Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, o Centre National de la Recherche Scientifique, da Université de Strasbourg, o Hôpital de Estrasburgo, a Associação pour la Recherche sur le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du, a Agence Nationale de la Recherche ea região da Alsácia. Pietro Laneve tem sido apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale. Atualmente, ele é um receptor de um companheirismo Istituto Italiano Tecnologia (IIT). Os custos de publicação são suportados pela rede Neurex (TriNeuron - Programa Interreg IV Alto Reno)

Coleção 1 Amostra <ol><li> Separe duas células semi-aderente de Schneider, (1-5 x 10 6 células, em média), por pipetagem e colhê-las por centrifugação (100 xg por 1 min). Em caso de in vitro células aderentes cultivadas, trypsinize-los em condições normais ou diretamente coletá-los de placas em uma quantidade conveniente de reagente de extração de RNA, com a ajuda de um raspador de células. </li><li> Para a coleta de embriões, crescer estirpes de Drosophila em gaiolas mosca e deixar acumular embriões em placas de ovos de postura. Wipe embriões fora por um pincel em água destilada (dH2O), descartar detritos por crivo de filtragem, lavagem e recuperação de embriões num frasco 48. </li><li> Como uma técnica alternativa, dissecar manualmente os tecidos / órgãos. Isolar testículos (um sistema preferencial para análise piRNA) de Drosophila abdômen em tampão fosfato (PBS) sob microscópio estereoscópico (aumento de 20X), usando agulhas de dissecação ou fórceps como visualized em Sullivan et al 49. </li><li> Pilão homogeneizar amostras sobre vício de 0,5 volumes de reagente de extração de RNA. </li></ol> 2 Extração de RNA / Análise <ol><li> As instruções do fabricante efectuar o isolamento do RNA através de reagentes comerciais. CUIDADO! Agentes de extração de RNA são geralmente tóxico e corrosivo. Alternativamente, aplicam um protocolo baseado em Proteinase K para o isolamento de ARN de 50, como se segue: <ol><li> Diluir as amostras em 400 ul de paragem Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Recuperar os componentes hidrossolúveis de fenol padrão: clorofórmio: álcool isoamílico e extracções de clorofórmio e de etanol (EtOH) a precipitação / lavagem. Air secar as amostras e ressuspender em dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com dupla destilada (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Avaliar a concentração de ARN por espectrofotometria de UV. Também garantir a pureza RNA é alta, perto de 2.0, based em A 260 / A leitura 280. </li><li> Verificar preparação de ARN em gel de agarose desnaturante, como se segue: <ol><li> Num copo limpo, dissolve-se 1,2 g de agarose em 82 ml de DEPC-ddH2O, sob agitação contínua. Ferva até dissolver completamente. </li><li> Permitir que a solução gel para esfriar; quando a temperatura chega a 60 ° C adicionar 10 ml de ácido 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) buffer para 1X concentração final (FC), e 8 ml de formaldeído a 37% para 3% FC. CUIDADO! formaldeído é uma substância cancerígena. </li><li> Verter o gel numa célula de electroforese horizontal. Permitir que o gel solidifique sob uma capa, durante pelo menos 1 hr. Após solidificação, submergir o gel em MOPS 1X. </li><li> Alíquota de 2 mg de amostra de RNA e 1 mg de Escada (use um marcador de RNA quando avaliação precisa é desejada). Adicionar 3 volumes de corante de carga de agarose (ALD) de ARN e a escada. Aquece-se a 70 ° C durante 5 minutos e imediatamente em gelo fresco. CABuição! Índice de ALD (brometo de etídio e formamida, veja Materiais) são mutagênico e corrosivo, respectivamente. </li><li> Coloque as amostras e correr o gel a 50 V durante cerca de 1 hora com tampão de reciclagem ocasional. Verifique o padrão de RNA fracionamento através da visualização de imagens UV ou gel. Reconhecer bandas discretas correspondentes a 28S e 18S ARNr e ARNt (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Siga para norte Ensaio ou loja de RNA a -80 ° C. </li></ol> 3. desnaturação Acrylamide Gel Preparação <ol><li> Use um pequeno aparelho verticais eletroforética para esta etapa de fracionamento (tamanho da placa de cerca de 8 cm x 9 cm, espessura pente 0,75 milímetros). </li><li> Montar copos limpos juntos em um quadro de qualidade. </li><li> Preparar 10 ml de 10% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) solução de MOPS 1X, 7 M de ureia. Imediatamente antes de servir, adicione 100 ml de 10% de persulfato de amónio e 10 ml de Temed e misture rapidamente a solução. CUIDADOA acrilamida! É neurotóxica e cancerígena. </li><li> Despeje o gel entre as placas de vidro e inserir o pente bem cuidado para evitar bolhas. Deixar o gel de polimerizar à temperatura ambiente durante pelo menos 45 min antes da utilização. Em alternativa, guarde o O gel / N, embrulhado em papel de filtro umedecidos com água e selado em saran wrap. </li></ol> Preparação 4 Amostra <ol><li> Aliquota 0,5-20 ug de ARN total para cada amostra. Se o volume for superior a 3-4 mL, a amostra seca sob vácuo. </li><li> Para a determinação do tamanho, executar-se uma alíquota (20-30 cps) radiomarcado de escada de baixa gama de amostras em paralelo, tal como um marcador (ver secções 4.3 e 4.4 para a preparação). Tratá-lo em paralelo com as amostras, como descrito no passo 4.5. </li><li> Ladder: criar uma reação direta de fosfato utilizando 0,1 g de uma escada de 10 bp-passo. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos e parar a reacção pela adição de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 20 mM de FC. </li><li> Purifica-se por precipitação de EtOH / lavagem, ar seco eressuspender em ddH 2 O (cerca de 100 mL). CUIDADO 32 P é uma fonte radioactiva. </li><li> Para cada amostra, adicionar um volume igual de corante azul de acrilamida (ABD). Desnaturação por aquecimento a 80 ° C durante 5 minutos e deixar arrefecer sobre gelo até à carga. ATENÇÃO! Formamida (conteúdo em ABD) é corrosivo. </li></ol> 5. Electrophoretic Fracionamento <ol><li> Retirar as placas de vidro a partir do suporte de fundição e montá-los adequadamente na célula de electroforese. Preencha ambos câmara interna e externa com suficiente tampão de corrida (RB). </li><li> Remova cuidadosamente o pente e pré-executar o gel a 200 V durante 10 min. Antes de colocar as amostras, lavar depósitos de uréia dos poços por esguichar alguns RB através de uma seringa. </li><li> Utilizar pontas planas para estratificar cuidadosamente amostras de 4,5 passo no fundo de cada poço. Verifique as conexões de ânodo e do cátodo para evitar a execução invertida. Após as amostras de entrar no gel a 100 V durante 5 minutos, increase a tensão de 200 V. </li><li> Para um comprimento de fraccionamento de cerca de 7 cm, a 45 min-longo prazo é suficiente. Evite Azul de bromofenol (um pigmento de rastreamento em ABD) a transbordar o gel. </li><li> Visualizar no gel os RNAs longos fraccionados por brometo de etídio (EtBr) a coloração, como um passo opcional: <ol><li> Cortar a 2 cm da superfície do gel e lavar rapidamente a fatia em ddH 2 O. </li><li> Incubar a fatia de gel, à temperatura ambiente, durante 15 min com Shacking suave em RB, EtBr a 0,5 ug / ml de FC. </li><li> Destain o gel durante 15 minutos em RB, visualizar longos rRNAs por irradiação de UV ou de imagem em gel. Verifique se há carga RNA e qualidade (veja a Figura 1, Painel 7). CUIDADO! Brometo de etídio é um agente mutagênico. </li></ol></li><li> Enquanto isso proceder blotting a parte inferior do gel contendo as espécies de ARN pequenas. </li></ol> 6. Gel Blotting <ol><li> Corte 6 pedaços de papel mata-borrão para caber na área da mancha e uma peça equivalente de uncharged membrana de nylon. Umedeça as folhas de papel, membrana e duas almofadas de mancha em RB. Certifique-se de mergulhar completamente as almofadas por várias vezes apertando-as em RB. </li><li> Remover o gel a partir do aparelho e abrir os vidros por meio de uma espátula. Usar um cortador limpa para remover os poços. Coloque uma folha de papel filtro molhado no gel e cuidado, retire-se. </li><li> Colocar a membrana de nylon sobre a face livre do gel. Marcar um canto para orientar o filtro de acordo com a carga da amostra. Complete o &quot;sanduíche&quot; (3 peças de papel de cada lado). Rolar uma vareta de plástico na superfície da mancha, para remover eventuais bolhas de ar. </li><li> Coloque a mancha entre duas almofadas de mata-borrão e, em seguida, na cassete borrar. Monte o cassete no módulo de mata-borrão, encher a câmara com RB e procure a orientação correta (membrana de nylon deve ficar entre o gel eo terminal positivo). </li><li> Transferir a 20 V durante 20 min. Nota: para garantir condições homogêneas, depois de 10 min abrir o módulo de mata-borrão e rotate o sanduíche em 180 ° antes de completar a transferência. </li></ol> 7 Membrana reticulação <ol><li> Prepare a 6 ml de solução de reticulação fresco (XLS). Saturar com 10 cm x 10 cm (maiores do que uma membrana de nylon) pedaço de papel mata-borrão com XLS. ATENÇÃO! HCl (um componente de XLS) é altamente corrosivo. </li><li> Desmantelar o blot e colocar a membrana sobre o papel de filtro 3MM molhado. Nota: RNA não deve estar em contato direto com o papel saturada. Colocar o filtro eo papel entre duas placas de vidro e enrole em Saran-wrap. </li><li> Aquece-se a membrana a 60 ° C durante 2 horas, seguido por uma lavagem ddH2O. Armazenar a -20 ° C ou prosseguir para a hibridação. </li></ol> 8 Membrana prï¿½hibridaï¿½o <ol><li> Se RNA carregamento tenha sido verificado (etapa opcional 5.5), vá diretamente para a hibridização. Ou então, cortado distância de 1 cm para a parte superior do filtro de nylon, a fim de evitar sonda cruzada hybridizations a RNAs longos fraccionados. </li><li> Pré-aqueça 10 ml de solução de hibridação (HS) a 37 ° C. Desnaturar um mg de esperma de salmão a 95 ° C durante 5 min, em gelo frio e adicionar a SH. </li><li> Incubar o filtro em HS a 37 durante pelo menos 1 hora, sob rotação, em um forno de hibridação. Verifique se o RNA-side do filtro enfrenta HS. </li></ol> 9 Probe Synthesis <ol><li> Configurar uma reação direta de fosfato em 10 pmol de oligonucleotídeo antisense específico, conforme descrito no item 4.3. </li><li> Adicionam-se 5 volumes de Tris-EDTA-NaCl (RT) para o tampão de reacção e purifica-se o iniciador marcado de nucleótidos não incorporados por cromatografia de exclusão em gel numa coluna de Sephadex G-25 (ou também por precipitação de EtOH). Sonda actividade pode ser avaliada por cintilação líquida contador. </li></ol> 10 Membrana Hibridização <ol><li> Substitua o HS exausto com um novo 10 ml alíquota (preparado e complementado conforme descrito acima). Aqueça a sonda em95 ° C durante 10 min, em gelo fresco e adiciona-se a novos HS. Incubar o filtro a 37 ° C NA. </li></ol> 11 Membrana de lavar <ol><li> Recuperar a solução de hibridização e armazená-lo a -20 ° C numa caixa de blindagem de radioactividade. </li><li> Lave o filtro em tampão de lavagem (WB) e lave-o bem por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Use um Geiger Mueller Detector para verificação radioatividade residual nos cantos de filtro. Quando a emissão de fundo é de cerca de 5 cps, proceder à membrana exposição. </li></ol> Detecção de Sinal 12 <ol><li> Exponha o filtro em filmes de autorradiografia ou na tela de um gerador de imagens molecular ON. Revelar sinais por processamento fotográfico ou conversão digital. </li><li> Analisar a intensidade da banda por software quantificação dedicado (ImageJ ou Optiquant). </li></ol> 13 Membrana Stripping <ol><li> Para remover sinais primários, submergir a membrana em 500 mL de solução de decapagem de ebulição, Em seguida incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Proceder-se a novos (pré) hibridação ou armazenar o filtro a -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Embora a nossa apreciação do sofisticado entrelaçamento por meio do qual o RNA regula a neurogênese é cada vez maior, as implicações mecanicistas de circuitos baseados no RNA que afetam a biologia neural de células-tronco, a diferenciação neuronal / integração funcional, desenvolvimento de patologias neurais e cânceres permanecem inexplorados. A manutenção dessas redes através de reinos faz com que o potencial dos sistemas genéticos como Drosophila melanogaster instrumental para desvendar camin...

RNA bioquímica tem experimentado avanços espetaculares nos últimos anos 1. A nossa compreensão de ARN potencial no controlo da expressão de genes tem sido perfurados por a identificação de poderosos noncoding ribo-reguladores 2, com a descoberta de novos mecanismos de regulação baseados no RNA 3,4 e por uma caracterização mais profunda de eventos pós-transcrição já conhecidos 5. Todos biologia RNA juntos estes estudos têm permissão para fazer drasticamente a cena, tornando-se um importante tema de pesquisa na paisagem científica atual. Em particular, nos últimos anos estamos recebendo uma noção do impacto generalizado do &quot;mundo de RNA&quot; em neurobiologia molecular 6, um dos campos de pesquisa mais dinâmicos da ciência da vida moderna. Na última década do século passado, o cenário científico global foi revolucionado pela descoberta da interferência de RNA 7,8 e dos pequenos RNAs regulatórios 9,10nomeadamente em matéria de microRNAs 11, endogenamente expressa pequenos RNAs não-codificantes envolvidos no controle de quase todas as funções celulares como reguladores pleiotrópicos e combinatórias de expressão gênica. Quase 10 anos depois de miRNA descoberta inicial em Caenorhabditis elegans por Ambros e laboratórios da Ruvkun, renovada atenção voltou-se para o campo quando um elevado número de miRNAs foram identificados em Drosophila e em células humanas, bem 12-15. Desde então, graças às abordagens transgênicas versáteis, Drosophila melanogaster tem se destacado como um contexto biológico valioso para aprofundar em miRNA biossíntese e atividade. Drosophila miRNAs têm revelado funções distintas em processos de insetos específicos ou conservados evolutivamente, que vão desde o envelhecimento ao metabolismo, vias de sinalização , comportamento e, é claro, neurogenesis. Ao longo desta direção, que recentemente lançou um novo link de 16 em co intriganterrelation ocorrendo entre o gene mestre GCM / glide ea via RNA. O fator de transcrição fly Gcm / Glide 17-19 constitui um exemplo único de determinante do destino da célula, o que determina a escolha destino neuronal glial vs. em multipotentes voar precursores neurais 20. Vinte anos longa investigação sobre este tema sublinhou claramente a ocorrência de múltiplas e sobrepostas entradas de regulação da expressão gênica convergindo sobre GCM / deslizar 21-28 para estabelecer os limiares necessários para equilibrar a relação delicada entre as partes neuronais e gliais durante o desenvolvimento neural. Descobrimos que a regulação via DMEL-miR279 segmentação representa um novo nível de controle que contribui para a pós-transcricional ajuste fino da GCM / deslizar expressão 16. Melhorias metodológicas específicas Globalmente, estas linhas de pesquisa têm exigido: ao longo dos anos, várias tecnologias originalmente desenvolvidas para analisar tradRNAs itional foram convertidos para quantificar pequenos RNAs não codificantes, como como ensaios de proteção RNase cDNA matrizes 29-31, em tempo real, métodos de PCR e sequenciamento 32-35 36,37. Por outro lado, a recalibração de abordagens técnicas promoveu avanços contínuos no campo. Northern blot (NB, ou ensaio de mancha de gel de ARN) constitui um exemplo representativo: é largamente utilizado para o perfil de acumulação de ARN, uma vez que garante a expressão de nível de quantificação, bem como determinação do tamanho. No entanto, a fraca sensibilidade intrínseca do método é limitante quando é para ser aplicada à expressão do gene finas sintonizadores baixa abundantes, como RNAs curtos. Uma consequência prejudicial é o requisito de grandes quantidades de RNA total, o que torna difícil a sua aplicação para amostras biológicas específicas. Por tais razões, variantes NB específicos para detecção de RNAs pequenos foram desenvolvidos 38-40: aproveitamos uma melhor proc NBedure 41 (ENB, Avançado Northern Blot), enquanto elucidar a interação entre DMEL-miR279 e GCM / glide acima referido. Este método baseia-se num passo de reticulação química com base na actividade de um derivado de carbodiimida [1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fixar o ácido nucleico em suportes sólidos. Carbodiimida é um agente de reticulação versátil conhecida para catalisar a formação de ligações amida entre os grupos carboxilo activados ou fosfato e os grupos de amina 42. Esta propriedade pode ser explorada para acoplar covalentemente pequenos RNAs através do seu grupo 5 &#39;-hidroxilo de mono-fosforilada em grupos amino na superfície de membranas de nylon. A configuração do acessório resultante aumenta a acessibilidade do ácido nucleico imobilizado e, por sua vez, a eficiência da hibridação sonda-alvo, o que resulta em aumento notável de detecção 43. A técnica assume particular relevance em estudos moleculares de Drosophila, pelo que a ocorrência de aulas novas e distintivas de pequenos RNAs não-codificantes está emergindo 44. Entre estes, rasiRNAs 45,46 constituem um subtipo específico de RNAs-interagindo Piwi (piRNAs 47), envolvidos no silenciamento de genes de seqüência específica. Detalhes da operação deste método estão completamente descritos e visualizadas a seguir, em relação com a análise da microRNAs DMEL-miR279 e DMEL-miR286 e, pela primeira vez, de uma rasiRNA, rasi4. Nós levado ao extremo este método, o que nos permitiu revelar alvos mal expressas de quantidades mínimas de RNA (menos de 1 mg).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

As últimas décadas têm testemunhado a explosão do interesse científico em torno de mecanismos de controle de expressão gênica em nível de RNA. Este ramo da biologia molecular tem sido grandemente impulsionado pela descoberta de RNAs não-codificantes como principais intervenientes na regulação pós-transcricional. Tal perspectiva revolucionária tem sido acompanhado e desencadeada pelo desenvolvimento de tecnologias poderosas para criação de perfil curto expressão RNAs, tanto no nível de alto rendimento (número de identificação do genoma) ou como análise-candidato único (acúmulo de estado estacionário de espécies específicas). Embora várias estratégias estado-da-arte estão atualmente disponíveis para a dosagem ou visualizar tais moléculas que fogem, ensaio Northern Blot continua a ser a abordagem elegíveis em biologia molecular para a avaliação precisa e imediata de expressão do RNA. Ela representa um primeiro passo para a aplicação de tecnologias caras mais sofisticados e, em muitos casos, continua a ser um método preferencial para ganhar facilmente descobertasem biologia ARN. Aqui nós overview um protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs fracamente expressos (ou outras espécies de pequenos RNA reguladores) de Drosophila melanogaster embriões inteiros, dissecados manualmente tecidos / adultos ou larvas em células cultivadas in vitro. Uma quantidade muito limitada de RNA é necessária e do uso de material de fluxo de células isoladas de citometria pode ser também prevista.

Seguindo o procedimento geral descrito no texto e esquematicamente representado na Figura 1, avaliou-se a expressão pequenos RNAs de amostras de ARN de complexos de diferentes origens. Na experiência apresentada na Figura 1, o RNA foi isolado a partir de duas células de Schneider de Drosophila por proteinase K, extracção controlados quanto à integridade (passo opcional: desnaturação de fraccionamento em gel de agarose) e carregado em duas vezes. Uma metade do gel foi tr...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K visualizações.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas. 