Este trabalho foi financiado por uma seqüência Fronteiras NCCR em Genética prêmio piloto, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 e Grant 12-126875 de Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Os autores agradecem o laboratório Spagnoli por sediar a gravação de vídeo.

Este protocolo destina-se a crescer organoids pancreáticas derivados de E10.5 de murino dissociadas células pancreáticas epiteliais. O protocolo exige aprovação ética para experimentação animal. 1. Dissecção da Dorsal pâncreas Bud de E10.5 embriões de camundongos <ol><li> Sacrifício camundongos cronometrado grávidas no dia embrionário (E) 10,5, abrir o abdômen com uma tesoura, retire os dois cornos uterinos e coloque-os em um prato de 10 centímetros de Petri cheia de fosfato frio salina tampão (PBS) ou Dulbecco modificado meio essencial (DMEM) conservados em gelo. O experimento total a partir do sacrifício a semeadura de células é feito em 60-90 min para evitar danos nas células. </li><li> Separe o útero em segmentos de embriões individuais usando uma tesoura pequena. Transferência de um embrião para um prato de 35 milímetros Petri com PBS frio e visualizá-lo sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Com uma pinça de dissecção remover o músculo, decídua e gema em torno sac e expor o embrião. Coloque o embrião de volta para o meio de DMEM frio. Os embriões podem ser facilmente transferidas usando um 3 ml de transferência de pipeta de plástico / conta-gotas. Isolar cada embrião indivíduo de uma forma semelhante, antes de continuar. </li><li> Coloque um embrião em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri em PBS. <ol><li> Use uma pinça fina (largura 0,05 mm) para remover o membro anterior. Suavemente inserir a pinça na abertura para retirar o tracto digestivo da região da medula espinhal (Figura 1). Opcional: Para ver mais convenientemente o estômago, remover a parte superior do corpo do embrião, para baixo para o coração e a região da cauda a seguir a haste de gema. </li><li> Localize o estômago, fígado e intestino. Usando fórceps, isolar o tracto gastrointestinal a partir do estômago para o intestino e colocá-lo em DMEM frio em gelo (Figura 1). O botão de pâncreas dorsal está ligado dorsalmente, posterior ao estômago (Figura 1). </li><li> Isolar cada trato gastrointestinal individual em um similar forma antes de continuar. Se os embriões precisam ser genotipados, recolher a cauda no momento do esvaziamento e manter cada tracto gastrointestinal num indivíduo bem diferente em uma placa de 24 poços com DMEM frio em gelo. </li></ol></li><li> Coloque um trato gastrointestinal em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri em PBS frio. Agora use iluminação abaixo em campo claro de visualizar e dissecar o dorsal gemas pancreático sob o microscópio de dissecação. Estas condições irão optimizar a visualização de volumes. Usando agulhas de tungstênio eletroliticamente-afiadas ou 20 g de agulhas de seringa, isolar o broto pancreático com tão pouco quanto possível mesenchyme ao redor do epitélio (Figura 1). <ol><li> Transferir o botão isolado em uma placa de Petri contendo uma solução fria de dispase (1,25 mg / ml) durante 2-3 min. A partir deste ponto, a transferência pode ser realizada mais convenientemente com capilares de vidro de 50 mL puxou-chamas ligados a um tubo flexível controlada aftosa. Em alternativa, mas com mais risk de perder pela raiz, use a 10 mL pipeta automática (Pipetman) com pontas de plástico apropriados. </li><li> Realize bud aspiração e ejeção de pâncreas sob controle microscópico. Coloque o broto pancreático volta em PBS. Além disso limpar a gema de pâncreas isolado do mesênquima com as agulhas e aspiração suave usando o capilar de vidro (Figura 1). </li><li> Quando todo o mesênquima é removido, lave o broto pancreático em PBS frio; transferir cada broto de DMEM frio em poços individuais (60 poços mini-bandejas cheias com 10 ml de DMEM frio). É importante não remover o mesênquima em dispase, o que torna o tecido muito pegajosa. </li></ol></li></ol> 2. Chapeamento e Cultura de células dispersas <ol><li> Transfira o epitélio dissecado de todos os embriões com um capilar de vidro, puxado-chama em poços cônicos de 60 poços mini-bandejas cheias de 10 mL PBS para enxaguar. <ol><li> Transferir o botão em 10 ul de tripsina a 0,05% de umnd deixe incubar a 37 ° C durante 4 min. Inactivar a tripsina pela transferência do broto para um poço com 10 mL de DMEM + 10% soro fetal bovino (FCS). </li><li> Dissociar a suspensão de células por aspiração através de um capilar fino puxado com um puxador de pipeta. É importante evitar bolhas nesta fase, enquanto pipetando para cima e para baixo para dissociar as células. Organoids Pâncreas optimamente começar a partir de pequenos grupos de 5-15 células e, portanto, a dissociação parcial é recomendada (Figura 1). </li></ol></li><li> Reunir as células de vários embriões para um tubo Eppendorf, a fim de minimizar as diferenças devidas ao processamento individual. Dilui-se a suspensão de células em Matrigel refrigerados a uma razão de 1:3. Aliquota desta mistura para uma placa de 96 poços, 8 ul / poço ou numa placa optimizado para imagiologia (ver abaixo). </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 5 minutos, permitindo que o Matrigel para engrossar. Preencha os poços com 70 mL de meio de escolha (organóides ou esfera, consulte Tables 1 e 2) e deixar em um ambiente humidificado contendo 5% de CO 2 e 95% de ar a 37 ° C. </li><li> Substituir o meio de cada 4 º dia. Monitorar as crescentes colônias pancreáticas diário e documentar o processo de geração de imagens. </li><li> As moléculas pequenas ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao meio, nesta fase, para as experiências de interferência, como relatado anteriormente 28. </li></ol> Tabela 1: médio organóides. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome de Materiais </td><td> Banco de Concentração </td><td> Concentração na mídia final </td><td> Volume de estoque </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> KnockOut substituição Serum (suplemento) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> 14,3 M </td&gt; <td> 0,1 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Phorbol Myristate acetato (PMA) </td><td> 16 uM </td><td> 16 nM </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (inibidor ROCK) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 ng / mL </td><td> 25 ng / mL </td><td> 2,5 mL </td></tr><tr><td> Recombinante Humana R-espondina 1 </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> - Ou - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Recombinante do rato R-espondina 1 </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / mL </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Recombinante FGF1 humano (aFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 25 ng / mL </td><td> 1,25 mL </td></tr><tr><td> A heparina (Liquemine) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2,5 U / mL </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RecomFGF10 Humano binant </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / mL </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 mL </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td></td><td> 5000 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2: médio Sphere. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome de Materiais </td><td> Banco de Concentração </td><td> Concentração na mídia final </td><td> Volume de estoque </td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> 100% </td><td> 1% </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> B27 x50 (suplemento) </td><td> 100% </td><td> 10% </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Recombinante FGF2 humano (bFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 64 ng / mL </td><td> 3,2 mL </td></tr><tr><td> Y-27632 (inibidor ROCK) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845,8 mL </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td></td><td> 5000 mL </td></tr></tbody></table> 3. Imagem da Progressão de Desenvolvimento organoide <ol><li> Imagem organoids quer diárias ou por microscopia de lapso de tempo usando um microscópio fluorescente time-lapse. Por lapso de tempo de imagem, use um XY (Z) microscópio de fluorescência invertido automatizado. </li><li> Depósito pequenas gotículas de 3 mL em placas de 4 poços ou placas com fundo de vidro preenchidos com 2-5 ml médio. Imagem com um objetivo de longa distância 10x. Nota: Os ratinhos transgénicos que expressam marcadores fluorescentes podem ser usados. Filme 1 mostra, por exemplo, a expansão inicial de organoids de Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP + camundongos 4. A GFP nuclear permite ao utilizador controlar as células como objectos individuais, mas os mesmos princípios podem ser aplicados para controlar as células com fluorescência de membrana taiscomo MT / MG camundongos 29. </li><li> Comece lapso de tempo de imagem de 3 horas após a semeadura das células a fim de evitar desvios de foco e definir a automação controlar software para tirar uma foto / h por 3 ou mais dias, em posições definidas manualmente. Para cada posição, adquirir uma interferência diferencial contraste da imagem (DIC) bem como o sinal de GFP, a expressão do marcador fluorescente relatórios. </li></ol> 4. Recuperação de Organóides para Histologia <ol><li> Colocar a placa de 96 poços sobre gelo e remover o meio, substitui-lo com PBS gelado. Este despolimeriza parcialmente Matrigel. </li><li> Gentilmente aspirar cada organoide individual, removendo o Matrigel circundante usando uma ponta 1.000 mL, a fim de não perturbar a arquitetura geral. Transferir cada organóide para um poço com PBS gelado. Manter a placa de gelo. Fixação direta em Matrigel também é possível. </li><li> Fixe o organoide por 15 min em 4% paraformaldeído (PFA), criopreservar-lo em sacarose e incorporá-lo em gelatina. Processar cadaorganóide para cryosectioning e histologia, como descrito anteriormente (Johansson et al., 2007) 4. </li></ol> 5. Recuperação de Organóides por PCR e Bioquímica <ol><li> Colocar a placa de 96 poços sobre gelo e remover o meio. Adicionar 60 ul de RNAlater por poço, de modo a estabilizar e proteger o ARN celular. </li><li> Interromper o gel em cada poço mecanicamente por despolimerização que parcialmente em gelo. Ou recuperar organoids individuais usando uma ponta de 1.000 mL, a fim de não perturbar a arquitetura global ou recuperar todo o bem (com Matrigel) por perturbar o gel mecanicamente com um mL ponta 200. Utilizar uma ponta 1000 ul de transferir o conteúdo do poço para um tubo Eppendorf livre de não-pegajoso RNAse mantido em gelo. </li><li> Lavar os poços com 60 ul RNAlater e adicionar o restante conteúdo para o mesmo tubo de Eppendorf. </li><li> Girar os tubos durante 5 min a 500-1000 x g a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante, deixando apenas 20-30 mLde RNAlater no tubo juntamente com o pellet. Para bioquímica, armazenar as amostras o mais seco possível. </li><li> Não congelar amostras em RNAlater imediatamente; armazenar a 4 ° CO / N (para permitir RNAlater para penetrar profundamente no tecido). O tecido pode ser armazenada a -20 ° C para armazenamento a longo prazo e pode ser posteriormente processado para a ruptura de tecido e a extracção de pequenas quantidades de ARN. </li></ol>

<ol>
	<li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+functional+beta-cell.">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li><li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme.">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li><li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types.">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li><li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells.">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development.">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979 (2012).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+interrogation+of+stem+cells.">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li><li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS.">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li><li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin.">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li><li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine/acinar+colonies+in+laminin+hydrogel.">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li><li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation.">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A produção em grande escala de células beta funcionais in vitro ainda é ineficaz 1. Neste contexto desafiador, estudos de biologia do desenvolvimento pode ajudar a decifrar os sinais exatos que são necessários para a diferenciação das células beta funcionais. Este protocolo permite a manutenção, expansão e diferenciação de células progenitoras pancreáticas embrionárias in vitro. Isso inclui a formação de células beta produtoras de insulina que não co-expressar outros hor...

Cultura órgão fornece um modelo útil que preenche as lacunas entre o complexo, mas altamente relevante em investigações in vivo ea simulação conveniente, mas aproximado de modelos da linha celular. No caso do pâncreas, não existe uma linha de células perfeitamente equivalente a progenitores pâncreas embora existam linhas de células transformadas que simulam células endócrinas e exócrinas. Todo o pâncreas adulto não podem ser cultivadas; ilhotas isoladas endócrinos pode ser mantida durante algumas semanas, sem proliferação celular e fatias de tecidos podem ser mantidos in vitro durante 5 horas. Cultura pâncreas embrionário tem sido amplamente utilizado, não só para estudar o seu desenvolvimento, mas também para investigar interacções epiteliais mesenquimais 4,6,7, a imagem processa 8 ou para interferir quimicamente com eles 9. Dois métodos de cultura de órgãos são usados ​​principalmente: a primeira consiste na cultura de gomos pancreáticas em placas revestidas com fibronectina 2, que é convenient para fins de imagem; a segunda opção é a cultura dos órgãos de filtros na interface ar-líquido 3,4 que melhor preserva a morfogênese. Apesar de muito úteis, estes métodos levam a um certo grau de achatamento; a expansão de células progenitoras é muito limitado em comparação com o normal desenvolvimento e a população de partida é complexo que compreende todos os tipos de células pancreáticas e células mesenquimais. A capacidade de cultura e expandir células primárias dispersas é valioso para estudar relações de linhagem e descobrir as propriedades intrínsecas dos tipos de células isoladas 10. Sugiyama et al. 11 poderia manter progenitores pâncreas e progenitores endócrinas que retiveram alguns personagens funcionais por 3-5 dias em cultura em camadas alimentadoras. Pancreatospheres, semelhante ao neurospheres 12 e mammospheres 13, foram ampliados a partir de ilhotas adultas e células ductais embora a natureza dos progenitores / células-troncoque geram essas esferas não é clara. Além disso, em contraste com o desenvolvimento fisiológico, os pancreatospheres continha alguns neurónios 14,15. Spheres também foram recentemente produzidos a partir de células progenitoras embrionárias pâncreas 16,17 e regenerar pancreata 18 com boa expansão e diferenciação de células progenitoras subseqüente, mas não conseguiu recapitular morfogênese. Modelos 3D a partir de células dispersas e, muitas vezes definidos que se auto-organizam em órgãos miniaturizados recentemente floresceu e simular desenvolvimento ou adulto o volume de negócios de vários órgãos, como o intestino 19,20, o estômago 21, o fígado 22, a próstata 23 e traquéia 24. Em alguns casos, a morfogénese e diferenciação de desenvolvimento foram recapitulado em 3D a partir de células ES, como é o caso dos copos óptica 25, 26 do intestino ou do cérebro 27. Aqui, desCribe um método para expandir progenitores multipotentes pancreáticas dissociadas em um andaime Matrigel 3D onde podem diferenciar e se auto-organizar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum replacement (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3148-25ML</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>524400-1MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644-2MG</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4645-RS-025/CF</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;- or -&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF1 (aFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C- do not include to increase beta cell production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (Liquemin)</td>
			<td>Drossapharm</td>
			<td></td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 x50 (supplement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF2 (bFGF)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>Stock keept at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>ab120129</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Stock keept at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater - RNA stabilizing reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76104</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4818-2MG</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA for reconstitution</td>
			<td>Milipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td>
			<td>For reconstituition of cytokines&#160; - Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141079</td>
			<td>Stock keept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 well MicroWell trays</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0815-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95-well plates F bottom</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>6555180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glas bottom plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal micropittes</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>708745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

E10.5 dorsais progenitores pancreáticas dissociadas e semeadas em Matrigel 3D recapitular desenvolvimento pâncreas. Progenitores pode ser mais fácil de ser seguido com repórteres fluorescentes. No nosso caso, usamos um camundongo transgênico que expressa uma proteína GFP nuclear controlada por Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Filme 1), na ausência de tamoxifeno e, portanto, sem ativar Neurog3 4 (Figura 2). Com o meio de org...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors at JoVE.com

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

13.7K visualizações.  Swiss Institute for Experimental Cancer Research.  O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho. 