Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, il Centre National de la Recherche Scientifique, l&#39;Université de Strasbourg, l&#39;Hôpital de Strasbourg, l&#39;Associazione pour la Recherche sur le Cancer, l&#39;Institut National du Cancer, l&#39;Agence Nationale de la Recherche e la regione dell&#39;Alsazia. Pietro Laneve è stata sostenuta dalla Fondation pour la Recherche Médicale. Attualmente, egli è destinatario di un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) borsa di studio. Spese di pubblicazione sono supportati dalla rete Neurex (TriNeuron - Programma Interreg IV Alto Reno)

1 Raccolta dei campioni <ol><li> Staccare 2 celle semi-aderente di Schneider, (1-5 x 10 6 cellule in media), pipettando e raccolta per centrifugazione (100 xg per 1 min). Nel caso di cellule aderenti coltivate in vitro, li trypsinize in condizioni standard o direttamente raccoglierli da piastre in una conveniente quantità di RNA reagente di estrazione, con l&#39;aiuto di un raschietto cellulare. </li><li> Per la raccolta degli embrioni, crescere i ceppi di Drosophila in gabbie fly e lasciare che gli embrioni si accumulano sui piatti deposizione delle uova. Pulire gli embrioni fuori da un pennello in acqua distillata (dH 2 O), eliminare i detriti da filtrazione setaccio, lavare e recuperare gli embrioni in un flaconcino 48. </li><li> Come tecnica alternativa, sezionare manualmente tessuti / organi. Isolare testicoli (un sistema preferenziale per l&#39;analisi piRNA) da Drosophila addome in tampone fosfato (PBS) allo stereomicroscopio (ingrandimento 20X), utilizzando aghi dissezione o pinze come visCrown perso- nalizzate a Sullivan et al 49. </li><li> Pestello omogeneizzare campioni sulla tossicodipendenza a 0,5 volumi di reagente di estrazione di RNA. </li></ol> 2. RNA Estrazione / Analisi <ol><li> Le istruzioni del fabbricante eseguire l&#39;isolamento di RNA attraverso reagenti in commercio. ATTENZIONE! Agenti di estrazione di RNA sono generalmente tossici e caustici. In alternativa, applicare un protocollo basato-proteinasi K per l&#39;isolamento dell&#39;RNA 50, come segue: <ol><li> Diluire i campioni in 400 ml di arresto Mescolare ed incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Recuperare componenti idrosolubili di fenolo serie: cloroformio: alcool isoamilico e estrazioni cloroformio e di etanolo (EtOH) precipitazione / lavaggio. Aria asciugare i campioni e risospendere in dietilpirocarbonato (DEPC) -treated bidistillata (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Valutare la concentrazione di RNA mediante misurazione spettrofotometrica UV. Anche assicurare la purezza dell&#39;RNA è alta, vicino a 2.0, basEd su A 260 / A 280 lettura. </li><li> Controllare la preparazione di RNA su gel di agarosio denaturante come segue: <ol><li> In un bicchiere pulito, sciogliere 1,2 g di agarosio in 82 ml di DEPC-DDH 2 O, sotto continua agitazione. Far bollire fino a completa dissoluzione. </li><li> Lasciare che la soluzione di gel raffreddare; quando la temperatura raggiunge i 60 ° C aggiungere 10 ml di acido 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) tampone 1X a concentrazione finale (FC), e 8 ml di formaldeide al 37% al 3% FC. ATTENZIONE! La formaldeide è una sostanza cancerogena. </li><li> Versare il gel in una cella per elettroforesi orizzontale. Lasciare che il gel di solidificare sotto una cappa per almeno 1 ora. A seguito di solidificazione, immergere il gel in MOPS 1X. </li><li> Aliquota 2 mg di campione di RNA e 1 mg di Scala (utilizzare un marcatore RNA quando si desidera una valutazione accurata). Aggiungere 3 volumi di agarosio colorante di caricamento (ALD) per RNA e Ladder. Riscaldare a 70 ° C per 5 minuti e raffreddare immediatamente su ghiaccio. CATENZIONE! Contenuti di ALD (etidio bromuro e formammide, vedi Materiali) sono mutageno e corrosivo, rispettivamente. </li><li> Caricare i campioni ed eseguire il gel a 50 V per circa 1 ora con occasionali riciclo buffer. Controllare il modello di RNA frazionamento da visualizzazione UV o immagini gel. Riconoscere bande discrete corrispondenti a 28S e 18S rRNA e tRNA (vedi Figura 1). </li></ol></li><li> Procedere alla Northern Assay o negozio di RNA a -80 ° C. </li></ol> 3. Denaturing acrilamide Gel Preparazione <ol><li> Utilizzare un piccolo apparato per elettroforesi verticale per questo passo frazionamento (dimensioni piastra circa 8 cm x 9 cm, pettine spessore di 0,75 millimetri). </li><li> Montare bicchieri puliti insieme in una cornice di casting. </li><li> Preparare 10 ml di 10% di acrilammide / bis-acrilamide (19: 1) soluzione in MOPS 1X, 7 M urea. Immediatamente prima di versare, aggiungere 100 ml di 10% di persolfato di ammonio e 10 ml di TEMED e rapidamente mescolare la soluzione. ATTENZIONE! L&#39;acrilammide è neurotossico e cancerogeno. </li><li> Versare il gel tra lastre di vetro e inserire con cautela il pettine bene per evitare bolle. Lasciate che il gel di polimerizzare a temperatura ambiente per almeno 45 minuti prima dell&#39;uso. In alternativa, conservare il gel O / N, avvolto in carta da filtro imbevuta di acqua e sigillati in involucro di saran. </li></ol> Preparazione del campione 4 <ol><li> Aliquotare 0,5-20 mg di RNA totale per ogni campione. Se il volume supera 3-4 microlitri, vuoto asciugare il campione. </li><li> Per la determinazione della dimensione, eseguire una aliquota (20-30 cps) del radiomarcato scala della gamma bassa in parallelo ai campioni, come marcatore (vedere paragrafo 4.3 e 4.4 per la preparazione). Trattare in parallelo ai campioni, come descritto al punto 4.5. </li><li> Scala: istituito una reazione in avanti fosfato con 0.1 mg di una scala di 10 bp-passo. Incubare a 37 ° C per 30 minuti e interrompere la reazione aggiungendo acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 20 FC mM. </li><li> Purificare da EtOH precipitazione / lavatrice, aria secca erisospendere in DDH 2 O (circa 100 ml). ATTENZIONE! 32 P è una sorgente radioattiva. </li><li> Per ogni campione aggiungere un uguale volume di acrilammide colorante blu (ABD). Denaturare da riscaldamento a 80 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare su ghiaccio fino caricamento. ATTENZIONE! Formammide (contenuto in ABD) è corrosivo. </li></ol> 5. elettroforetica Frazionamento <ol><li> Rimuovere le lastre di vetro dal supporto colata e correttamente li assemblano in cella elettroforesi. Riempire sia camera interna e esterna con sufficiente tampone di corsa (RB). </li><li> Rimuovere delicatamente il pettine e pre-eseguire il gel a 200 V per 10 min. Prima di caricare i campioni, lavare via i depositi di urea dai pozzetti spruzzando qualche RB attraverso una siringa. </li><li> Utilizzare punte piatte per stratificare i campioni attentamente dal punto 4.5 al fondo di ciascun pozzetto. Controllare i collegamenti anodo e catodo per evitare il funzionamento invertito. Dopo i campioni entrano nel gel a 100 V per 5 minuti, iaumentare l tensione di 200 V. </li><li> Per una lunghezza frazionamento di circa 7 cm, 45 min-lungo periodo è sufficiente. Evitare di blu di bromofenolo (un pigmento inseguimento in ABD) traboccare il gel. </li><li> Visualizza on-gel i frazionati lunghi RNA di etidio bromuro (EtBr) colorazione, come un passaggio facoltativo: <ol><li> Tagliare 2 cm dalla parte superiore del gel e sciacquare brevemente la fetta in DDH 2 O. </li><li> Incubare la fetta gel a temperatura ambiente per 15 minuti con dolce Shacking in RB, EtBr 0,5 mg / ml FC. </li><li> Destain il gel per 15 minuti in RB, visualizzare lunghi rRNA di irradiazione UV o immagini gel. Verificare la presenza di RNA di carico e di qualità (vedi Figura 1, pannello 7). ATTENZIONE! Etidio bromuro è un agente mutageno. </li></ol></li><li> Procedere frattempo assorbente la parte inferiore del gel contenente piccole specie di RNA. </li></ol> 6. Gel Blotting <ol><li> Tagliare 6 pezzi di carta assorbente per adattarsi all&#39;area blotting e un pezzo di uncharge equivalentemembrana di nylon d. Inumidire fogli di carta, membrana e 2 pastiglie blotting in RB. Assicurati di immergere completamente le pastiglie ripetutamente spremitura a RB. </li><li> Rimuovere il gel dall&#39;apparecchio e aprire gli occhiali per mezzo di una spatola. Utilizzare un cutter pulito per rimuovere i pozzi. Mettere un foglio di carta Whatman bagnato sul gel e sollevare delicatamente verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare la membrana di nylon sulla faccia libera del gel. Segna un angolo per orientare il filtro secondo il campione di carico. Completa il &quot;sandwich&quot; (3 pezzi di carta ogni lato). Roll un asta di plastica sulla superficie blot, per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Posizionare la macchia tra due pastiglie blotting e poi nella cassetta assorbente. Montare la cassetta nel modulo assorbente, riempire la camera con RB e verificare il corretto orientamento (membrana di nylon deve stare tra il gel e il capolinea positivo). </li><li> Trasferimento a 20 V per 20 min. Nota: al fine di garantire condizioni omogenee, dopo 10 min aprire il modulo assorbente e rotate il panino di 180 ° prima di completare il trasferimento. </li></ol> 7 Membrana reticolazione <ol><li> Preparare 6 ml di soluzione di reticolazione fresca (XLS). Saturare di 10 cm x 10 cm (più grandi rispetto membrana di nylon) pezzo di carta assorbente con XLS. ATTENZIONE! HCl (un componente di XLS) è altamente corrosivo. </li><li> Smontare la macchia e posizionare la membrana sulla carta da filtro 3MM bagnato. Nota: RNA non deve essere a contatto diretto con la carta satura. Posizionare il filtro e la carta tra due lastre di vetro e avvolgere in saran-wrap. </li><li> Riscaldare la membrana a 60 ° C per 2 ore, seguita da un DDH 2 O lavaggio. Conservare a -20 ° C o procedi alla ibridazione. </li></ol> 8 Membrana prehybridization <ol><li> Se RNA di carico è stata controllata (passo opzionale 5.5), procedere direttamente al ibridazione. Oppure, asportate a 1 cm dalla parte superiore del filtro di nylon, per evitare sonda trasversale hybridizations a lunghi RNA frazionati. </li><li> Preriscaldare 10 ml di soluzione di ibridazione (HS) a 37 ° C. Denaturare 1 mg di sperma di salmone a 95 ° C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio e aggiungere al HS. </li><li> Incubare il filtro in HS a 37 ° C per almeno 1 ora, in rotazione in un fornetto. Controllare che l&#39;RNA-lato del filtro facce HS. </li></ol> 9 Sonda Sintesi <ol><li> Impostare una reazione in avanti fosfato, il 10 pmol di specifici oligonucleotidi antisenso, come descritto in 4.3. </li><li> Aggiungere 5 volumi di Tris-EDTA-NaCl (TEN) tampone di reazione e purificare il primer marcato da nucleotidi non incorporati mediante cromatografia di esclusione gel su colonne G-25 Sephadex (o anche da EtOH precipitazione). L&#39;attività della sonda può essere valutata scintillazione Contatore Liquid. </li></ol> 10 Membrana Ibridazione <ol><li> Sostituire la HS esaurito con un nuovo 10 ml aliquota (preparata e completato come descritto sopra). Riscaldare la sonda a95 ° C per 10 minuti, raffreddare su ghiaccio e aggiungere al romanzo HS. Incubare il filtro a 37 ° C ON. </li></ol> 11 Membrana di lavaggio <ol><li> Recuperare la soluzione di ibridazione e conservarlo a -20 ° C in una scatola-radioattività di schermatura. </li><li> Sciacquare il filtro in lavaggio Buffer (WB) e lavarlo accuratamente per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un rivelatore Geiger Mueller per il controllo radioattività residua agli angoli del filtro. Quando emissione sfondo è di circa 5 cps, procedere alla membrana esposizione. </li></ol> 12 Rilevamento segnale <ol><li> Esporre il filtro sui film autoradiografia o su uno schermo imager ON molecolare. Rivela segnali di elaborazione fotografica o conversione digitale. </li><li> Analizzare l&#39;intensità della banda da un software dedicato quantificazione (ImageJ o Optiquant). </li></ol> 13 Membrana Stripping <ol><li> Per rimuovere i segnali primari, immergere la membrana in 500 ml di soluzione bollente Spogliarello, Poi incubare a temperatura ambiente per 1 min. Procedere al romanzo (pre) ibridazione o conservare il filtro a -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Anche se il nostro apprezzamento per il sofisticato intreccio attraverso il quale l&#39;RNA regola la neurogenesi è in continuo aumento, le implicazioni meccanicistiche di circuiterie di RNA che influenzano neurali biologia delle cellule staminali, differenziamento neuronale / integrazione funzionale, sviluppo di patologie neurali e tumori rimangono inesplorate. Il mantenimento di tali reti attraverso regni rende il potenziale dei sistemi genetici come Drosophila melanogaster strumentale per svelare vie cellul...

RNA biochimica ha sperimentato progressi spettacolari negli ultimi anni 1. La nostra comprensione del potenziale RNA nel controllo dell&#39;espressione genica è stata scoppiata dall&#39;identificazione dei potenti non codificanti Ribo-regolatori 2, dalla scoperta di nuovi a base di RNA-meccanismi regolatori 3,4 e da una caratterizzazione più profonda di eventi post-trascrizionali già noti 5. Tutti biologia dell&#39;RNA insieme questi studi hanno permesso di rendere drammaticamente la scena, diventando un importante soggetto di ricerca nel panorama scientifico attuale. In particolare, negli ultimi anni stiamo ottenendo un senso di impatto pervasivo del &quot;mondo RNA&quot; in neurobiologia molecolare 6, uno dei settori di ricerca più dinamiche della moderna scienza della vita. Nell&#39;ultimo decennio del secolo scorso, lo scenario scientifico generale è stata rivoluzionata dalla scoperta del RNA interference 7,8 e dei piccoli RNA regolatori 9,10con particolare riguardo alle microRNA 11, endogenamente espressi piccoli RNA non codificanti implicati nel controllo di quasi tutte le funzioni cellulari come regolatori pleiotropici e combinatorie di espressione genica. Quasi 10 anni dopo la scoperta iniziale miRNA in Caenorhabditis elegans di Ambros e laboratori di Ruvkun, rinnovata attenzione è stata rivolta al campo quando un alto numero di miRNA sono stati identificati in Drosophila e in cellule umane e 12-15. Da allora, grazie ad approcci transgenici versatili, Drosophila melanogaster è distinto come un contesto biologico prezioso per approfondire miRNA biosintesi e di attività. Drosophila miRNA hanno rivelato funzioni distinte in processi specifici insetti o evolutivamente conservati, che vanno dall&#39;invecchiamento al metabolismo, vie di segnalazione , il comportamento e, naturalmente, neurogenesi. Lungo questa direzione, abbiamo recentemente presentato un link romanzo 16 nella co intriganterrelation che si verificano tra il gene maestro GCM / planata e il percorso di RNA. Il fattore di trascrizione mosca Gcm / Glide 17-19 costituisce un esempio unico del destino delle cellule determinante, che condiziona la scelta destino neuronale gliale vs in multipotenti vola precursori neurali 20. Venti anni di lunghe ricerche su questo argomento ha chiaramente sottolineato la presenza di molteplici e sovrapposte ingressi di regolazione dell&#39;espressione genica convergenti su gcm / glide 21-28 per stabilire i livelli di soglia richiesti per bilanciare il delicato rapporto tra controparti neuronali e gliali durante lo sviluppo neurale. Abbiamo scoperto che la regolamentazione tramite DMEL-miR279 il targeting rappresenta un ulteriore livello di controllo che contribuiscono alla post-trascrizionale messa a punto di GCM / espressione 16 planare. Globalmente, queste linee di ricerca sono necessari miglioramenti metodologici specifici: lungo anni, diverse tecnologie sviluppate originariamente per analizzare tradRNA transitorie, sono stati convertiti per quantificare piccoli RNA non codificanti, come come saggi di RNase protection, array di cDNA 29-31, real-time PCR metodi 32-35 e sequenziamento 36,37. Dall&#39;altro lato, ricalibrazione degli approcci tecnici ha favorito continui progressi nel campo. Northern Blot test (NB, o gel RNA blot) costituisce un esempio rappresentativo: è in gran parte utilizzato per il profilo accumulo di RNA, in quanto garantisce sia a livello di espressione quantitativa nonché la determinazione dimensione. Tuttavia, la scarsa sensibilità intrinseca del metodo è limitante quando è applicato a bassa abbondanti espressione genica accordatori, come piccoli RNA. Una conseguenza dannosa è il requisito di grandi quantità di RNA totale, il che rende difficile la sua applicazione a campioni biologici specifici. Per tali ragioni, le varianti NB specifici per il rilevamento di piccoli RNA sono stati sviluppati 38-40: abbiamo approfittato di una migliore proc NBedure 41 (ENB, avanzato Blot Nord), mentre chiarire la suddetta interazione tra DMEL-miR279 e GCM / planata. Questo metodo si basa su un gradino chimica di reticolazione basato sull&#39;attività di un derivato carbodiimmide [1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide, EDC] fissare acido nucleico su supporti solidi. Carbodiimide è un linker croce versatile conosciuta per catalizzare la formazione di legami ammidici tra attivati ​​gruppi carbossilici o fosfato e gruppi amminici 42. Questa proprietà può essere sfruttata per coppia covalentemente piccoli RNA attraverso il loro gruppo 5&#39;-idrossile mono-amino fosforilata a gruppi sulla superficie delle membrane di nylon. La configurazione risultante attaccamento aumenta l&#39;accessibilità dell&#39;acido nucleico immobilizzato e, a sua volta, l&#39;efficienza di ibridazione sonda-bersaglio, che si traduce in notevole miglioramento rilevamento 43. La tecnica assume particolare relevance in studi molecolari Drosophila, dal quale, al verificarsi di nuovi e distintivi classi di piccoli RNA non codificanti sta emergendo 44. Tra questi, rasiRNAs 45,46 costituiscono uno specifico sottotipo di RNA-piwi interagenti (piRNAs 47), coinvolti nella sequenza-specifico silenziamento genico. Dettagli operativi di questo metodo sono descritti e visualizzati in appresso, relative all&#39;analisi del DMEL microRNA-miR279 e DMEL-miR286 e, per la prima volta, di una rasiRNA, rasi4. Abbiamo spinto all&#39;estremo questo metodo, che ci ha permesso rivelare bersagli poco espressi da quantità minime di RNA (meno di 1 mg).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Gli ultimi decenni hanno visto l&#39;esplosione di interesse scientifico intorno a meccanismi di controllo dell&#39;espressione genica a livello di RNA. Questa branca della biologia molecolare è stato notevolmente alimentata dalla scoperta di RNA non codificanti come principali attori regolazione post-trascrizionale. Tale prospettiva rivoluzionaria è stata accompagnata e innescata dallo sviluppo di tecnologie avanzate per la profilazione dell&#39;espressione RNA breve, sia a livello di high-throughput (identificazione genome-wide) o come l&#39;analisi singolo candidato (accumulo stato stazionario di determinate specie). Anche se diverse strategie state-of-art sono attualmente disponibili per il dosaggio o la visualizzazione di tali molecole in fuga, saggio Northern blot rimane l&#39;approccio ammissibile in biologia molecolare per la valutazione immediata e precisa di espressione dell&#39;RNA. Esso rappresenta un primo passo verso l&#39;applicazione delle più sofisticate tecnologie, costose e, in molti casi, rimane un metodo preferenziale per guadagnare facilmente intuizioniin RNA biologia. Qui PANORAMICA un protocollo efficiente (Enhanced Northern Blot) per rilevare microRNA debolmente espresse (o altre piccole specie di RNA regolatori) da Drosophila melanogaster embrioni interi, sezionato manualmente tessuti / adulti larvali o in cellule coltivate in vitro. È necessaria una quantità molto limitata di RNA e l&#39;uso di materiale dal flusso citometria cellule isolate possono essere anche previsto.

Seguendo la procedura generale descritta nel testo e schematicamente rappresentato in figura 1, abbiamo valutato l&#39;espressione piccoli RNA da campioni di RNA complessi di diversa origine. Nell&#39;esperimento illustrato nella figura 1, l&#39;RNA è stato isolato da di Drosophila Schneider 2 celle di estrazione proteinasi K, controllato per l&#39;integrità (passaggio facoltativo: denaturante di agarosio gel frazionamento) e caricato in doppio. Una metà del gel è stato can...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.7K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA. 