Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, el Centre National de la Recherche Scientifique, la Universidad de Estrasburgo, el Hôpital de Estrasburgo, la Asociación pour la Recherche sur le Cáncer, el Institut National du Cancer, la Agence Nationale de la Recherche y la región de Alsacia. Pietro Laneve ha recibido el apoyo de la Fondation pour la Recherche Médicale. Actualmente, es un receptor de un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de becas. Costos de publicación son apoyados por la red Neurex (TriNeuron - Programa Interreg IV Alto Rin)

1. Sample Collection <ol><li> Separe 2 células semi-adherente de Schneider, (1.5 x 10 6 células por término medio), con la pipeta y cosecharlas por centrifugación (100 xg durante 1 min). En el caso de las células adherentes cultivadas in vitro, trypsinize en condiciones estándar o directamente a partir de placas recogerlas en una cantidad conveniente de reactivo de extracción de ARN, con la ayuda de un rascador de células. </li><li> Para la recogida de embriones, crecer cepas de Drosophila en jaulas de moscas y deja embriones se acumulan en las placas de puesta de huevos. Limpie los embriones fuera por un pincel en agua destilada (DH 2 O), desechar los residuos por el tamiz de filtrado, enjuague y recuperar los embriones en un vial 48. </li><li> Como una técnica alternativa, diseccionar manualmente tejidos / órganos. Aislar testículos (un sistema preferencial para el análisis piRNA) de Drosophila abdomen en solución salina tamponada con fosfato (PBS) bajo un estereomicroscopio (aumento 20X), mediante el uso de agujas de disección o fórceps como visdividualizado en Sullivan et al 49. </li><li> Maja homogeneizar muestras sobre la adicción de 0,5 volúmenes de reactivo de extracción de RNA. </li></ol> 2. Extracción de ARN / Análisis <ol><li> Siguiendo las instrucciones de los fabricantes realizan el aislamiento de ARN a través de reactivos comerciales. PRECAUCIÓN! Agentes de extracción de ARN suelen ser tóxicos y cáusticos. Alternativamente, aplicar un protocolo basado en proteinasa K para el aislamiento de ARN 50, como sigue: <ol><li> Diluir las muestras en 400 l de parada Mezclar e incubar a TA durante 15 min. </li><li> Recuperar componentes hidrosolubles por estándar de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y cloroformo extracciones y por etanol (EtOH) Precipitación / lavado. Aire secar las muestras y volver a suspender en dietilpirocarbonato (DEPC) tratados con doble destilado (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Evaluar la concentración de ARN mediante medición espectrofotométrica UV. También garantizar la pureza del ARN es alto, cerca de 2.0, based en A 260 / A 280 lectura. </li><li> Compruebe preparación de ARN en gel desnaturalizante de agarosa como sigue: <ol><li> En un vaso de precipitados limpio, disolver 1,2 g de agarosa en 82 ml de DEPC-ddH 2 O, bajo agitación continua. Hervir hasta que se disuelva por completo. </li><li> Deje que la solución de gel se enfríe; cuando la temperatura alcanza los 60 ° C Añadir 10 ml de ácido 4-10X morfolinopropanosulfónico (MOPS) buffer de 1X concentración final (FC), y 8 ml de formaldehído al 37% al 3% FC. PRECAUCIÓN! El formaldehído es un carcinógeno. </li><li> Verter el gel en una célula de electroforesis horizontal. Deje que el gel se solidifique en una campana durante al menos 1 hora. Después de la solidificación, sumergir el gel en MOPS 1X. </li><li> Alícuota 2 g de muestra de ARN y 1 g de Escalera (utilice un marcador de ARN cuando se desea una evaluación precisa). Añadir 3 volúmenes de carga de tintes de agarosa (ALD) para ARN y para escalera. Calentar a 70 ° C durante 5 min e inmediatamente enfriar en hielo. CAUCIÓN! Contenido de ALD (bromuro de etidio y formamida, ver Materiales) son mutágenas y corrosivo, respectivamente. </li><li> Cargar las muestras y correr el gel a 50 V durante aproximadamente 1 hora con el reciclaje tampón ocasional. Compruebe el patrón de ARN fraccionamiento mediante visualización UV o de imágenes de gel. Reconocer bandas discretas correspondientes a 28S y 18S ARNr y al ARNt (véase la Figura 1). </li></ol></li><li> Continúe con el Ensayo del Norte o tienda de ARN a -80 ° C. </li></ol> 3. desnaturalización acrilamida Preparación del gel <ol><li> Use un pequeño aparato vertical de electroforesis para esta etapa de fraccionamiento (tamaño de la placa alrededor de 8 cm x 9 cm, peine espesor 0,75 mm). </li><li> Ensamble vasos limpios juntos en una estructura de fundición. </li><li> Preparar 10 ml de 10% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) solución en MOPS 1X, 7 M de urea. Inmediatamente antes de verter, añadir 100 l de persulfato de amonio al 10% y 10 l de TEMED y mezclar rápidamente la solución. PRECAUCIÓN! Acrilamida es neurotóxica y carcinógeno. </li><li> Verter el gel entre placas de vidrio e insertar el peine bien cuidado para evitar burbujas. Deje que el gel se polimeriza a temperatura ambiente durante al menos 45 minutos antes de su uso. Alternativamente, guarde el gel S / N, envuelto en papel de filtro empapado con el agua y sellado en papel film. </li></ol> Preparación 4. Muestra <ol><li> Alícuota de 0,5-20 g de ARN total para cada muestra. Si el volumen es superior a 4.3 l, de vacío seque la muestra. </li><li> Para la determinación del tamaño, ejecutar una alícuota (20-30 cps) de la escala de rango bajo radiomarcado en paralelo a las muestras, como un marcador (ver sección 4.3 y 4.4 para la preparación). Tratarlo en paralelo a las muestras, como se describe en el paso 4.5. </li><li> Escalera: creó una reacción directa de fosfato utilizando 0,1 g de una escalera de 10 pb a paso. Incubar a 37 ° C durante 30 min y detener la reacción mediante la adición de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 20 mM FC. </li><li> Se purifica por precipitación con EtOH / lavado, secar al aire yresuspender en ddH2O (100 l). PRECAUCIÓN! 32P es una fuente radiactiva. </li><li> Para cada muestra de añadir un volumen igual de colorante azul acrilamida (ABD). Desnaturaliza por calentamiento a 80 ° C durante 5 minutos y enfriar en hielo hasta su embarque. PRECAUCIÓN! Formamida (contenido en ABD) es corrosivo. </li></ol> 5. electroforética Fraccionamiento <ol><li> Retire las placas de vidrio del soporte de fundición y ensamblarlos correctamente en la célula de electroforesis. Llenar ambos cámara interior y exterior con suficiente tampón de desarrollo (RB). </li><li> Retire suavemente el peine y pre-correr el gel a 200 V durante 10 min. Antes de cargar las muestras, lavar los depósitos de urea de los pozos por chorrear algún RB a través de una jeringa. </li><li> Utilice puntas planas para estratificar cuidadosamente las muestras procedentes de la etapa 4.5 en la parte inferior de cada pocillo. Revise las conexiones de ánodo y cátodo para evitar correr invertida. Después de que las muestras de entrar en el gel a 100 V durante 5 min, iaumentar la cant voltaje a 200 V. </li><li> Para una longitud de fraccionamiento de unos 7 cm, a 45 min-largo plazo es suficiente. Evite el azul de bromofenol (un pigmento de seguimiento en ABD) para desbordar el gel. </li><li> Visualizar en gel los ARNs largos fraccionados por bromuro de etidio (EtBr) tinción, como un paso opcional: <ol><li> Cortar 2 cm desde la parte superior del gel y enjuague brevemente la rebanada en ddH 2 O. </li><li> Incubar la rebanada de gel a temperatura ambiente durante 15 min con shacking suave en RB, EtBr 0,5 g / ml FC. </li><li> Destain el gel durante 15 min en RB, visualizar largos rRNAs por irradiación UV o formación de imágenes de gel. Compruebe si hay carga de ARN y la calidad (véase la Figura 1, Panel 7). ATENCIÓN! El bromuro de etidio es un mutágeno. </li></ol></li><li> Mientras tanto proceder secante la parte inferior del gel que contiene pequeñas especies de ARN. </li></ol> 6. Gel Secante <ol><li> Cortar 6 trozos de papel secante para ajustarse al área secante y una pieza equivalente de uncharged membrana de nylon. Humedecer las hojas de papel, membrana y 2 almohadillas de transferencia en RB. Asegúrese de absorber completamente las almohadillas apretando repetidamente en RB. </li><li> Retire el gel del aparato y abrir los vasos por medio de una espátula. Utilice un cortador de limpia para eliminar los pozos. Coloque una hoja de papel Whatman húmedo en el gel y suavemente levántela. </li><li> Coloque la membrana de nylon en la cara libre del gel. Marque una esquina para orientar el filtro de acuerdo con la carga de la muestra. Completa el &quot;sandwich&quot; (3 pedazos de papel a cada lado). Rollo de una varilla de plástico en la superficie de transferencia, para eliminar las posibles burbujas de aire. </li><li> Coloque la mancha entre dos almohadillas de transferencia y luego en el casete secante. Monte el casete en el módulo secante, llenar la cámara con RB y comprobar la orientación correcta (membrana de nylon debe permanecer entre el gel y el terminal positivo). </li><li> Transferir a 20 V durante 20 min. Nota: para garantizar condiciones homogéneas, después de 10 min abrir el módulo secante y rOtate el sándwich por 180 ° antes de completar la transferencia. </li></ol> 7. Membrana reticulación <ol><li> Preparar 6 ml de solución de reticulación fresco (XLS). Saturar a 10 cm x 10 cm (más grande que la membrana de nylon) trozo de papel secante con XLS. PRECAUCIÓN! HCl (un componente de XLS) es altamente corrosivo. </li><li> Desmontar el blot y colocar la membrana sobre el papel de filtro 3MM mojado. Nota: ARN no debe estar en contacto directo con el papel saturado. Coloque el filtro y papel entre dos placas de vidrio y se envuelve en saran-wrap. </li><li> Calentar la membrana a 60 ° C durante 2 horas, seguido de un lavado de ddH2O. Almacenar a -20 ° C o proceder a la hibridación. </li></ol> 8. Membrana Prehibridación <ol><li> Si la carga de ARN se ha comprobado (paso opcional 5.5), vaya directamente a la hibridación. O bien, corte 1 cm de la parte superior del filtro de nylon, para evitar sonda transversal hybridizations a RNAs largos fraccionada. </li><li> Precaliente 10 ml de disolución de hibridación (SA) a 37 ° C. Desnaturalizar 1 mg de esperma de salmón a 95 º C durante 5 minutos, enfriar en hielo y añadir a HS. </li><li> Incubar el filtro en el SA a 37 ° C durante al menos 1 hora, bajo la rotación en un horno de hibridación. Compruebe que el lado de ARN del filtro enfrenta SA. </li></ol> 9. Síntesis de Sonda <ol><li> Configurar una reacción directa de fosfato en 10 pmol de oligonucleótido antisentido específico, como se describe en 4.3. </li><li> Añadir 5 volúmenes de Tris-EDTA-NaCl (TEN) tampón para la reacción y purificar el cebador marcado los nucleótidos no incorporados mediante cromatografía de exclusión en gel en columnas de Sephadex G-25 (o también por precipitación con EtOH). La actividad de la sonda se puede evaluar mediante contador de centelleo líquido. </li></ol> 10. Membrana de hibridación <ol><li> Vuelva a colocar el agotado HS con un fresco 10 ml alícuota (preparada y complementado como se describió anteriormente). Calentar la sonda en95 ° C durante 10 minutos, enfriar en hielo y añadir a la novela del SA. Incubar el filtro a 37 ° C ON. </li></ol> 11. Membrana Lavado <ol><li> Recuperar la solución de hibridación y almacenarla a -20 ° C en una caja de radiactividad-blindaje. </li><li> Enjuague el filtro con tampón de lavado (BM) y lavar a fondo durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Utilice un detector Geiger Mueller para el control de la radiactividad residual en las esquinas de filtro. Cuando emisión de fondo es de alrededor de 5 cps, proceder a la membrana exposición. </li></ol> 12 Detección de la señal <ol><li> Exponer el filtro en las películas de autorradiografía o en una pantalla de Encendido de imágenes moleculares. Revelar señales de procesamiento fotográfico o la conversión digital. </li><li> Analizar la intensidad de la banda por el software de cuantificación dedicado (ImageJ o Optiquant). </li></ol> 13. Membrana Stripping <ol><li> Para eliminar señales primarias, sumergir la membrana en 500 ml de solución de reextracción hirviendo, A continuación incubar a TA durante 1 min. Proceda a la novela (pre) hibridación o almacenar el filtro a -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Aunque nuestra apreciación de la sofisticada entrelazando a través del cual el ARN regula la neurogénesis está aumentando continuamente, las implicaciones mecanicistas de circuiterías basados ​​en ARN que afectan a los nervios biología de células madre, diferenciación neuronal / integración funcional, el desarrollo de las patologías neuronales y cánceres permanecen sin explorar. El mantenimiento de este tipo de redes a través de reinos hace que el potencial de los sistemas genéticos como Drosophila ...

ARN bioquímica ha experimentado avances espectaculares en los últimos años 1. Nuestra comprensión de ARN potencial en el control de la expresión génica ha sido estallar por la identificación de potentes reguladores no codificantes ribo-2, por el descubrimiento de nuevos mecanismos de regulación basados ​​en ARN 3,4 y por una caracterización más profunda de eventos post-transcripcional ya conocidos 5. Toda la biología del ARN en conjunto estos estudios han permitido hacer de manera espectacular la escena, convirtiéndose en un importante tema de investigación en el actual panorama científico. En particular, en los últimos años estamos consiguiendo un sentido de los efectos generalizados del &quot;mundo ARN&quot; en la neurobiología molecular 6, uno de los campos de investigación más dinámicas de ciencias de la vida moderna. En la última década del siglo pasado, el escenario científico en general se ha visto revolucionado por el descubrimiento de la interferencia de ARN 7,8 y de los pequeños RNAs reguladores 9,10con especial atención a microRNAs 11, expresado endógenamente pequeños RNAs no codificantes implicadas en el control de casi todas las funciones celulares como reguladores pleiotrópicos y combinatorias de la expresión génica. Casi 10 años después de miARN descubrimiento inicial en Caenorhabditis elegans por Ambros y laboratorios de Ruvkun, renovada atención se volvió hacia el campo cuando se identificaron un gran número de miRNAs en Drosophila y en las células humanas, así 12-15. Desde entonces, gracias a los métodos transgénicos versátiles, Drosophila melanogaster se ha destacado como un contexto biológico valioso para profundizar en la biosíntesis y la actividad de los genes miARN. Drosophila miRNAs han revelado distintas funciones en los procesos de insectos específicos o conservadas evolutivamente, que abarca desde el envejecimiento para el metabolismo, las vías de señalización , el comportamiento y, por supuesto, la neurogénesis. A lo largo de esta dirección, que recientemente dio a conocer un nuevo enlace de 16 en la co intriganterrelación que ocurre entre el gen maestro gcm / planeo y la vía ARN. El factor de transcripción mosca Gcm / Glide 17-19 constituye un ejemplo único de determinante el destino celular, que dicta la elección destino neuronal glial vs. en multipotentes vuela precursores neuronales 20. Veinte años de larga investigación sobre este tema ha destacado claramente la aparición de múltiples y superpuestas entradas de regulación de la expresión génica que convergen sobre gcm / deslizarse 21-28 para establecer los niveles de umbral necesarios para el equilibrio de la delicada relación entre contrapartes neuronales y gliales durante el desarrollo neural. Descubrimos que la regulación a través de DMEL-miR279 focalización representa un nivel de control que contribuye a la post-transcripcional puesta a punto de gcm expresión 16 / deslizarse. Mejoras metodológicas específicas Globalmente, estas líneas de investigación se han requeridas: a lo largo de años, varias tecnologías originalmente desarrolladas para analizar tradRNAs itional han sido convertidos para cuantificar pequeños ARN no codificantes, como como ensayos de protección de ARNasa, arrays de cDNA 29-31, en ​​tiempo real los métodos de PCR y secuenciación 32-35 36,37. Por otro lado, la recalibración de los enfoques técnicos ha propiciado avances continuos en el campo. Northern Blot de ensayo (NB, o ensayo de transferencia de gel de ARN) constituye un ejemplo representativo: se emplea en gran medida al perfil acumulación de ARN, ya que garantiza tanto a nivel de cuantificación expresión, así como la determinación del tamaño. Sin embargo, la intrínseca pobre sensibilidad del método es limitante cuando se va a aplicar a la baja abundancia de la expresión de genes afinadores, como RNAs cortos. Una consecuencia perjudicial es el requisito de grandes cantidades de ARN total, lo que hace difícil su aplicación a muestras biológicas específicas. Por tales razones, variantes NB específicos para la detección de ARN pequeños se han desarrollado 38-40: nos aprovechamos de un proc NB mejoradoedure 41 (ENB, Mejorada del Norte Blot), mientras que la aclaración de la interacción mencionada entre DMEL-miR279 y gcm / planeo. Este método se basa en una etapa química de reticulación basado en la actividad de un derivado de carbodiimida [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fijar el ácido nucleico sobre soportes sólidos. Carbodiimida es un reticulante versátil conocido para catalizar la formación de enlaces amida entre carboxilo o fosfato grupos activados y grupos amina 42. Esta propiedad puede ser explotada para par de pequeños RNAs covalentemente a través de su grupo 5&#39;-hidroxilo mono-fosforilado a grupos amino en la superficie de las membranas de nylon. La configuración de fijación resultante aumenta la accesibilidad del ácido nucleico inmovilizado y, a su vez, la eficiencia de la hibridación sonda-diana, lo que resulta en la mejora de la detección notable 43. La técnica adquiere una especial relevance en Drosophila estudios moleculares, por el cual la ocurrencia de clases novedosas y distintivas de los pequeños RNAs no codificantes está emergiendo 44. Entre estos, 45,46 rasiRNAs constituyen un subtipo específico de ARN Piwi-interactuar piRNAs (47), que participan en la secuencia específica de silenciamiento génico. Detalles operativos de este método se describen completamente y se visualizaron en lo sucesivo, en relación con el análisis de la microRNAs DMEL-miR279 y miR286 DMEL-y, por primera vez, de una rasiRNA, rasi4. Empujamos a los extremos este método, lo que nos permitió revelar objetivos mal expresados ​​a partir de cantidades mínimas de ARN (menos de 1 mg).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Las últimas décadas han sido testigos de la explosión del interés científico en torno a los mecanismos de control de la expresión génica a nivel de ARN. Esta rama de la biología molecular ha sido impulsado en gran medida por el descubrimiento de los ARN no codificantes como actores importantes en la regulación post-transcripcional. Tal perspectiva revolucionaria ha estado acompañada y provocada por el desarrollo de tecnologías de gran alcance para crear perfiles de expresión de ARN corto, tanto a nivel de alto rendimiento (identificación de todo el genoma) o como análisis de candidato único (acumulación de estado estacionario de las diferentes especies). Aunque varias estrategias estado-de-arte están disponibles actualmente para la dosificación o la visualización de dichas moléculas que huyen, ensayo de transferencia Northern sigue siendo el enfoque elegibles en biología molecular para la evaluación inmediata y precisa de la expresión del ARN. Representa un primer paso hacia la aplicación de las tecnologías más sofisticadas, costosas y, en muchos casos, sigue siendo un método preferencial para ganar fácilmente ideasen la biología de ARN. Aquí repasamos un protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs débilmente expresadas (u otras especies de pequeños ARN de regulación) de Drosophila melanogaster embriones enteros, diseccionó manualmente tejidos / adultos o larvas en células cultivadas in vitro. Se requiere una cantidad muy limitada de ARN y el uso de material de flujo de células aisladas citometría-pueden ser también considerada.

Siguiendo el procedimiento general descrito en el texto y esquemáticamente representado en la Figura 1, se evaluó la expresión de ARNs pequeños de muestras de ARN complejas de diferentes orígenes. En el experimento presentado en la Figura 1, se aisló ARN a partir de 2 células de Drosophila Schneider por extracción con proteinasa K, controladas por la integridad (paso opcional: desnaturalización fraccionamiento en gel de agarosa) y se cargó en doble. Una media de gel s...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.7K vistas.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN. 