この作品は、研究所国立デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicaleによってサポートされていました、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究、大学·デストラスブール、HOPITALデストラスブール、協会注ぐラ·ルシェルシュシュルルがん、研究所国立デュがん、アジャンス国立·デ·ラ·ルシェルシュ·地域アルザス。 ピエトロLANEVEはラ·ルシェルシュMédicaleを注ぐ財団によってサポートされています。現在は、イスティトゥーイタリアーノTecnologia（IIT）フェローシップの受信者である。出版費用はNeurexネットワークによってサポートされている（TriNeuron - プログラムINTERREG IVオーバーライン）

1サンプル採取<ol><li>ピペッティングにより半接着性のシュナイダー2細胞、（平均して1〜5×10 6細胞）を、外し、遠心分離（1分間100×g）で、それらを収穫。 in vitroで培養された接着細胞の場合には、標準的な条件下でそれらをトリプシン処理、または直接細胞スクレーパーの助けによって、RNA抽出試薬の好都合な量にプレートからそれらを集める。 </li><li>胚のコレクションのために、フライケージにショウジョウバエ株を成長し、胚は産卵のプレート上に蓄積してみましょう。蒸留水（のdH 2 O）中の絵筆によって胚を拭き取り、ふるいフィルタリングによって破片を廃棄し、バイアル48内の胚を洗浄し、回復。 </li><li>代替手法として、手動で組織/器官を解剖。可視ように解剖針又は鉗子を用いて、実体顕微鏡（20倍倍率）下でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にショウジョウバエ腹部から精巣（piRNAの分析のための優先的なシステム）を単離サリバンら 49にualized。 </li><li>杵は、RNA抽出試薬の0.5容量の中毒の際にサンプルを均質化する。 </li></ol> 2 RNA抽出/分析<ol><li>続いて、製造者の指示は、市販の試薬 ​​を介してRNAの単離を行う。 注意！RNA抽出剤は、通常、有毒で腐食剤である。または、次のように、RNA単離のための50のプロテイナーゼKベースのプロトコルを適用します。 <ol><li>ストップ·ミックスを400μlにサンプルを希釈し、15分間RTでインキュベートする。 </li><li>クロロホルム：イソアミルアルコールおよびクロロホルム抽出およびエタノール（EtOH）沈殿/洗浄により、標準的なフェノールによる水溶性成分を回収。空気のサンプルを乾燥し、ジエチルピロカーボネート（）内に再懸濁し、二重（DD）、H 2 Oを蒸留-処置</li></ol></li><li>紫外線分光光度測定によってRNA濃度を評価する。また、RNAの純度が2.0に近い、高い浅を確保260上のED / 280読書。 </li><li>次のように変性アガロースゲル上でRNA調製を確認します。 <ol><li>きれいなビーカーに、連続撹拌下で、DEPC-のddH 2 O 82 mlのアガロース1.2gを溶解する。完全に溶解するまで煮る。 </li><li>ゲル溶液を冷却して;温度が到達したときに60℃で10倍4 -モルホリンプロパンスルホン酸の10ミリリットルを追加（MOPS）1X最終濃度（FC）にバッファリングし、3％のFCへの37％ホルムアルデヒドの8ミリリットル。 注意！ホルムアルデヒドは発がん性物質である。 </li><li>水平電気泳動セル内にゲルを注ぐ。ゲルは、少なくとも1時間、フードの下で固化させます。固化後、M​​OPS 1Xにジェルを沈める。 </li><li> RNAサンプルおよびラダーを1μgのアリコート2μgの（正確な評価が望まれるときにRNAマーカーを使用します）。 RNAにアガロースローディング色素（ALD）の3容量を追加し、ラダーする。氷上で5分、すぐに涼しい70℃で加熱する。 カリフォルニア州UTION！ALDの内容（エチジウムブロマイドおよびホルムアミド、マテリアルを参照）は、それぞれ、変異原と腐食性である。 </li><li>サンプルをロードし、時折バッファのリサイクルで約1時間、50Vでゲルを実行します。 UV視覚化またはゲルイメージングによるRNA分画パターンを確認してください。 28Sおよび18SのrRNAおよびtRNAのに対応した離散的なバンドを認識します（ 図1を参照）。 </li></ol></li><li> -80℃で、ノーザンアッセイまたはストアRNAに進​​みます。 </li></ol> 3変性アクリルアミドゲルの準備<ol><li>この分画工程（プレートサイズ約8cm×9センチ、櫛の厚さ0.75ミリメートル）のための小さな縦型電気泳動装置を使用してください。 </li><li>鋳造フレームで一緒にきれいなガラスを組み立てます。 </li><li> MOPS 1X、7 M尿素溶液：10％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの10ミリリットル（1〜19）を準備します。すぐに注ぐ前、10％の過硫酸アンモニウムとTEMED10μlを100μlのを追加し、迅速に溶液を混合。 注意！アクリルアミドは神経毒性や発がん性物質である。 </li><li>ガラス板の間にゲルを注ぎ、泡を避けるために、慎重によくコームを挿入します。ゲルは、使用前に少なくとも45分間RTで重合しましょう​​。別の方法として、ゲル、O / N、水に浸したろ紙に包み、サランラップで密封して保管してください。 </li></ol> 4。サンプル調製<ol><li>各サンプルの全RNAのアリコート0.5〜20μgの。ボリューム3-4μlのを超えた場合、真空は、サンプルを乾燥する。 </li><li>サイズ決定のために、マーカーとして（調製のためのセクション4.3および4.4を参照）、サンプルと平行に放射性標識された低域のはしごの一部（20〜30 CPS）を実行します。ステップ4.5で説明したように、試料と平行して、それを扱う。 </li><li>ラダー10bpのステップラダー0.1μgのを使用して、リン酸正反応を設定します。 30分間37℃でインキュベートし、20mMのFCにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加することによって反応を停止させる。 </li><li>エタノール沈殿/洗浄、空気乾燥によって精製し、のddH 2 O（約100μl）中に再懸濁。 注意！32 Pが放射線源である。 </li><li>各試料にアクリルアミド青色色素（ABD）、等量のを追加します。 5分間80℃で加熱することにより変性させ、積載。 注意まで、氷上でクール！ホルムアミド（ABDの内容は）腐食性である。 </li></ol> 5。電気泳動分画<ol><li>キャスティング支持体からガラスプレートを取り外し、適切に電気泳動セルでそれらを組み立てる。十分なランニングバッファー（RB）との内側と外側の両方のチャンバーを埋める。 </li><li>ゆっくりとコームを削除し、10分間、200Vでゲルを事前に実行します。サンプルをロードする前に、注射器を介して、いくつかのRB潮吹きによってウェルから尿素預金を洗い流す。 </li><li>各ウェルの底に段差4.5から慎重に層別サンプルに平らなヒントを参考にしてください。反転実行を回避するために、アノードとカソードの接続を確認してください。サンプルを5分間、100Vでゲルを入力した後、私200 Vに電圧をncrease </li><li>約7cmの分別の長さのために、45分、長い目で見れば十分です。ゲルをオーバーフローするブロモフェノールブルー（ABDト​​ラッキング顔料）は避けてください。 </li><li>オプションのステップとして、臭化エチジウム（EtBrを）染色によって分画し、長いRNAをゲル上、可視化： <ol><li>ゲルの上部から徒歩2センチカットし、簡単にのddH 2 Oのスライスをすすぐ</li><li> RB、EtBrを0.5 / mlのFC緩やかなshackingで15分間、室温でゲルスライスをインキュベートする。 </li><li> RBで15分間ゲルを脱色、UV照射またはゲルイメージングによって長時間のrRNAを可視化する。 RNAのロードと品質を確認してください（パネル7、 図1を参照）。 注意！ジウムブロマイドは変異原である。 </li></ol></li><li>一方、小さなRNA種を含有するゲルの下部をブロッティング進みます。 </li></ol> 6ジェルブロッティング<ol><li> 6ブロッティング領域に合わせて吸い取り紙の作品や荷を下ろすと同等の部分をカットd個のナイロン膜。紙シート、膜とRB 2ブロッティングパッドを湿らせます。完全に繰り返しRBでそれらを絞ることによって、パッドを浸すようにしてください。 </li><li>装置からゲルを取り出し、へらの平均​​によって眼鏡を開きます。井戸を除去するクリーンなカッターを使用してください。ゲル上に湿ったワットマン紙を置き、静かに持ち上げます。 </li><li>ゲルの自由面にナイロン膜を配置します。サンプルの負荷に応じてフィルタを配向するコーナーをマークします。 「サンドイッチ」（3紙片各辺）を完了する。任意の可能な気泡を除去するために、ブロット面にプラスチック製の棒を振る。 </li><li> 2ブロッティングパッド間ブロットを置き、その後ブロッティングカセット内。 （ナイロンメンブレンをゲルと正の末端の間滞在する必要があります）ブロッティングモジュール内にカセットを組み立て、RBで室内を満たし、正しい方向を確認してください。 </li><li> 20分間、20Vで転送します。注：10分ブロッティングモジュールとrを開いた後、均質な条件を確保するために転送が完了する前に、180°のサンドイッチをotate。 </li></ol> 7。メンブレン架橋<ol><li>新鮮な架橋溶液（XLS）の6ミリリットルを用意してください。 XLSを吸い取り紙10cmの×10センチメートル（ナイロン膜よりも大きい）部分を飽和させる。 注意！塩酸（XLSの構成要素）は非常に腐食性である。 </li><li>ブロットを解体し、湿った3MMろ紙上の膜を配置します。注：RNAが飽和紙に直接接触してはいけません。 2枚のガラス板との間にフィルタや紙を置き、サラン·ラップで包む。 </li><li>のddH 2 O洗浄を2時間60℃で膜を加熱する。 -20℃で保存してくださいまたはハイブリダイゼーションに進みます。 </li></ol> 8。メンブレンプレハイ<ol><li> RNA負荷が（オプションのステップ5.5）をチェックされている場合は、直接ハイブリダイゼーションに進みます。さもないと、プローブのクロスhybridizatioを避けるために、ナイロンフィルターの上部から離れて1cmに切る長いRNAを分画しするためのナノ秒。 </li><li> 37℃でのハイブリダイゼーション溶液（HS）を10mlの予熱。 5分間、95℃でのサケ精子1mgを変性させ、氷上でクールでHSに追加する。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンで回転下で、少なくとも1時間、37℃でのHSでフィルタをインキュベートする。フィルターのRNA側はHSに直面していることを確認してください。 </li></ol> 9。プローブ合成<ol><li> 4.3で説明したように、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド10pmolの上のリン正反応を設定します。 </li><li> （エタノール沈殿によっても、または）、トリス-EDTA-NaClを（TEN）の5容量を反応にバッファリングし、G-25セファデックスカラム上でのゲル排除クロマトグラフィーによる取り込まれなかったヌクレオチドから標識されたプライマーを浄化追加します。プローブの活性は、液体シンチレーションカウンターにより評価することができる。 </li></ol> 10メンブレンハイブリダイゼーション<ol><li>新鮮な10ミリリットルの分量（上記のように調製し、補完）で排気し、HSを交換してください。でプローブを加熱95℃で10分間、氷上でクールで小説HSに追加する。 37℃ONでフィルターをインキュベートする。 </li></ol> 11膜洗浄<ol><li>ハイブリダイゼーション溶液を回収し、放射能遮蔽ボックスに-20℃で保管してください。 </li><li>洗浄緩衝液（WB）でフィルタをすすぎ、室温で10分間、それを徹底的に洗ってください。 </li><li>フィルターコーナーに残留放射能をチェックするためにガイガーミュラー検出器を使用してください。背景放射は約5 cpsです場合には、博覧会、膜に進みます。 </li></ol> 12信号検出<ol><li>オートラジオグラフィーフィルム上または分子イメージャ画面をONにフィルタを公開します。写真処理やデジタル変換した信号を明​​らかにした。 </li><li>専用の定量化ソフトウェア（ImageJのかOptiquant）によるバンド強度を分析します。 </li></ol> 13メンブレンストリップ<ol><li>剥離液の沸騰の500mlに浸し、膜を一次信号を除去するために、、次いで1分間RTでインキュベートする。小説（プレ）ハイブリダイゼーションに進んで、-20℃でのフィルターを格納します。 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

RNAは神経発生を調節を通して絡み合う高度化の感謝を連続的に増加しているが、神経幹細胞生物学、神経分化/機能統合、神経病理および癌の発生に影響を与えるRNAに基づく回路網の機構影響は未踏のまま。 ショウジョウバエは、短い非コードRNAおよび転写因子が主要な分子の選手と見なされている未踏細胞経路を解明するために尽力キイロとしての王国を通して、このような?...

RNAの生化学は、過去数年1で壮大な進歩を経験している。遺伝子発現の制御におけるRNA電位の私たちの理解は、新規RNAに基づく調節機構3,4の発見によって、すでに知られている転写後事象のより深い特性評価により、強力な非コードリボ-レギュレータ2の同定により破裂されました5。すべて一緒にこれらの研究は、現在の科学的景観における主要な研究対象となってきて、RNAの生物学は劇的場面を作ることができました。特に、ここ数年、私たちは、分子神経生物学6、現代の生命科学の中で最もダイナミックな研究領域の一つの「RNAワールド」の蔓延インパクト感を得ている。前世紀の最後の10年間では、全体的な科学的なシナリオは、RNA干渉7,8の発見によって、小さな調節RNA 9,10の革命をもたらしてきたマイクロRNA 11への特定に関しては、内因的遺伝子発現の多面的コンビナトリアル規制当局などのほぼすべての細胞機能の制御に関与する小さな非コードRNAを発現した。 miRNAの高い番号は、ショウジョウバエで、同様に12〜15ヒト細胞で同定された際に約10年アンブロスとRuvkunのラボによる線虫（Caenorhabditis elegans）におけるmiRNA最初の発見後に、再び注目がフィールドになっていた。それ以来、汎用性の高い遺伝子導入のアプローチのおかげで、 キイロショウジョウバエは、miRNAの生合成と活動掘り下げるための貴重な生物学的状況として際立っていました。 ショウジョウバエ miRNAがシグナル伝達経路、代謝に高齢化から及ぶ、特定昆虫または進化的に保存されたプロセスで異なる機能を明らかにした、行動や、もちろん、神経発生。この方向に沿って、私たちは最近、興味深い共同で新たなリンク16を発表マスター遺伝子GCM /グライドとRNA合成経路との間に発生するrrelation。フライ転写因子GCM /グライド17-19は神経前駆体20を飛行多能においてニューロンの運命の選択対グリアを規定する細胞運命決定因子のユニークな例を構成している。二十年このトピックに関する長期研究は明らかに複数の発生を下線とGCM /神経発達中の神経細胞とグリアカウンターパートとの間の微妙な比率のバランスをとるために必要な閾値レベルを確立するために21-28 グライドにわたって収束遺伝子発現制御の入力が重複しています。 私たちは、DMEL-miR279ターゲティング経由その規制がGCM /発現16 グライドの転写後の微調整に寄与し、さらに制御レベルを表して発見した。世界的には、これらの研究の行は、特定の方法論的な改善を必要とした。年に沿って、いくつかの技術が独自に開発したトラッドを分析するitional RNAは、RNアーゼ保護アッセイなどのような小さな非コーディングRNA、cDNAアレイ29-31、リアルタイムPCR法32〜35および配列36,37を定量化するために変換されている。反対側には、技術的なアプローチの再キャリブレーションは、現場での連続進歩を助長しています。 ノーザンブロットアッセイ（NB、またはRNAゲルブロットアッセイ）代表のインスタンスを構成している：それは、発現レベルの定量だけでなく、サイズ決定の両方を確保しているので、それは主に、RNA蓄積をプロファイルするために使用される。しかし、この方法の本質的な乏しい感度は、それが短いRNAのような、低豊富な遺伝子発現細かいチューナーに適用する場合に限定される。有害な結果は、特定の生物学的試料への応用は困難になり、総RNA、大量の要件である。このような理由から、低分子RNA検出のための具体的なNB変異体は38〜40が開発されている：私たちは改善されたNB procを利用したedure 41（ENB、拡張ノーザンブロット）、DMEL-miR279およびGCM /グライドの間、上記の相互作用を解明している。 この方法は、固体支持体上に核酸を固定する[EDC、1 - エチル-3-（3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド]カルボジイミド誘導体の活性に基づく化学的架橋工程に依存している。カルボジイミド活性化カルボキシルまたはリン酸基およびアミン基42との間のアミド結合の形成を触媒することが知られている汎用性のクロスリンカーである。このプロパティは、ナイロン膜の表面にアミノ基に自分のモノリン酸化された5&#39;-ヒドロキシル基を介して共有結合小さなRNAに活用することができる。得られ取付け構成が顕著検出強化43を生じる固定化された核酸と、今度は、プローブ-標的ハイブリダイゼーションの効率のアクセシビリティを増大させる。 技術は、特定のrelevancを想定しているショウジョウバエ分子的研究におけるeは、それによって、小さな非コードRNAの新規で独特のクラスの発生が44を浮上している。これらの中でも、rasiRNAs 45,46は配列特異的遺伝子サイレンシングに関与PIWI相互作用性RNA（piRNAは47）の特定のサブタイプを構成する。この方法の手術の詳細は十分に説明し、以下に可視化し、マイクロRNA DMEL-miR279とDMEL-miR286の分析に相対的で、初めて、1 rasiRNA、rasi4のされています。私たちは、RNA（1μg未満）の最小量から不十分な表現の目標を明らかにすることができたこの方法を、極端に押した。

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

最後の十年は、RNAレベルでの遺伝子発現制御機構の周りの科学的関心の爆発を目撃した。分子生物学のこのブランチは大幅に転写後調節の主要なプレーヤーとして非コードRNAの発見に支えられてきた。このような革新的な観点は、ハイスループットレベル（ゲノムワイド同定）または単一の候補解析（特定の種の定常状態の蓄積）の両方、を伴うと短いRNA発現をプロファイリングするための強力な技術の開発によってトリガされている。いくつかの最先端技術の戦略は投薬や、逃げるの分子を可視化するために現在利用可能であるが、ノーザンブロットアッセイは、RNA発現の迅速かつ正確な評価のための分子生物学の適格なアプローチのまま。それは、より洗練され、コストのかかる技術の応用に向けた最初のステップであると、多くの場合、簡単に洞察を得るための優先方法のままRNA生物学へ。ここでは、手動で幼虫/成体組織を切開し、またはインビトロ培養細胞で 、胚全体キイロショウジョウバエから弱く発現マイクロRNA（または他の小さな調節RNA種）を検出する（ノーザンブロット拡張）効率的なプロトコルの概要。 RNAの非常に限られた量が必要とされ、フローサイトメトリー、単離された細胞からの材料の使用も想定することができる。

全体的な手順テキストで説明し、 図1に概略的に表現さに従うことによって、私たちは異なる起源の複雑なRNAサンプルから低分子RNAの発現を評価した。 （：アガロースゲル分画変性任意の工程）と、二重にロードされ、図1に示す実験では、RNAは、整合性をチェックプロテイナーゼK抽出によるショウジョウバエシュナイダー2細胞から単離した。ゲルの半分は、...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.7K ビュー.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. 本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。 