이 작품은 연구소 국립 드 라 상테 동부 표준시 드 라 공들인 Médicale에 의해 지원되었다, 센터 국립 드 라 공들인 과학원, 4 대학 드 스트라스부르, HOPITAL 드 스트라스부르, 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암, 연구소 국립 뒤 암, 직원은 국립 드 라 공들인 및 지역 알자스. 피에트로 Laneve는 라 공들인 Médicale는 Fondation에 의해 부어지지를 받고 있습니다. 현재는있는 Istituto 이탈리아 Tecnologia (IIT) 교제의받는 사람입니다. 출판 비용을 Neurex 네트워크에 의해 지원됩니다 (TriNeuron - 프로그램 Interreg IV 상단 라인)

1 샘플 컬렉션 <ol><li> 피펫에 의해 반 부착 슈나이더의 두 세포 (평균 1-5 × 10 6 세포), 분리 및 원심 분리 (1 분 100 XG)에 의해 그들을 수확. 체외 부착 세포 배양의 경우는, 표준 조건에서 그들을를 Trypsinize 직접 셀 스크레이퍼의 도움으로, RNA 추출 시약의 양에 편리한 플레이트에서 그들을 수집. </li><li> 배아 수집, 플라이 케이지에서 초파리 균주를 성장하게 배아는 계란 누워 판에 누적됩니다. 증류수에 붓 DH (2 O)에 의해 배아를 닦아, 자체 필터링 파편을 버리고 씻어 유리 병 (48)에 배아를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 다른 방법으로 수동으로 조직 / 장기를 해부하다. 힘으로 박리 바늘 또는 집게를 사용하여, 실체 현미경 (배율 20 배)에서는 인산염 완충 식염수 (PBS)에 초파리 복부에서 고환 (피르 분석을위한 우선적 인 시스템)을 격리설리반 등 49 ualized. </li><li> 유 봉은 RNA 추출 시약 0.5 볼륨의 중독에 샘플을 균질화. </li></ol> 2 RNA 추출 / 분석 <ol><li> 다음은 제조업체의 지침에 상용 시약을 통해 RNA 분리를 수행합니다.주의! RNA 추출 에이전트는 일반적으로 독성 및 부식성이다. 또는 다음과 같이, RNA 분리 (50)에 대한 테 K-기반의 프로토콜을 적용 <ol><li> 정지 믹스 400 μL로 샘플을 희석하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 클로로포름 : 이소 아밀 알코올과 클로로포름 추출 및 에탄올 (EtOH를) 침전 / 세탁에 의한 표준 페놀에 의해 hydrosoluble 구성 요소를 복구 할 수 있습니다. 공기 샘플을 건조 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 재현 탁 더블 (일) H 2 O 증류 - 처리 </li></ol></li><li> UV 분광 측정하여 RNA 농도를 평가합니다. 또한, RNA의 순도는 2.0에 가까운 높은 BAS 보장260에 ED / 280 읽기. </li><li> 다음과 같이 아가 로스 젤을 변성에 RNA 준비 확인 <ol><li> 깨끗한 비커에서 연속 교반, DEPC-DDH 2 O의 82 ㎖에 아가로 오스의 1.2 g을 녹인다. 완전히 용해 될 때까지 끓인다. </li><li> 겔 용액을 냉각시킵니다; 온도가 60 °가 10 배 4 morpholinepropanesulfonic 산 10 ㎖를 추가 C에 도달 할 때 (MOPS)는 1X 최종 농도 (FC)에 버퍼, 8 ml의 3 포름 알데히드 % 37 %의 FC.주의! 포름 알데히드는 발암 물질이다. </li><li> 수평 전기 영동 셀에 겔을 붓고. 젤은 적어도 1 시간 동안 후드 강화하도록 허용합니다. 응고 후, MOPS 1X에 젤 잠수함. </li><li> 분취 RNA 시료 2 μg 및 1 μg의 래더 (정확한 평가가 요구 될 때 RNA 마커를 사용). RNA에 아가로 오스 로딩 염료 (ALD)의 3 볼륨을 추가하고 사다리. 열 70 ° C 5 분 동안 얼음에 즉시 차가운에서. CA의 ution! ALD의 내용 (에티 디움 브로마이드 및 포름 아미드, 자료 참조)는 각각, 돌연변이 및 부식성이다. </li><li> 샘플을로드하고 가끔 버퍼 재활용 약 1 시간 동안 50 V에서 젤을 실행합니다. UV 시각화 또는 젤 이미징에 의해 RNA의 분류 패턴을 확인합니다. 28S와 18S rRNAs과 된 tRNA에 해당하는 개별 밴드를 인식 (그림 1 참조). </li></ol></li><li> -80 ° C에서 북부 분석 또는 저장 RNA 진행합니다. </li></ol> 3 변성 아크릴 아마이드 젤 준비 <ol><li> 이 분류 단계에 대한 작은 수직 전기 영동 장치 (플레이트의 크기 8cm X 9cm, 빗 두께 0.75 mm)를 사용합니다. </li><li> 주조 프레임에서 함께 깨끗한 안경을 조립합니다. </li><li> (1 19) MOPS 1X 용액, 7 M 우레아 10 % 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 10 ㎖를 준비합니다. 바로 주입하기 전에, 10 %의과 황산 암모늄 100 ㎕ TEMED 및 10 μL를 추가하고 신속 용액을 혼합한다.주의! 아크릴 아마이드는 신경 독성 및 발암 물질이다. </li><li> 유리판 사이에 젤을 부어 거품을 피하기 위해 신중하게 잘 빗를 삽입합니다. 젤은 사용하기 전에 적어도 45 분 동안 실온에서 중합 보자. 또한, 겔 O / N, 물에 젖은 여과지에 싸여 사란 랩에 밀봉 저장합니다. </li></ol> 4 샘플 준비 <ol><li> 나누어지는 0.5-20 각 샘플에 대한 총 RNA ㎍의. 볼륨 3-4 μl를 초과하면, 진공은 샘플을 건조. </li><li> 크기 결정 용 마커로서 (제조 섹션 4.3 및 4.4 참조), 샘플에 평행 방사성 표지 저역 사다리의 분취 량 (20-30 CPS)를 실행. 단계 4.5에 기재된 바와 같이, 샘플들에 병렬로 취급. </li><li> 사다리 : 10 bp의 단계 사다리의 0.1 μg을 사용하여 인산 앞으로 반응을 설정합니다. 30 분 동안 37 ° C에서 품어 20 mM의 FC에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가하여 반응을 중지합니다. </li><li> EtOH로 침전 / 세척, 건조 공기에 의해 정화DDH 2 O (약 100 μL).에 재현 탁주의! 32 P 방사성 소스입니다. </li><li> 각 샘플에 아크릴 아미드 파란색 염료 (ABD)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 5 분 동안 80 ° C에서 가열에 의해 변성 및로드.주의까지 얼음에 멋지다! 포름 아미드 (ABD의 내용이) 부식성이다. </li></ol> (5) 전기 영동 분획 <ol><li> 캐스팅 지원을 유리판을 제거하고 적절하게 전기 영동 셀을 조립한다. 충분한 실행 버퍼 (RB)와 모두 내부 및 외부 챔버를 입력합니다. </li><li> 부드럽게 빗를 제거하고 10 분 동안 200 V에서 젤을 미리 실행합니다. 로드 샘플 전에 주사기를 통해 일부 RB를 분출하여 우물에서 요소 예금을 씻어. </li><li> 플랫 팁을 사용하여 각 우물의 바닥에서 4.5 단계에서 신중 충 샘플. 거꾸로 실행을 방지하기 위해 양극과 음극 연결을 확인합니다. 샘플이 5 분 동안 100 V에서 젤을 입력 한 후, 난V. 200에 전압을 ncrease </li><li> 약 7cm의 분별 길이를 들어, 45 분 - 장기적으로는 충분하다. 젤을 오버플로 브로 모 페놀 블루 (ABD에서 추적 안료를)하지 마십시오. </li><li> 선택적인 단계로 에티 디움 브로마이드 (EtBr이) 염색에 의해 분류 된 긴 RNA를 겔에 - 시각화 : <ol><li> 겔의 정상에서 멀리 2cm를 잘라 짧게 DDH 2 O.에서 슬라이스를 씻어 </li><li> RB, EtBr이 0.5 μg / ml의 FC 부드러운 동거와 15 분 동안 실온에서 겔 슬라이스를 품어. </li><li> RB에서 1​​5 분 동안 젤 Destain, UV 조사 또는 겔 촬상 장거리 rRNAs 시각화. RNA 로딩과 품질 (그림 1, 패널 7).주의를 확인! 에티 디움 브로마이드가 돌연변이이다. </li></ol></li><li> 한편 작은 RNA 종을 포함하는 겔의 하부 블로 팅을 진행. </li></ol> 6 젤 블로 팅 <ol><li> 6 블롯 영역에 맞추기 위해 압지 조각과 uncharge의 상당 부분을 잘라D 나일론 막을. 용지, 막과 RB의 두 블로 팅 패드를 적 십니다. 완전히 반복 RB에서 그들을 압박하여 패드를 흡수해야합니다. </li><li> 장치에서 젤을 제거하고 주걱의 평균에 의해 안경을 엽니 다. 우물을 제거하기 위해 깨끗한 커터를 사용합니다. 젤에 젖은 와트 종이를 놓고 조심스럽게 들어 올립니다. </li><li> 겔의 자유면에 나일론 막을 놓습니다. 샘플 상태에 따라 필터의 방향을 모서리를 표시. &quot;샌드위치&quot;(3 종이 조각 각면)을 완료합니다. 가능한 모든 공기 방울을 제거하고, 표면에 오점 플라스틱 막대 롤. </li><li> 모래 바닥 카세트에이 모래 바닥 패드와 다음 사이의 오점을 놓습니다. , 모래 바닥 모듈에 카세트를 조립 RB와 챔버를 작성하고 (겔과 긍정적 인 말단 사이에 유지해야 나일론 막) 올바른 방향을 확인합니다. </li><li> 20 분 동안 20 V에서 전송합니다. 참고 : 10 분 블로 팅 모듈과 연구를 연 후, 균일 한 조건을 보장하기 위해전송을 완료하기 전에 180도 샌드위치 otate. </li></ol> 7 막 가교 <ol><li> 신선한 가교 솔루션 (XLS)의 6 ML을 준비합니다. 포화 10cm는 (나일론 막보다 더 큰) 10cm XLS.주의와 압지의 조각을 X!에 HCl (XLS의 구성 요소)이 높은 부식성이다. </li><li> 오점을 해체 젖은 3MM 필터 종이에 막 배치합니다. 참고 : RNA는 포화 종이와 직접 접촉하지 않아야합니다. 두 개의 유리판 사이의 필터 종이를 놓고 사란 랩에 포장. </li><li> DDH 2 O 세척 한 다음 2 시간 동안 60 ° C에서 막을 열. -20 ° C에서 저장 또는 하이브리드를 진행합니다. </li></ol> 8 멤브레인의 프레 하이브 리다이 제이션 <ol><li> RNA로드 (옵션 단계 5.5)을 선택되어 있으면 직접 하이브리드를 진행합니다. 아니면, 나일론 필터의 꼭대기로부터 거리 1cm 잘라 프로브 간 hybridizatio 않도록분별 긴 RNA를 ns의. </li><li> 37 ° C에서 하이브리드 솔루션 (HS) 10 ㎖를 예열. 5 분 동안 95 ° C에서 연어 정자의 1 mg의 변성 얼음에 시원하고 HS 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혼성화 오븐에서 회전에 따라, 적어도 1 시간 동안 37 ℃에서 HS에서 필터를 배양한다. 필터의 RNA 측이 HS에 직면 해 있는지 확인합니다. </li></ol> 9 프로브 합성 <ol><li> 4.3에 설명 된대로 특정 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 10 pmol의에 인산 앞으로 반응을 설정합니다. </li><li> (EtOH로 침전도 이상) 트리스-EDTA-염화나트륨 (TEN)의 5 볼륨이 반응 버퍼 및 G-25 세파 덱스 컬럼에 젤 배제 크로마토 그래피에 의한 합병되지 않는 뉴클레오티드의 표지 프라이머를 정화 추가합니다. 프로브 활성을 액체 섬광 계수기에 의해 평가 될 수있다. </li></ol> (10) 멤브레인 하이브리드 <ol><li> 신선한 10 ㎖의 분취 (전술 한 바와 같이 제조 및 보완)로 배출 HS를 교체합니다. 에 프로브를 가열얼음에 시원하고 새로운 HS에 추가 10 분 동안 95 ° C에서. 37 ° C ON에서 필터를 품어. </li></ol> (11) 멤브레인 세척 <ol><li> 하이브리드 솔루션을 복구 및 방사능 차폐 상자에 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 세척 버퍼 (WB)의 필터를 세척하여 실온에서 10 분 동안 철저하게 씻는다. </li><li> 필터 코너에서 잔류 방사능을 점검하기위한 가이거 뮬러 감지기를 사용합니다. 배경 배출량은 약 5 CPS 때, 박람회를 막에 진행합니다. </li></ol> (12) 신호 감지 <ol><li> 오토 라디오 그래피 필름 또는 분자 영상 화면 ON에 필터를 노출. 사진 처리 또는 디지털 변환하여 신호를 알 수있다. </li><li> 전용 정량화 소프트웨어 (ImageJ에 또는 Optiquant)에 의해 밴드의 강도를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> (13) 멤브레인 스트립 <ol><li> 스트리핑 끓는 용액의 500 ㎖에 잠수함, 막 1 차 신호를 제거하려면다음 1 분 동안 실온에서 배양한다. 소설 (전) 하이브리드를 진행 또는 -20 ° C에서 필터를 저장합니다. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

RNA가 신경을 조절 통해 얽혀 닳고 닳은 우리의 감사가 지속적으로 증가하고 있지만, 신경 줄기 세포 생물학, 신경 세포의 분화 / 기능 통합, 신경 병변 및 암의 개발에 영향을 미치는 RNA 기반 circuitries의 기계적인 의미는 미개척 남아있다. 초파리는 짧은 RNA를 비 암호화 및 전사 인자가 큰 분자 플레이어로 간주되는 비경 셀룰러 경로를 해명하는 수단으로서 melanogaster 왕국 통해 이러한...

RNA 생화학는 지난 몇 년 동안 일에 극적으로 진행되는 발생했습니다. 유전자 발현의 조절에서 RNA 전위의 우리의 이해는 신규 한 RNA 기반 규제 메커니즘 3,4의 발견에 의해 이미 공지 된 전사 후 이벤트 깊은 특성화에 의해, 강력한 비 암호화 리보 - 레귤레이터 (2)의 식별 정보를 이용하여 버스트되었습니다 5. 모두 함께 이러한 연구가 허용 한 RNA 생물학 극적으로 현재 과학 풍경에 주요 연구 대상이되고, 현장을 확인합니다. 특히, 최근 몇 년 동안 우리는 분자 신경 생물학 (6), 현대 생명 과학에서 가장 역동적 인 연구 영역 중 하나에서 &quot;RNA 세계&quot;의 보급에 미치는 영향의 감각을 얻고있다. 지난 세기 지난 10 년 동안 과학 전반적인 시나리오는 RNA 간섭 7,8 발견 의해 소형 RNA를 규제 9,10의 혁명되었습니다마이크로 RNA (11)에 특정과 관련하여, 내생 적 유전자 발현의다면 발현과 조합 규제 등 거의 모든 세포 기능의 조절에 관여 작은 비 암호화 RNA를 표현. miRNA가 높은 번호가 초파리뿐만 아니라 12 ~ 15 인간의 세포에서 발견했을 때 거의 십년 AMBROS 및 Ruvkun의 연구소에 의해 예쁜 꼬마 선충에서 miRNA의 초기 발견 후, 새롭게 관심 분야에가되었습니다. 그 이후로, 다양한 형질 전환 방법 덕분에, 초파리는 miRNA의 생합성 및 활동에 대해 깊이 탐구 귀중한 생물 컨텍스트로서 서 있었다. 초파리의 miRNA가 경로를, 신진 대사 노화 신호에서 이르기-곤충 특정 또는 진화 적으로 보존 된 프로세스에 고유 한 기능을 계시했다 행동하고, 물론, 신경. 이 방향을 따라, 우리는 최근 흥미로운 공동의 소설 링크 16을 발표했다마스터 유전자 GCM / RNA 활공 경로 사이에서 발생 rrelation. 플라이 전사 인자 GCM / 글라이드 17-19 능성에 아교 대 신경 운명의 선택이 신경 전구체 20 비행 지시 세포 운명 결정의 독특한 예를 구성한다. 스물 년이 주제에 대한 오랜 연구는 GCM /를 통해 수렴 유전자 발현 조절의 다양하고 중복 입력의 발생 신경 개발 과정에서 신경 세포와 신경 교세포의 대응 사이의 섬세한 비율을 균형에 필요한 임계 값 레벨을 설정하는 21 ~ 28 활공을 강조 분명히하고있다. 우리는 DMEL-miR279 타겟팅을 통해 그 규정은 GCM의 전사 후 미세 조정 / 16 식 활공에 기여하는 또 다른 제어 수준을 나타냅니다 발견했다. 전 세계적으로 이러한 연구 선이 필요 한 특정 방법론 개선 : 년 함께 몇 가지 기술은 원래 트라를 분석하기 위해 개발itional RNA들처럼, 작은 비 코딩의 RNA를 정량화 변환 된의 RNase 보호 분석법, cDNA를 배열 29-31, 실시간 PCR 방법 32-35 및 36,37 시퀀싱 등. 다른 측면에서, 기술적 접근 방법의 재 교정이 분야에서 지속적으로 진행되는 육성하고있다. 북부 얼룩 분석 (NB, 또는 RNA 겔 블롯 분석은) 대표 인스턴스를 구성 : 그것은 크기가 결정뿐만 아니라 모두 발현 수준의 정량을 보장 이후 크게, RNA 축적을 프로파일 사용된다. 그러나, 본 방법의 본질적인 나쁨 감도는 짧은 RNA를 원한다면, 낮은 풍부한 유전자 발현 미세 튜너에인가 될 때 제한된다. 해로운 결과는 특정 생체 시료 어려운 그 응용 프로그램을 만드는 총 RNA, 많은 양의 요구 사항입니다. 이러한 이유로, 작은 RNA를 검출을위한 특정 NB 변종의 경우 38 ~ 40를 개발되어 있습니다 : 우리는 개선 된 NB 발동을 이용했다edure 41 (ENB, 향상된 북부 오), DMEL-miR279와 GCM / 활공의 전술 상호 작용을 해명하면서. 이 방법은, 카르 보디이 미드 유도체의 활동을 기반으로 화학적 가교 결합 단계에 의존 [1 - 에​​틸 3 - (3 - 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드, EDC] 고체 지지체에 핵산을 고정한다. 카르 보디이 미드 활성화 카복실 또는 포스페이트 그룹 및 아민 기 (42) 사이에 아미드 결합의 형성을 촉진하는 것으로 알려진 다기능 가교제이다. 이 속성은 나일론 막의 표면에서 그룹을 아미노하기 위해 모노 인산화 된 5&#39;-하이드 록실 그룹을 통해 공유 커플 작은 RNA들에 악용 될 수 있습니다. 얻어진 부착 구성은 다시 검출 현저한 향상 43 결과 프로브의 타겟의 혼성화의 효율을 고정화 핵산의 접근성을 높이고. 이 기술은 특정 relevanc 가정초파리 분자 연구에서 전자가있는 작은 비 암호화 RNA를 소설과 독특한 클래스의 발생이 44 떠오르고있다. 이 중, 45, 46가 순서 특정 유전자 침묵 (gene silencing)에 참여 piwi 상호 작용하는 RNA를 (piRNAs 47)의 특정 하위 유형을 구성 rasiRNAs. 이 방법의 동작 상세하게 설명 하나 rasiRNA, rasi4 중, 최초로, 마이크로 RNA-DMEL miR279 및 DMEL-miR286의 분석을 기준으로하고, 이하에서 가시화된다. 우리는 RNA (이하 1 μg)의 최소 금액에서 제대로 표현 대상도 공개 허용이 방법을, 극단으로 밀었다.

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

지난 수십 RNA 수준에서 유전자 발현을 제어 메커니즘 주위 과학적 관심 폭발을 보아왔다. 분자 생물학의이 지점은 크게 전사 후 조절에 중요​​한 선수로의 RNA를 비 암호화의 발견에 의해 연료를 공급하고있다. 이러한 혁신적인 관점은 높은 처리량 레벨 (게놈 전체의 식별) 또는 단일 후보 분석 (특정 종의 정상 상태 축적)으로 모두 함께 짧은 RNA를 발현 프로파일 링에 대한 강력한 기술의 개발에 의해 촉발되었다. 여러 첨단 전략 투여 또는 도피 분자를 시각화 현재 사용할 수 있지만, 북부 오 점 분석은 RNA 발현의 즉각적이고 정확한 평가를위한 분자 생물학 자격이 접근 남아있다. 이는 많은 경우에 더 정교하고 고가의 기술의 응용을 향해 첫 단계는 쉽게 통찰력을 얻기 위해 우선적 인 방법 남아 나타내고RNA 생물학에. 여기에서 우리는 수동으로 애벌레 / 성인 조직을 해부 또는 체외 배양 된 세포에서, 전체 배아를 melanogaster 초파리에서 약하게 발현 마이크로 RNA (또는 다른 작은 규제 RNA 종)을 검출 (북 오 강화) 효율적인 프로토콜 개요. RNA의 매우 제한된 양이 필요하고 계측법 절연 세포가 될 수있는 흐름 물질의 사용은 또한 예상된다.

도 1에서 설명 텍스트 및 개략적 전반적인 절차에 따라, 우리는 상이한 기원의 복잡한 RNA 샘플로부터 RNA를 작은 식을 평가 하였다. (: 아가 로스 젤 분류 변성 선택적 단계) 두 번에로드 그림 1에서 제시 한 실험에서, RNA는 무결성 검사 테 K 추출하여 초파리 슈나이더의이 세포로부터 분리되었다. 겔의 절반은 중립 멤브레인에 블 롯팅시키고, 화학적 가교 결합에 의해...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된<em&gt; 초파리 Melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K 조회수.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

성인에서 Oenocytes의 해부 Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

(A)의 유지 보수<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 인구 케이지

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...