وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسانتيه آخرون ميديكال للبحوث، والمركز الوطني للبحوث العلمية، وجامعة دي ستراسبورغ، دخلت المستشفى دي ستراسبورغ، وجمعية صب لا SUR LE بحوث السرطان، والمعهد الوطني للسرطان، الوكالة الوطنية للبحوث ومنطقة الألزاس. وقد تم دعم بيترو انيف من قبل مؤسسة بحوث صب لا ميديكال. حاليا، فهو حاصل على الزمالة ISTITUTO ايطالي TECNOLOGIA (IIT). معتمدة تكاليف النشر من قبل الشبكة Neurex (TriNeuron - برنامج INTERREG الرابع الراين العليا)

مجموعة 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 فصل خلايا شبه ملتصقة شنايدر، (1-5 × 10 6 خلايا في المتوسط)، من قبل pipetting وحصادها بواسطة الطرد المركزي (100 x ج لمدة 1 دقيقة). في حالة في المختبر الخلايا الملتصقة مثقف، يعرض للتريبسين لهم في الظروف القياسية أو جمعها مباشرة من لوحات إلى كمية ملائمة من الحمض النووي الريبي استخراج كاشف، من خلال مساعدة من مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الجنين، وتنمو سلالات ذبابة الفاكهة في أقفاص الطيران والسماح الأجنة تتراكم على وضع البيض لوحات. مسح الأجنة من قبل الفرشاة في الماء المقطر (DH 2 O)، ونبذ الحطام تصفية غربال، وشطف واستعادة الأجنة في قارورة 48. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتقنية بديلة، تشريح الأنسجة / الأجهزة يدويا. عزل الخصيتين (نظام تفضيلي لتحليل بيرنا) من ذبابة الفاكهة البطن في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحت stereomicroscope (20X التكبير)، وذلك باستخدام الإبر أو ملقط تشريح وفيماualized في سوليفان وآخرون 49. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مدقة التجانس عينات بناء على الإدمان من 0.5 حجم استخراج الحمض النووي الريبي كاشف. </li></ol> 2. استخراج الحمض النووي الريبي / تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعليمات التالية الصانعين أداء عزل الحمض النووي الريبي من خلال الكواشف التجارية. تنبيه! كلاء استخراج الحمض النووي الريبي وعادة ما تكون سامة وكاوية. بدلا من ذلك، وتطبيق البروتوكول استنادا K-بروتين لRNA العزلة 50، على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع العينات في 400 ميكرولتر من وقف ميكس واحتضان في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة مكونات ذواب بالماء بواسطة الفينول القياسية: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي الاستخراج والكلوروفورم والإيثانول (ETOH) هطول / الغسيل. الهواء الجاف العينات و resuspend في diethylpyrocarbonate (DEPC) المعالجة بالإثير المقطر المزدوج (دد) H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق الأشعة فوق البنفسجية القياس الطيفي. أيضا ضمان نقاء RNA عالية، على مقربة من 2.0 والسفلىإد على و260/280 قراءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من إعداد RNA على تغيير طبيعة هلام الاغاروز على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كوب نظيف، حل 1.2 غرام من الاغاروز في 82 مل من DEPC-DDH 2 O، مع التحريك المستمر. تغلي حتى يذوب تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل هلام ليبرد. عندما تصل درجة الحرارة 60 درجة مئوية إضافة 10 مل من حمض 10X 4 morpholinepropanesulfonic (اجتماعات الأطراف) عازلة ل1X التركيز النهائي (FC)، و 8 مل من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ إلى 3٪ FC. تنبيه! الفورمالديهايد هو مادة مسرطنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب جل في خلية الكهربائي الأفقية. السماح للهلام ليصلب تحت غطاء محرك السيارة لا يقل عن 1 ساعة. بعد التصلب، غمر جل في اجتماعات الأطراف 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 2 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي و 1 ميكروغرام من سلم (استخدام علامة RNA عند المرجوة تقييم دقيق). إضافة 3 مجلدات من الاغاروز صبغ تحميل (ALD) إلى RNA وسلم. الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبارد فورا على الجليد. CAUTION! محتويات ALD (بروميد إيثيديوم والفورماميد، انظر المواد) هي المغير وتآكل، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينات وتشغيل هلام في 50 فولت لمدة 1 ساعة مع إعادة التدوير عازلة في بعض الأحيان. التحقق من نمط RNA التجزئة التي تصور الأشعة فوق البنفسجية هلام أو التصوير. الاعتراف العصابات المنفصلة الموافق 28S 18S وrRNAs وtRNAs (انظر الشكل 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما إلى شمال الفحص أو متجر RNA في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. تغيير طبيعة الأكريلاميد إعداد جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام جهاز صغير الرأسي الكهربي لهذه الخطوة التجزئة (حجم اللوحة حوالي 8 سم × 9 سم، وسمك المشط 0.75 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع النظارات نظيفة معا في إطار الصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل من 10٪ مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد (19: 1) حل في اجتماعات الأطراف 1X، 7 M اليوريا. مباشرة قبل صب، إضافة 100 ميكرولتر من بيرسلفات الأمونيوم 10٪ و 10 ميكرولتر من TEMED وتخلط بسرعة الحل. تنبيهالأكريلاميد! هو أعصاب ومسرطنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب جل بين لوحات الزجاج وإدراج مشط جيدا بعناية لتجنب الفقاعات. السماح للهلام تتبلمر في RT لمدة 45 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بدلا من ذلك، تخزين هلام O / N، ملفوفة في أوراق الترشيح غارقة في المياه ومختومة في التفاف ساران. </li></ol> إعداد 4. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 0،5 حتي 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لكل عينة. إذا تجاوز حجم 3-4 ميكرولتر، فراغ تجف العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد حجم، تشغيل قسامة (20-30 من القانون الجنائي) من رديولبلد انخفاض المدى سلم بالتوازي مع العينات، كعلامة (انظر القسم 4.3 و 4.4 لإعداد). التعامل معها بالتوازي مع العينات، كما هو موضح في الخطوة 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلم: إعداد رد الفعل إلى الأمام الفوسفات باستخدام 0.1 ميكروغرام من 10 نقطة أساس في خطوة وسلم. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ووقف رد الفعل بإضافة حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) إلى 20 ملي FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية بواسطة ETOH هطول / الغسيل، والهواء الجاف وResuspend في DDH 2 O (حوالي 100 ميكرولتر). تنبيه! 32 P هي مصدر المشع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة إضافة حجم مساو من صبغة زرقاء الأكريلاميد (ABD). تفسد عن طريق التسخين عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبارد على الجليد حتى تحميل. تنبيه! الفورماميد (المحتوى في ABD) هو تآكل. </li></ol> 5. الكهربي تجزئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات الزجاج من الدعم الصب وبشكل صحيح تجميعها في الخلية الكهربائي. ملء الغرفة الداخلية والخارجية على حد سواء مع كافية العازلة تشغيل (RB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة مشط وقبل تشغيل هلام في 200 V لمدة 10 دقيقة. قبل عينات التحميل ويغسل الودائع اليوريا من الآبار بواسطة التدفق بعض RB من خلال حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصائح لاستخدام مسطحة بعناية تراصف عينات من الخطوة 4.5 في الجزء السفلي من كل بئر. تحقق الأنود والكاثود اتصالات لتجنب تشغيل مقلوب. بعد تدخل عينات هلام في 100 فولت لمدة 5 دقائق، طncrease الجهد إلى 200 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطول التجزئة من حوالي 7 سم، وشوط 45 دقيقة لمدة كافية. تجنب برموفينول الأزرق (صبغة تتبع في ABD) لتجاوز هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور على هلام في الرنا طويلة مجزأة بواسطة إيثيديوم بروميد (EtBr) تلطيخ، باعتباره خطوة اختيارية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعيدا 2 سم من أعلى الجل وشطف لفترة وجيزة شريحة في DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة هلام في RT لمدة 15 دقيقة مع طيف التسكع في RB، EtBr 0.5 ميكروغرام / مل FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل اللون هلام لمدة 15 دقيقة في RB، تصور rRNAs طويلة من الأشعة فوق البنفسجية هلام أو التصوير. تحقق لتحميل RNA والجودة (انظر الشكل 1، لوحة 7). تنبيه! إيثيديوم بروميد هو المغير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه المضي قدما النشاف الجزء السفلي من هلام تحتوي على أنواع RNA الصغيرة. </li></ol> 6. جل التنشيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 6 قطع من الورق النشاف لتناسب مساحة النشاف ويعادل قطعة من unchargeد النايلون الغشاء. بلل ورقة ورقة، وغشاء 2 منصات النشاف في RB. تأكد من نقع تماما منصات طريق الضغط عليها مرارا وتكرارا في RB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هلام من الجهاز وفتح النظارات بواسطة متوسط ​​ملعقة. استخدام قطع نظيفة لإزالة الآبار. وضع ورقة هتما الرطب على هلام ورفعه بلطف صعودا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غشاء النايلون على وجه خال من هلام. علامة الزاوية لتوجيه مرشح وفقا لنموذج تحميل. استكمال &quot;ساندويتش&quot; (3 قطع الورق كل جانب). لفة قضيب من البلاستيك على سطح وصمة عار، لإزالة أي فقاعات الهواء الممكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وصمة عار بين اثنين من منصات النشاف ثم في الكاسيت النشاف. تجميع الكاسيت في وحدة النشاف، وملء الغرفة مع RB والتحقق من التوجه الصحيح (غشاء النايلون يجب أن تبقى بين جل ومحطة ايجابية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل في 20 V لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: لضمان ظروف متجانسة، وبعد 10 دقيقة فتح وحدة النشاف وصدوير في اتجاه شطيرة من 180 درجة قبل إتمام عملية التحويل. </li></ol> 7. غشاء يشابك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 6 مل من الحل يشابك الطازجة (XLS). تشبع 10 سم × 10 سم (أكبر من الغشاء النايلون) قطعة من الورق النشاف مع XLS. تنبيه! حمض الهيدروكلوريك (أحد مكونات XLS) غير ضارة للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك صمة عار ووضع غشاء على ورقة الترشيح 3MM الرطب. ملاحظة: يجب أن RNA لا يكون على اتصال مباشر مع ورقة المشبعة. وضع مرشح ورقة بين لوحين من الزجاج والتفاف في ساران التفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين الغشاء عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، تليها DDH 2 O الغسيل. تخزين في -20 درجة مئوية أو الشروع في التهجين. </li></ol> 8. غشاء Prehybridization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان قد تم التحقق RNA تحميل (خطوة اختيارية 5.5) فانتقل مباشرة إلى التهجين. أو آخر، وقطع بعيدا 1 سم من أعلى إلى مرشح النايلون، لتجنب التحقيق عبر hybridizatioنانوثانية إلى الرنا طويلة مجزأة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن 10 مل من التهجين الحل (HS) عند 37 درجة مئوية. تفسد 1 ملغ من سمك السلمون الحيوانات المنوية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وبارد على الجليد وإضافة إلى HS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مرشح في HS في 37C لمدة 1 ساعة على الأقل، في ظل التناوب في فرن التهجين. تأكد من أن الجانب RNA للمرشح يواجه HS. </li></ol> 9. التحقيق التجميعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء رد فعل الفوسفات إلى الأمام في 10 بمول من قليل النوكليوتيد العقاقير معين، كما هو موضح في 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مجلدات من تريس، EDTA-كلوريد الصوديوم (TEN) العازلة للتفاعل وتنقية التمهيدي المسمى من النيوكليوتيدات الفردية من هلام الإقصاء اللوني على أعمدة G-25 باستخدام Sephadex (أو أيضا ETOH هطول). النشاط التحقيق يمكن تقييمها من قبل السائل التلألؤ عداد. </li></ol> 10. غشاء التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال HS استنفدت الطازجة مع 10 مل قسامة (أعدت واستكملت كما هو موضح أعلاه). تسخين التحقيق في95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وبارد على الجليد وإضافة إلى HS الرواية. احتضان مرشح في 37 ° C ON. </li></ol> 11. غشاء الغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد حل التهجين وتخزينها في -20 درجة مئوية في مربع التدريع النشاط الإشعاعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف التصفية في غسل العازلة (WB)، وأغسلها جيدا لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كاشف جيجر مولر لفحص النشاط الإشعاعي المتبقية في زوايا التصفية. عندما الانبعاثات خلفية حوالي 5 من القانون الجنائي، انتقل إلى غشاء المعرض. </li></ol> 12. كشف الإشارة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح تصفية على أفلام تصوير الإشعاع الذاتي أو على شاشة تصوير الجزيئي ON. الكشف عن إشارات عن طريق تجهيز الفوتوغرافية أو التحويل الرقمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل كثافة الفرقة بواسطة برنامج مخصص الكمي (يماغيج أو Optiquant). </li></ol> 13. غشاء تجريد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الإشارات الأولية، غمر الغشاء في 500 مل من الغليان حل تجريد، ثم في احتضان RT لمدة 1 دقيقة. الشروع في رواية (قبل) التهجين أو تخزين مرشح في -20 درجة مئوية. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

على الرغم من تقديرنا للالمحنك المتشابكة من خلالها RNA ينظم تكوين الخلايا العصبية في تزايد مستمر، والآثار الميكانيكية للcircuitries القائم على RNA العصبي التي تؤثر بيولوجيا الخلايا الجذعية، وتمايز الخلايا العصبية / التكامل الوظيفي، وتطوير الأمراض العصبية والسرطان لا تزال ?...

شهدت RNA الكيمياء الحيوية تقدمات مذهلة في السنوات الماضية 1. وقد انفجر فهمنا من إمكانات RNA في السيطرة على التعبير الجيني من خلال تحديد قوية غير المكودة RIBO المنظمين 2، من خلال اكتشاف آليات جديدة على أساس RNA 3،4 التنظيمية وتوصيف أعمق من الأحداث آخر النسخي المعروف بالفعل 5. كل ذلك معا وقد سمحت هذه الدراسات البيولوجيا RNA لجعل المشهد بشكل كبير، وأصبح موضوع البحث الرئيسي في المشهد العلمي الحالي. على وجه الخصوص، خلال السنوات الأخيرة أننا نحصل على الشعور تأثير المتفشي من &quot;عالم RNA&quot; في بيولوجيا الأعصاب الجزيئية 6، واحدة من المجالات البحثية الأكثر ديناميكية في علوم الحياة الحديثة. في العقد الأخير من القرن الماضي، وقد أحدثت ثورة في السيناريو العلمي الشامل قبل اكتشاف تدخل الحمض النووي الريبي و7،8 من الرنا التنظيمية صغيرة 9،10مع إيلاء اهتمام خاص لالرنا الميكروية 11، عن التطور الطبيعي الرنا غير مكود صغيرة المتورطين في السيطرة على جميع الوظائف الخلوية ما يقرب من المنظمين عديد المظاهر واندماجي في التعبير الجيني. بعد ما يقرب من 10 عاما ميرنا الاكتشاف الأولي في ايليجانس انواع معينة من أمبروس ومختبرات Ruvkun، وتحولت اهتماما متجددا إلى الميدان عندما تم تحديد أعداد كبيرة من miRNAs في ذبابة الفاكهة وفي الخلايا البشرية فضلا 12-15. منذ ذلك الحين، وذلك بفضل النهج المعدلة وراثيا تنوعا، وقفت ذبابة الفاكهة السوداء البطن بها باعتبارها السياق البيولوجي قيما للالخوض ميرنا الحيوي والنشاط. كشفت ذبابة الفاكهة miRNAs ظائف متميزة في عمليات الحشرات محددة أو الحفظ تطويريا، والتي تمتد من الشيخوخة وحتى التمثيل الغذائي، مما يشير إلى مسارات والسلوك، وبطبيعة الحال، تكوين الخلايا العصبية. على طول هذا الاتجاه، فإننا كشف مؤخرا وجود صلة رواية 16 في التعاون فضولrrelation التي تحدث بين الجينات سيد صناع التغيير العالمي / وأنسل من مسار RNA. عامل ذبابة النسخ GCM / الإنزلاق 17-19 يشكل نموذجا فريدا من المحددات مصير الخلية، والتي تملي الدبقية مقابل خيار مصير الخلايا العصبية في متعدد القدرات تطير السلائف العصبية 20. عام البحوث والعشرين طويلة حول هذا الموضوع وأكدت بشكل واضح وقوع مدخلات متعددة ومتداخلة من الجين تنظيم التعبير تتلاقى على صناع التغيير العالمي / أنسل 21-28 لتأسيس مستويات الحد الأدنى المطلوب لتحقيق التوازن بين نسبة الحساسة بين نظرائهم العصبية والدبقية خلال التطور العصبي. اكتشفنا أن التنظيم عبر استهداف Dmel-miR279 يمثل مستوى الرقابة مزيد من المساهمة في مرحلة ما بعد النسخي صقل من صناع التغيير العالمي / أنسل التعبير 16. تحسينات منهجية محددة على الصعيد العالمي، ويتطلب هذه الخطوط البحثية: طول سنوات، عدة تقنيات وضعت أصلا لتحليل التقليديةتم تحويل الرنا itional لقياس الرنا صغيرة غير الترميز، مثل ما المقايسات حماية ريبونوكلياز، المصفوفات [كدنا] 29-31، في الوقت الحقيقي PCR أساليب 32-35 وتسلسل 36،37. على الجانب الآخر، إعادة تقويم المناهج الفنية عزز تقدمات مستمرة في هذا المجال. شمال لطخة فحص (NB، أو هلام RNA فحص لطخة) يشكل المثال التمثيلي: يعمل إلى حد كبير على البيانات الشخصية تراكم RNA، لأنه يضمن كل من مستوى التعبير الكميات وكذلك تحديد الحجم. ومع ذلك، فإن حساسية الفقيرة الجوهرية للطريقة يحد عندما يكون ليتم تطبيقها على التعبير الجيني المستقبلون غرامة المنخفضة وفيرة، مثل الرنا قصيرة. والنتيجة الضارة هي شرط كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي مجموع، مما يجعل من الصعب تطبيقه على عينات بيولوجية محددة. لهذه الأسباب، NB المتغيرات المحددة للكشف الرنا صغيرة تم وضعها 38-40: نحن استغل لتحسين بروك NBedure 41 (ENB، وتعزيز الشمالية البقعة)، في حين توضيح التفاعل المذكور بين Dmel-miR279 وصناع التغيير العالمي / أنسل. ويعتمد هذا الأسلوب على خطوة الكيميائية يشابك على أساس النشاط لمشتقات Carbodiimide [1 إيثيل-3- (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide، EDC] لإصلاح الحمض النووي على دعامات صلبة. Carbodiimide هو رابط عبر تنوعا معروفة لتحفيز تشكيل السندات أميد بين الكربوكسيل أو مجموعات الفوسفات تنشيط والجماعات أمين 42. يمكن استغلال هذه الخاصية لالرنا صغيرة زوجين تساهميا عبر مجموعة أحادية فسفرته من 5&#39;-الهيدروكسيل إلى الأمينية مجموعات على سطح الأغشية النايلون. التكوين مرفق الناتجة يزيد من سهولة الوصول للحمض النووي يجمد وبدوره، كفاءة التهجين التحقيق المستهدفة، مما يؤدي إلى تعزيز الكشف ملحوظا 43. هذه التقنية تفترض relevanc معينةالإلكترونية في الدراسات الجزيئية ذبابة الفاكهة، التي وقوع فصول جديدة ومميزة من الرنا غير مكود صغيرة في الظهور 44. من بين هؤلاء، rasiRNAs 45،46 تشكل سلالة محددة من الرنا-التفاعل piwi (piRNAs 47)، والمشاركة في تسلسل محدد إسكات الجينات. تفاصيل منطوق هذه الطريقة يتم وصف كامل وتصور فيما بعد، نسبة إلى تحليل الرنا الميكروية Dmel-miR279 وDmel-miR286، وللمرة الأولى، من rasiRNA واحد، rasi4. نحن دفعت إلى التطرف هذه الطريقة، الأمر الذي سمح لنا الكشف عن أهداف أعرب سيئة من كميات ضئيلة من الحمض النووي الريبي (أقل من 1 ميكروغرام).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

وقد شهدت العقود الأخيرة انفجار الفائدة العلمية حول آليات الرقابة التعبير الجيني على مستوى الحمض النووي الريبي. هذا الفرع من علم الأحياء الجزيئي واشتعل كثيرا اكتشاف الرنا غير المكودة باعتبارها من اللاعبين الرئيسيين في التنظيم بعد النسخي. وقد رافق هذا المنظور الثوري والناجمة عن تطوير تكنولوجيات قوية لالتنميط قصيرة الرنا التعبير، سواء على مستوى الإنتاجية العالية (التعرف على نطاق الجينوم) أو تحليل مرشح واحد (الدولة تراكم مستمر من أنواع محددة). وعلى الرغم من عدة دولة من بين الفن الاستراتيجيات المتاحة حاليا لجرعات أو تصور مثل هذه الجزيئات الفارين، يبقى لطخة الشمالية فحص النهج المؤهلين في مجال البيولوجيا الجزيئية لتقييم فوري ودقيق التعبير RNA. أنها تمثل خطوة أولى نحو تطبيق أكثر تطورا والتكنولوجيات مكلفة، وفي كثير من الحالات، يبقى وسيلة تفضيلية للحصول على أفكار بسهولةفي علم الأحياء الحمض النووي الريبي. نحن هنا نظرة عامة على بروتوكول كفاءة (المحسن الشمالية البقعة) للكشف عن الرنا الميكروية أعرب ضعيف (RNA التنظيمية أو الأنواع الصغيرة الأخرى) من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة كلها، تشريح أنسجة اليرقات / الكبار يدويا أو المختبر في الخلايا المستزرعة. مطلوب كمية محدودة جدا من الحمض النووي الريبي واستخدام مواد من تدفق خلايا معزولة الخلوي يمكن أن يكون التفكير أيضا.

<html> باتباع الإجراء الشامل وصفها في نص وتمثيل تخطيطي في الشكل 1، قمنا بتقييم التعبير الرنا صغيرة من عينات الحمض النووي الريبي معقدة من أصول مختلفة. في التجربة المعروضة في الشكل 1، تم عزل الحمض النووي الريبي من 2 خلايا ذبابة الفاكهة شنايدر عن طريق ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

والهدف من هذا المنشور هو تصور ومناقشة الخطوات المنطوق لتعزيز بروتوكول الشمالية صمة عار على الحمض النووي الريبي المستخرج من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة والخلايا والأنسجة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن كفاءة الأنواع RNA الصغيرة.

تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في<em&gt; الدروسوفيلاميلانوجاستر</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  والهدف من هذا المنشور هو تصور ومناقشة الخطوات المنطوق لتعزيز بروتوكول الشمالية صمة عار على الحمض النووي الريبي المستخرج من الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة والخلايا والأنسجة. هذا البروتوكول هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن كفاءة الأنواع RNA ?...

Video: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

التصوير من خلال حالة العذراء من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

صيانة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عدد السكان قفص

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...