğine korur hava-sıvı arayüzü 3,4 de filtrelerde organ olduğunu. Çok faydalı olmasına rağmen, bu yöntemler, düzleşme belli bir dereceye kadar yol; normal gelişimi ile karşılaştırıldığında ve başlangıç ​​popülasyonu pankreas hücreleri ve mezenkimal hücreler her türlü içeren karmaşık olduğu gibi progenitörlerin genişleme çok sınırlıdır. Kültür yeteneği ve dağınık birincil hücreleri genişletmek soy ilişkileri incelemek ve izole hücre tiplerinin 10 içsel özelliklerini ortaya çıkarmak için değerlidir. Sugiyama ve ark. 11. pankreas atalarıdır ve besleyici katmanlar kültürde 3-5 gündür bazı fonksiyonel karakterleri korunur endokrin atalarıdır korumak olabilir. Atalarıdır doğası / kök hücrelerin rağmen neurospheres 12 ve 13 mammospheres benzer Pancreatospheres, yetişkin adacık ve duktal hücrelerinden genişletilmiştirBu küreler oluşturmak olduğu açık değildir. Buna ek olarak, fizyolojik gelişimi ile aksine, bazı pancreatospheres nöronlar 14,15 ihtiva etmiştir. Küreler yakın zamanda embriyonik pankreas atalarıdır 16,17 ve iyi progenitör genişleme ve sonraki farklılaşma ile pankreata 18 yenileyici üretilir ama morfogenetiğine özetlemek başarısız olduğu görülmüştür. Minyatür organları içine kendi kendini düzenleyebilir ve genellikle dağınık tanımlanan hücrelerden 3 boyutlu modeller son gelişti ve bu bağırsak 19,20, 21, mide, karaciğer 22, prostat 23 ve nefes borusu gibi birden fazla organların gelişimi veya yetişkin devir taklit adres 24. Optik bardak 25, 26 ya da bağırsak, beyin 27 olduğu gibi, bazı durumlarda, gelişme morfolojisi ve farklılaşması, ES hücrelerinden in 3D değinmeyecek edilmiştir. Burada, biz desOnlar farklılaştırmak ve öz-örgütlenmeyi bir 3D Matrigel iskele ayrışmış multipotent pankreas atalarıdır genişletmek için bir yöntem cribe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3148-25ML</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>524400-1MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644-2MG</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4645-RS-025/CF</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;- or -&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C- do not include to increase beta cell production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (Liquemin)</td>
			<td>Drossapharm</td>
			<td></td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 x50 (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater - RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA for reconstitution</td>
			<td>Milipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td>
			<td>For reconstituition of cytokines&#160; - Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141079</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 well MicroWell trays</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0815-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well plates F bottom</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>6555180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas bottom plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal micropittes</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>708745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

3D Matrigel&#39;de ayrışmış ve seribaşı E10.5 dorsal pankreas atalarıdır pankreas gelişimini özetlemek. Atalarıdır en kolay floresan gazetecilere takip edilebilir. Bizim durumumuzda (Şekil 2) Neurog3 4 etkinleştirmeden tamoksifen yokluğunda ve böylece Pdx1 promoteri (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Film 1) tarafından kontrol edilen bir nükleer GFP proteini eksprese eden transgenik bir fare kullanılmıştır. Organoid orta ile...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors at JoVE.com

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

13.7K Görüntüleme.  Swiss Institute for Experimental Cancer Research.  Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir. 