This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

The authors declare no conflict of interest

بروتينات غشاء ليست سهلة حتى للدراسة. عزل بروتينات غشاء الأم معقد بسبب الحاجة إلى ذوبان طبقة ثنائية الدهون مع المنظفات، التي يمكن أن تتلف البروتينات وإزالة العوامل المساعدة الأساسية. قد تكون هذه البروتينات موجودة أيضا عند مستويات منخفضة في الأغشية البيولوجية، أو تكون مختلطة مع البروتينات ترتبط ارتباطا وثيقا، كما في حالة المجمعات الحصاد الخفيفة، التي تجعل تنقية المجمعات واحدة صعبة. مغاير التعبير البروتين في E. القولونية وإعادة المختبر توفر إمكانية تجنب هذه المشاكل. في المختبر وإعادة تنقية النتائج البروتينات مطوية في المجمعات التي تمتلك خصائص مشابهة جدا لتلك المجمعات الأم 20،21،23، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة المجمعات التي لا يمكن تنقيته لالتجانس 24 - 27. يستخدم هذا الأسلوب السبانخ، وهو بسهولة attainabلو مدار السنة، كمصدر لمجموع كاروتينويد الصباغ والاستعدادات. لبعض reconstitutions البروتينات الأم إلى الطحالب، ويفضل استخدام أصباغ تنقيته من الطحالب بسبب التراكيب الصباغ مختلفة. وشيلي أ / ب نسبة ونسبة شيلي / سيارة لا يزال هو نفسه بغض النظر عن مصدر الصباغ. من المهم أن ندرك أن كفاءة إعادة عادة حوالي 35 28٪. وبالتالي فمن الضروري إزالة أصباغ غير منضمة وصميم بروتيني تكشفت من الحل بعد إعادة. ويرد بروتوكول تنقية من خطوتين في هذا البروتوكول (انظر النتائج أيضا). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الخطوة التدرج السكروز لا يسمح الفصل التام بين الاشتقاق وهولو البروتين. بالنسبة لمعظم التحليلات هذه ليست مشكلة، لأن صميم بروتيني لا يحتوي على أصباغ وبالتالي لا تتداخل مع القياسات الوظيفية. ومع ذلك، في حال كان من الضروري إزالة تماما صميم بروتيني من الابعمل تتضمن مجمع تشكيلها (على سبيل المثال، لحساب الصباغ إلى البروتين رياضيات الكيمياء)، يمكن استخدام عمود الصرف أنيوني (انظر Passarini وآخرون 2009 29 للحصول على التفاصيل). القدرة على refold البروتينات المؤتلف حصاد الضوء مع أصباغ معزولة في المختبر يوفر فرصة ل&quot;التلاعب&quot; المجمعات عن طريق تعديل إعادة تشكيل &quot;البيئة&quot; بطرق مختلفة، وبالتالي تغيير خصائص معقدة الناتجة عن ذلك. على سبيل المثال، تغيير تشكيل الصباغ خلال إعادة يمكن أن يؤدي في مجمع مع تكوين الصباغ غيرت. ويمكن استخدام هذه الميزة لدراسة تأثير مختلف الصبغات لها على بنية واستقرار المجمع. عادة إعداد الصباغ الحصول عليها من السبانخ يحتوي على نسبة شيلي أ / ب من 3: 1 ونسبة / سيارة شيلي من 2.9: 1. هذا ينتج عادة نسبة البروتين أعيد مع نفس الخصائص كما نسالبة واحدة. ومع ذلك، يمكن تعديل نسبة شيلي أ / ب بإضافة تنقية شيلي A أو B تؤثر ربط أصباغ مختلفة بسبب الانتقائية من مواقع الربط متفاوتة 30 - 33. وهذا ممكن لأن معظم المواقع الصباغ ملزم لا انتقائية تماما لشيلي في شيلي أو ب، ولكن يمكن أن تستوعب كلا، على الرغم من تقارب مع مختلف 10،30،34. بطريقة مماثلة، وعرضت مواقع الربط كاروتينويد أيضا أن تكون قادرة على استيعاب أكثر من الأنواع كزانتوفيل 8،35 - 38. وترد reconstitutions مختلف من CP26، مجمع الصباغ البروتين أخرى من النباتات العليا، وذلك باستخدام مختلف التراكيب الصباغ في الجدول 2 39. واستخدمت هذه reconstitutions لتقييم تقارب من مواقع معينة أصباغ 39 ملزمة. ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه من أجل الحصول على مجمع بنفس الصباغ جomposition باعتبارها واحدة الأصلي، يجب أن تكون نسبة داا / ب من مزيج الصباغ 3: 1. يبدو أن هذا هو الحال بالنسبة لجميع المجمعات المصادم من النباتات العليا 20،40. مزيج من البيولوجيا الجزيئية مع تقنية إعادة يسمح خصائص مجمع شيلي ملزم لدراستها بمزيد من التفصيل. أهمية البروتين المجالات المختلفة على استقرار وقابلة للطي من المجمعات، أو مشاركتهم في البروتين البروتين التفاعلات، وقد تم تحديد من قبل اقتطاع صميم بروتيني أو أداء الطفرات العشوائية 8،41 - 44. بقايا حمض أميني واحد مهمة لتنسيق أصباغ مختلفة يمكن تغييرها من خلال الطفرات الموجهة الموقع من أجل تحليل خصائص أصباغ الفردية أو تقييم مساهمتها في وظيفة واستقرار معقدة 10،28،29،45 - 52. الشكل 6 يبين إعادة تكوين Lhcb4 (CP29) معطفرة من الحامض الاميني في موقف 216 53. مقارنة بين تكوين الصباغ من wildtype والمجمعات متحولة تبين أن طفرة يستحث فقدان شيلي جزيء واحد، مشيرا إلى أن الموقع المستهدف يستوعب لشيلي في مجمع WT. الاختلافات من أطياف امتصاص WT ومتحولة، على تطبيع إلى المحتوى الصباغ، ويظهر أيضا خصائص امتصاص الصبغة المفقودة. في هذه الحالة، يمكن رؤية الفرق في ذروة الرئيسية في 680 نانومتر، مشيرا إلى أن شيلي منسقة من قبل His216 يمتص في هذا الطول الموجي (لمزيد من التفاصيل حول هذا المسخ والخصائص الطيفية MOZZO يرى آخرون 2008 53). كما يمكن استخدام تحليل طفرة لتحديد تأثير البيئة على الخواص الطيفية للأصباغ 54. في الختام، حصاد البروتينات الخفيفة يمكن بسهولة إعادة تشكيل في المختبر مما أدى الصباغ-البروتيناتن المجمعات مع خصائص مشابهة جدا لالمجمعات الأصلية. في هذه الطريقة، يتم استبعاد صعوبات عزل البروتينات الأم، بينما كان يلقى أيضا إعداد البروتين مع ارتفاع العائد والنقاء لمزيد من الدراسة. وأكد داا نسبة 1 أ / ب في إنتاج مجمع أصيلة، وقدمت أمثلة من wildtype تشكيلها وLHCs متحولة لتوضيح تطبيقات هذه التقنية: أهمية وجود 3.

جهاز التمثيل الضوئي للنباتات والطحالب تشمل البروتينات التي تربط الغشاء لا يتجزأ من الكلوروفيل (شيلي) أ، ب (شيلي ب) والكاروتينات (سيارة). هذه المجمعات الصباغ البروتين تنشط في مجال الطاقة ضوء الحصاد ونقل أن طاقة الإثارة إلى مراكز رد فعل، حيث يتم استخدامه للترويج تهمة الفصل 2. وهم يشاركون أيضا في آليات التغذية المرتدة التنظيمية التي تحمي الجهاز من التلف الضوئي ضوء ارتفاع 3،4. تتكون المجمعات حصاد الضوء (LHCs) من عائلة كبيرة من البروتينات ذات الصلة في النباتات والطحالب 5. تنقية متجانسة من كل عضو من أعضاء الأسرة وقد تعقدت من الخصائص الكيميائية والفيزيائية مشابهة إلى حد كبير من المجمعات. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تؤدي الإجراءات تنقية في فقدان أصباغ أو العوامل المساعدة الأخرى المحتملة مثل الدهون. في المختبر تمثيلا إعادةTS وسيلة قوية للتغلب على هذه المشاكل. وأعيد تشكيل LHC المرتبطة الضوئي الثاني (LHC-II) لأول مرة في المختبر بواسطة Plumley وشميت في عام 1987 1. استخراج الباحثون delipidated البروتين وأصباغ بشكل منفصل من البلاستيدات الخضراء النباتية، ومن ثم الجمع بين الحرارة التشويه والتحريف بروتين مع أصباغ في وجود ليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS)، تليها ثلاث دورات التجميد والذوبان 1. وأظهر الباحثون أن الخصائص الطيفية للمجمعات المصادم أعيد كانت مشابهة جدا لمجمعات تنقيته من النباتات. سهولة إعادة تشكيل المصادم المجمعات الصباغ البروتين، من المحتمل بسبب بعض المتأصلة ميزة التجميع الذاتي، جنبا إلى جنب مع صعوبة في عزل المجمعات المنقى من الكائنات الحية، أدى إلى اعتماد سريع للطريقة قبل باحثين آخرين. وقد تحقق إعادة تشكيل البروتينات الضوئي overexpressed في القولونية (E. كولاي) عن طريق بولسن وزملاؤه في عام 1990 6. في E.وعادة ما ترد القولونية والبروتينات الغشاء overexpressed في الهيئات إدراج، الذي مرافق تنقية بهم. ويتحقق من خلال إعادة تمسخ الحرارة الهيئات إدراج تحتوي على البروتين المؤتلف في وجود LDS، تليها إضافة أصباغ الذي يبدأ البروتين للطي. للطي من مجمع LHCII هي عملية من خطوتين: أولا، لا بد من الكلوروفيل في أقل من 1 دقيقة. ثانيا، لا بد الكلوروفيل ب واستقرت على مدى عدة دقائق 7. بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة على ديناميات قابلة للطي، في إعادة المختبر جنبا إلى جنب مع الطفرات الموجهة الموقع قد يسمح بتحديد الأحماض الأمينية محددة هامة للاستقرار (على سبيل المثال، 8،9) أو التنسيق الصباغ (على سبيل المثال، 10). وقد حددت التلاعب refolding الظروف من خلال تعديل معايير مثل تكوين الصباغ أو المنظفات أيضا عناصر criticaلتر للطي السليم، مثل شرط من Xanthophylls للمجمع LHCII (على سبيل المثال، 1،11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق في خصائص أصباغ الفردية منضمة إلى المجمعات الممكن استخدام المجمعات تشكيلها في الجسم الحي (على سبيل المثال، 10). الطريقة الموصوفة هنا يبدأ عزل الصبغات (الكلوروفيل والكاروتين) من السبانخ والطحالب الخضراء كلاميدوموناس reinhardtii. التعبير وتنقية البروتين LHC من E. القولونية في شكل هيئات إدراج بعد ذلك بالتفصيل، تليها إعادة تشكيل LHC وتنقية اللاحقة ني عمود النسب. في الخطوة النهائية، وتنقيته المجمعات أعيد مزيد من السكروز التدرج الطرد المركزي لإزالة أصباغ حرة وتكشفت صميم بروتيني. يمثل هذا البروتوكول إجراء الأمثل دمج العديد من التعديلات التي أدخلت من قبل مختبرات مختلفة خلالالوقت 1،6،10،12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

في النباتات والطحالب الخضراء، وضوء استولت عليها المجمعات حصاد الضوء (LHCs)، وهي عائلة من بروتينات الغشاء لا يتجزأ التي تنسق الكلوروفيل والكاروتينات. في الجسم الحي، يتم طي هذه البروتينات مع المواد الملونة لتشكيل المجمعات التي يتم إدراجها في الغشاء الثايلاكويد للبلاستيدات الخضراء. التشابه عالية في الخصائص الكيميائية والفيزيائية للأعضاء الأسرة، جنبا إلى جنب مع حقيقة أنها يمكن أن يخسر بسهولة أصباغ خلال العزلة، ويجعل تنقية في حالة الأم صعبة. وقد وضعت نهجا بديلا للحصول على الاستعدادات متجانسة من LHCs بواسطة Plumley وشميت في عام 1987 1، الذي أظهر أنه من الممكن لإعادة بناء هذه المجمعات في المختبر بدءا من أصباغ المنقى وapoproteins تكشفت، مما أدى إلى المجمعات مع خصائص مشابهة جدا لتلك التي من مواليد المجمعات. هذا فتح الطريق لاستخدام البكتيرية البروتينات المؤتلف وأعرب عن في المختبر </eم&gt; إعادة. طريقة إعادة قوية لأسباب مختلفة: (1) الاستعدادات نقية من المجمعات الفردية يمكن الحصول عليها، (2) تكوين الصباغ يمكن السيطرة عليها لتقييم مساهمتها في البنية والوظيفة، (3) ويمكن تحور البروتينات المؤتلف لدراسة وظيفية دور مخلفات الفردية (مثل صبغة ملزمة المواقع) أو مجال البروتين (مثل التفاعل البروتين البروتين، قابلة للطي). وقد تم تحسين هذه الطريقة في العديد من المختبرات وتطبيقها على معظم المجمعات حصاد الضوء. بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة إعادة تشكيل المجمعات ضوء حصاد في المختبر المستخدمة حاليا في المختبر لدينا، ويتم توفير أمثلة تصف تطبيقات الأسلوب.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K Views.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Video: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

المفرد جزيء التصوير النقل النووية

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

إنشاء ثقافة الاستنساخ من الطحالب التصريف أحادي الخلية

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...