Ce travail a été financé par l&#39;Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, le Centre National de la Recherche Scientifique, de l&#39;Université de Strasbourg, l&#39;Hôpital de Strasbourg, l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer, l&#39;Institut National du Cancer, l&#39;Agence Nationale de la Recherche et la Région Alsace. Pietro Laneve a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale. Actuellement, il est le bénéficiaire d&#39;une Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de fraternité. Les frais de publication sont pris en charge par le réseau Neurex (TriNeuron - Programme Interreg IV Rhin Supérieur)

Collection 1 de l&#39;échantillon <ol><li> Détachez 2 cellules de semi-adhérent, Schneider (1-5 x 10 6 cellules en moyenne), à la pipette et les récolter par centrifugation (100 g pendant 1 min). Dans le cas de cellules adhérentes en culture in vitro, trypsiniser eux dans des conditions standard ou directement à percevoir ces plaques dans une quantité convenable d&#39;ARN réactif d&#39;extraction, par l&#39;aide d&#39;un grattoir à cellules. </li><li> Pour la collecte des embryons, développer des souches de drosophile dans des cages à mouches et laisser embryons s&#39;accumulent sur ​​des plaques de ponte. Essuyez embryons hors d&#39;un pinceau dans de l&#39;eau distillée (dH 2 O), jeter des débris par filtrage tamis, rincer et récupérer des embryons dans un flacon 48. </li><li> Comme une technique alternative, disséquer manuellement tissus / organes. Isoler les testicules (un système préférentiel pour l&#39;analyse piRNA) de la drosophile abdomen dans un tampon phosphate salin (PBS) sous un stéréomicroscope (grossissement 20X), par l&#39;utilisation d&#39;aiguilles de dissection ou de pinces visualized dans Sullivan et al 49. </li><li> Pilon homogénéiser les échantillons sur la dépendance de 0,5 volumes de réactif d&#39;extraction d&#39;ARN. </li></ol> 2 Extraction de l&#39;ARN / Analyse <ol><li> Les instructions du fabricant suivantes effectuent isolement de l&#39;ARN par les réactifs commerciaux. ATTENTION! Agents d&#39;extraction d&#39;ARN sont généralement toxique et caustique. En variante, appliquer un protocole basé sur la protéinase K pour l&#39;isolement de l&#39;ARN 50, comme suit: <ol><li> Diluer les échantillons dans 400 ul de mélange d&#39;arrêt et incuber à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Récupérer les composants hydrosolubles de standard au phénol: chloroforme: alcool isoamylique et l&#39;extraction dans le chloroforme et par l&#39;éthanol (EtOH) précipitation / lavage. Air sécher les échantillons et remettre en suspension dans de diéthyle (DEPC) traités par une double distillation (dd) H 2 O. </li></ol></li><li> Évaluer la concentration d&#39;ARN par mesure spectrophotométrique UV. Assurez-vous également la pureté de l&#39;ARN est élevé, proche de 2,0, based sur A 260 / A 280 lecture. </li><li> Vérifiez la préparation de l&#39;ARN sur gel d&#39;agarose dénaturant comme suit: <ol><li> Dans un bêcher propre, dissoudre 1,2 g d&#39;agarose dans 82 ml de DEPC-DDH 2 O, sous agitation continue. Faire bouillir jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Laisser la solution de gel à refroidir; lorsque la température atteint 60 ° C, ajouter 10 ml d&#39;acide 4-10X morpholinepropanesulfonic (MOPS) tampon à 1X concentration finale (FC), et 8 ml de formaldéhyde à 37% à 3% FC. ATTENTION! formaldéhyde est cancérogène. </li><li> Verser le gel dans une cellule d&#39;électrophorèse horizontale. Laisser le gel se solidifier sous une hotte pendant au moins 1 h. Après solidification, immerger le gel dans MOPS 1X. </li><li> Aliquote 2 pg d&#39;échantillon d&#39;ARN et 1 pg de contacts (utiliser un marqueur d&#39;ARN lorsque l&#39;évaluation précise est souhaitée). Ajouter 3 volumes de colorant de chargement agarose (ALD) à l&#39;ARN et à l&#39;échelle. Chauffer à 70 ° C pendant 5 min, puis refroidir sur glace. CAUTION! Contenu de ALD (de bromure d&#39;éthidium et formamide, voir Matériaux) sont mutagène et corrosif, respectivement. </li><li> Charger les échantillons et exécuter le gel à 50 V pendant environ 1 heure avec recyclage de tampon occasionnelle. Vérifiez le motif ARN de fractionnement par visualisation UV ou l&#39;imagerie de gel. Reconnaître bandes discrètes correspondant à 28S et 18S ARNr et ARNt (voir Figure 1). </li></ol></li><li> Passez à l&#39;Essai du Nord ou de l&#39;ARN de conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. dénaturation gel d&#39;acrylamide Préparation <ol><li> Utilisez un petit appareil vertical électrophorétique pour cette étape de fractionnement (de la taille de la plaque d&#39;environ 8 cm x 9 cm, épaisseur de 0,75 mm peigne). </li><li> Assembler verres propres ensemble dans un cadre de coulée. </li><li> Préparer 10 ml de 10% d&#39;acrylamide / bis-acrylamide (19: 1) solution de MOPS 1x, 7 M d&#39;urée. Juste avant la coulée, ajouter 100 ul de 10% de persulfate d&#39;ammonium et 10 ul de TEMED et mélanger rapidement la solution. ATTENTION! L&#39;acrylamide est neurotoxique et cancérogène. </li><li> Verser le gel entre des plaques de verre et insérer le peigne bien soin d&#39;éviter les bulles. Laisser polymériser le gel à température ambiante pendant au moins 45 min avant utilisation. Autrement, stockez le gel O / N, enveloppé dans du papier filtre imbibé d&#39;eau et scellé dans du papier saran. </li></ol> Préparation de l&#39;échantillon 4 <ol><li> Aliquote de 0,5 à 20 ug d&#39;ARN total pour chaque échantillon. Si le volume dépasse 3-4 pi, vide sécher l&#39;échantillon. </li><li> Pour la détermination de la taille, exécutez une aliquote (20-30 cps) de radiomarqué échelle du bas-gamme en parallèle aux échantillons, comme un marqueur (voir rubrique 4.3 et 4.4 pour la préparation). Traiter en parallèle des échantillons, comme décrit dans l&#39;étape 4.5. </li><li> Ladder: mettre en place une réaction directe de phosphate en utilisant 0,1 ug d&#39;une échelle de 10 pb-étape. Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes et stopper la réaction par addition d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 20 mM FC. </li><li> Purifier par précipitation avec EtOH / lavage, l&#39;air sec etremettre en suspension dans le trou DDH 2 O (environ 100 pi). ATTENTION! 32 P est une source radioactive. </li><li> Pour chaque échantillon ajouter un volume égal de colorant bleu acrylamide (ABD). Dénaturer par chauffage à 80 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur glace jusqu&#39;au chargement. ATTENTION! Formamide (contenu dans ABD) est corrosif. </li></ol> 5. électrophorétique fractionnement <ol><li> Retirer les plaques de verre à partir de la pièce moulée de support et les assembler correctement dans la cellule d&#39;électrophorèse. Remplissez les deux chambre intérieure et extérieure avec suffisamment de tampon de migration (RB). </li><li> Retirez délicatement le peigne et pré-exécuter le gel à 200 V pendant 10 min. Avant le chargement des échantillons, laver les dépôts d&#39;urée des puits en injectant une partie RB moyen d&#39;une seringue. </li><li> Utiliser des embouts plats à stratifier attentivement échantillons de l&#39;étape 4.5 au fond de chaque puits. Vérifiez les connexions d&#39;anode et de la cathode à éviter un fonctionnement inversé. Après que les échantillons entrent dans le gel à 100 V pendant 5 min, iUGMENTATION la tension de 200 V. </li><li> Pour une longueur de fractionnement d&#39;environ 7 cm, une 45-min est suffisante à long terme. Évitez bleu de bromophénol (un pigment de suivi dans ABD) à déborder le gel. </li><li> Visualisez sur le gel de longues ARN fractionnées par le bromure d&#39;éthidium (EtBr) de coloration, comme une étape facultative: <ol><li> Coupez 2 cm du haut du gel et les rincer rapidement la tranche dans le trou DDH 2 O. </li><li> Incuber la tranche de gel à température ambiante pendant 15 min avec shacking douce dans RB, du BET 0,5 pg / ml FC. </li><li> Destain le gel pendant 15 minutes à RB, visualiser longues ARNr par irradiation UV ou l&#39;imagerie de gel. Vérifiez pour la charge d&#39;ARN et de la qualité (voir la figure 1, Groupe 7). ATTENTION! Bromure d&#39;éthidium est un agent mutagène. </li></ol></li><li> Pendant ce temps passer buvard la partie inférieure du gel contenant de petites espèces d&#39;ARN. </li></ol> 6. Gel Blot <ol><li> Coupez 6 morceaux de papier buvard pour s&#39;adapter à la zone de blot et une pièce équivalente de uncharged membrane de nylon. Humidifiez les feuilles de papier, membrane et 2 tampons buvards de RB. Assurez-vous de tremper complètement les plaquettes en les serrant à plusieurs reprises dans RB. </li><li> Retirer le gel de l&#39;appareil et ouvrir les verres en moyenne d&#39;une spatule. Utilisez un coupe propre pour enlever les puits. Placez une feuille de papier Whatman humide sur le gel et soulevez-le délicatement. </li><li> Placer la membrane de nylon sur la face libre du gel. Marquer un coin pour orienter le filtre selon le chargement des échantillons. Remplissez le &quot;sandwich&quot; (3 morceaux de papier de chaque côté). Rouler une tige en plastique sur la surface de la tache, pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Placez la tache entre deux sous-main et puis dans la cassette buvard. Monter la cassette dans le module buvard, remplir la chambre avec RB et vérifier l&#39;orientation correcte (membrane de nylon doit rester entre le gel et le terminus positif). </li><li> Transfert à 20 V pendant 20 min. Remarque: pour assurer des conditions homogènes, après 10 min ouvrir le module buvard et rOtate le sandwich de 180 ° avant de terminer le transfert. </li></ol> 7. membrane réticulation <ol><li> Préparer 6 ml de solution de reticulation frais (XLS). Saturer 10 cm x 10 cm (plus grand que membrane de nylon) morceau de papier buvard avec XLS. ATTENTION! HCl (un composant de XLS) est très corrosif. </li><li> Démonter la tache et placer la membrane sur le papier filtre 3MM humide. Remarque: l&#39;ARN doit pas être en contact direct avec le papier saturé. Placer le filtre et le papier entre deux plaques de verre et l&#39;envelopper dans saran-wrap. </li><li> Chauffer la membrane à 60 ° C pendant 2 heures, suivi par un trou DDH 2 O lavage. Stocker à -20 ° C ou de procéder à l&#39;hybridation. </li></ol> 8. membrane Préhybridation <ol><li> Si la charge d&#39;ARN a été vérifiée (étape optionnelle 5.5), passez directement à l&#39;hybridation. Ou bien, Coupez 1 cm de la partie supérieure du filtre en nylon, pour éviter sonde transversale hybridizations à longs ARN fractionnées. </li><li> Préchauffer 10 ml de solution d&#39;hybridation (SH) à 37 ° C. Dénaturer 1 mg de sperme de saumon à 95 ° C pendant 5 min, refroidir sur glace et ajouter à HS. </li><li> Incuber le filtre en HS à 37 ° C pendant au moins 1 h, en rotation dans un four à hybridation. Vérifiez que l&#39;ARN-côté du filtre face HS. </li></ol> 9 Sonde de synthèse <ol><li> Mettre en place une réaction directe de phosphate à 10 pmol d&#39;oligonucléotide antisens spécifique, comme décrit dans 4.3. </li><li> Ajouter 5 volumes de tampon Tris-EDTA-NaCl (TEN) de tampon à la réaction et on purifie le amorce marquée à partir de nucleotides non incorporés par Chromatographie d&#39;exclusion sur gel sur des colonnes de Sephadex G-25 (ou encore par précipitation par EtOH). l&#39;activité de la sonde peut être évaluée par compteur à scintillation liquide. </li></ol> 10 membrane d&#39;hybridation <ol><li> Remplacez le HS épuisé avec une nouvelle aliquote de 10 ml (préparé et complété comme décrit ci-dessus). Chauffer la sonde à95 ° C pendant 10 mn, laisser refroidir sur glace et ajouter à nouveau HS. Incuber le filtre à 37 ° C sous tension. </li></ol> 11 Membrane à laver <ol><li> Récupérer la solution d&#39;hybridation et de le stocker à -20 ° C dans une boîte de radioactivité blindage. </li><li> Rincez le filtre à tampon de lavage (BM) et le laver à fond pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Utiliser un détecteur Geiger Mueller pour le contrôle de la radioactivité résiduelle dans les coins de filtre. Lorsque l&#39;émission de fond est d&#39;environ 5 cps, procéder à la membrane exposition. </li></ol> Détection du signal 12 <ol><li> Exposer le filtre films d&#39;autoradiographie ou sur un écran moléculaire imageur ON. Révéler signaux de traitement photographique ou de la conversion numérique. </li><li> Analyser l&#39;intensité de la bande par le logiciel de quantification dédié (ImageJ ou Optiquant). </li></ol> 13 Membrane dénuder <ol><li> Pour éliminer les signaux primaires, plonger la membrane dans 500 ml d&#39;une solution bouillante à dénuder, Puis incuber à température ambiante pendant 1 min. Passez à nouveau (pré) hybridation ou entreposer le filtre à -20 ° C. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bien que notre appréciation de l&#39;entrelacement sophistiqué par lequel l&#39;ARN régule la neurogenèse est en constante augmentation, les implications mécanistiques de circuiteries à base d&#39;ARN qui affectent neurones biologie des cellules souches, la différenciation neuronale / intégration fonctionnelle, le développement de pathologies et cancers de neurones restent inexplorées. Le maintien de ces réseaux par les royaumes rend le potentiel des systèmes génétiques Drosophila melanogaster con...

ARN biochimie a connu progrès spectaculaires au cours des dernières années 1. Notre compréhension du potentiel de l&#39;ARN dans le contrôle de l&#39;expression génique a été éclaté par l&#39;identification des puissants ribo-régulateurs non codants 2, par la découverte de nouveaux mécanismes de régulation à base d&#39;ARN 3,4 et par une caractérisation détaillée des événements post-transcriptionnelle déjà connues 5. Tous biologie de l&#39;ARN ensemble, ces études ont permis de faire considérablement la scène, devenant un important sujet de recherche dans le paysage scientifique actuel. En particulier, au cours des dernières années, nous obtenons une idée de l&#39;impact profond du «monde de l&#39;ARN&quot; sur la neurobiologie moléculaire 6, l&#39;un des domaines de recherche les plus dynamiques en sciences de la vie moderne. Dans la dernière décennie du siècle passé, le scénario scientifique globale a été révolutionné par la découverte de l&#39;interférence ARN 7,8 et des petits ARN régulateurs 9,10notamment en ce qui concerne les micro-ARN 11 exprimé de manière endogène de petits ARN non codantes impliquées dans le contrôle de la quasi-totalité des fonctions cellulaires en tant que régulateurs pléiotropes et combinatoires de l&#39;expression génique. Près de 10 ans après la découverte initiale miARN dans Caenorhabditis elegans par Ambros et les laboratoires de Ruvkun, une attention renouvelée a été tourné dans le champ quand un grand nombre de miARN ont été identifiés chez la drosophile et dans les cellules humaines ainsi 12-15. Depuis lors, grâce à des approches transgéniques polyvalents, Drosophila melanogaster s&#39;est distingué comme un contexte biologique précieux pour se plonger dans la biosynthèse des miARN et de l&#39;activité. Drosophila miARN ont révélé des fonctions distinctes dans les processus d&#39;insectes spécifiques ou évolutives conservées, allant de vieillissement de métabolisme, les voies de signalisation , le comportement et, bien sûr, la neurogenèse. Le long de cette direction, nous avons récemment dévoilé un lien nouveau 16 dans le co intriganterrelation survenant entre le gène maître gcm / descente et la voie de l&#39;ARN. Le facteur de transcription Gcm mouche / Glide 17-19 constitue un exemple unique de destin cellulaire déterminant, qui dicte le choix de gliale vs destinée neuronale dans multipotentes voler précurseurs neuraux 20. Vingt ans de longues recherches sur ce sujet a clairement souligné l&#39;apparition de multiples entrées et se chevauchent de la régulation de l&#39;expression des gènes convergent sur ​​gcm / glisser 21-28 pour établir les seuils requis pour équilibrer le rapport délicat entre homologues neuronales et gliales au cours du développement neuronal. Nous avons découvert que la régulation par DMEL-miR279 ciblage représente un niveau supplémentaire de contrôle contribuant à la post-transcriptionnelle de réglage fin de gcm / glisser expression 16. Améliorations méthodologiques spécifiques à l&#39;échelle mondiale, ces lignes de recherche ont requis: le long des années, plusieurs technologies initialement développées pour analyser tradARN tradition- ont été convertis pour quantifier les petits ARN non codantes, comme tant RNase de protection, d&#39;ADNc tableaux 29-31, méthodes de PCR en temps réel 32-35 et le séquençage de 36,37. De l&#39;autre côté, le recalibrage des approches techniques a favorisé progrès continus dans le domaine. Northern Blot dosage (NB, ou une analyse par transfert sur gel d&#39;ARN) constitue un exemple représentatif: il est largement utilisé pour le profil de l&#39;accumulation de l&#39;ARN, car elle assure à la fois le niveau d&#39;expression de quantification, ainsi que la détermination de la taille. Cependant, la faible sensibilité intrinsèque de la méthode est de limiter quand il est appliqué à l&#39;expression des gènes tendeurs faible abondance, comme les ARN courts. Une conséquence néfaste est l&#39;exigence de grandes quantités d&#39;ARN total, ce qui rend difficile son application à des échantillons biologiques spécifiques. Pour ces raisons, les variantes NB spécifiques pour la détection des ARN petit ont été développés 38-40: nous avons profité d&#39;un proc NB amélioréeedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), tandis que l&#39;élucidation du jeu susmentionné entre DMEL-miR279 et gcm / descente. Cette méthode repose sur une étape de réticulation chimique sur la base de l&#39;activité d&#39;un dérivé de carbodiimide [1-éthyl-3-(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, EDC] pour fixer l&#39;acide nucléique sur des supports solides. Carbodiimide est un agent de réticulation polyvalent connu pour catalyser la formation de liaisons amide entre les groupes carboxyle activés ou phosphate et des groupes amine 42. Cette propriété peut être exploitée pour coupler de manière covalente par l&#39;intermédiaire de leurs petits ARN groupe 5&#39;-hydroxyle mono-phosphorylé aux groupes amino à la surface des membranes de nylon. La configuration résultant de fixation augmente l&#39;accessibilité de l&#39;acide nucléique immobilisé et, par conséquent, l&#39;efficacité de l&#39;hybridation sonde-cible, ce qui conduit à l&#39;amélioration remarquable de détection 43. La technique suppose notamment relevance dans des études moléculaires de Drosophila, qui par l&#39;apparition de nouvelles catégories distinctes et de petits ARN non codants de 44 émerge. Parmi ceux-ci, rasiRNAs 45,46 constituent un sous-type spécifique des ARN Piwi-interacting (piRNAs 47), impliqués dans l&#39;inactivation de gène spécifique à la séquence. Détails opérationnels de cette méthode sont décrits en détail et visualisés ci-après, par rapport à l&#39;analyse de la microARN DMEL-miR279 et DMEL-miR286 et, pour la première fois, d&#39;une rasiRNA, rasi4. Nous avons poussé à l&#39;extrême cette méthode, qui nous a permis révélant des objectifs mal exprimés à partir des quantités minimes de l&#39;ARN (moins de 1 ug).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Les dernières décennies ont vu l&#39;explosion de l&#39;intérêt scientifique autour des mécanismes de contrôle de l&#39;expression des gènes au niveau de l&#39;ARN. Cette branche de la biologie moléculaire a été fortement alimentée par la découverte de non codantes des ARN comme des acteurs majeurs dans la régulation post-transcriptionnelle. Une telle perspective révolutionnaire a été accompagnée et déclenchée par le développement de technologies puissantes pour le profilage des ARN courte expression, à la fois au niveau haut débit (identification du génome entier) ou analyse d&#39;un seul candidat (accumulation de l&#39;état d&#39;équilibre des espèces spécifiques). Bien que plusieurs stratégies état de l&#39;art sont actuellement disponibles pour le dosage ou la visualisation de ces molécules fuyant, analyse Northern Blot reste l&#39;approche droit dans la biologie moléculaire pour l&#39;évaluation immédiate et précise de l&#39;expression de l&#39;ARN. Il constitue une première étape vers l&#39;application de technologies coûteuses, plus sophistiqués et, dans de nombreux cas, reste une méthode préférentielle pour gagner facilement des idéesARN en biologie. Ici, nous aperçu un protocole efficace (Enhanced Northern Blot) pour détecter les microARN faiblement exprimés (ou d&#39;autres espèces de petits ARN réglementaires) de Drosophila melanogaster embryons entiers, disséqué manuellement tissus / adultes larvaires ou dans des cellules cultivées in vitro. Une quantité très limitée de l&#39;ARN est nécessaire et l&#39;utilisation du matériel de flux cellules cytométrie isolées peuvent être également envisagée.

En suivant la procédure générale décrite dans le texte et représentés schématiquement sur ​​la figure 1, nous avons évalué l&#39;expression de petits ARN à partir d&#39;échantillons d&#39;ARN complexes de différentes origines. Dans l&#39;expérience présentée à la figure 1, l&#39;ARN a été isolé à partir de 2 cellules de Drosophila Schneider par extraction à la protéinase K, vérifiés pour l&#39;intégrité (étape optionnelle: dénaturation agarose fr...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d&#39;un protocole Northern Blot améliorée sur l&#39;ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d&#39;ARN.

Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.7K vues.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d'un protocole Northern Blot améliorée sur l'ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d'ARN. 