وأيد هذا العمل من قبل هارولد اند ليلى جائزة G. Y. ماذرز لHL ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R24 GM080527) إلى RESCEJ كان زميل ما بعد الدكتوراه NRSA (NIH F32GM9037222) ويدعم حاليا من قبل على جائزة تنمية عالم أبحاث إرشادهم من الوطني معهد للشيخوخة (K01AG04435). نود أن نشكر المراجعين للتعليقات مفيدة.

1. إعداد DNA البلازميد، إبر، وأطباق حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA البلازميد باستخدام طقم ماكسي عالية السرعة أو ميدي وتركيز الحمض النووي إلى 2.5 ملغ / مل باستخدام الإيثانول هطول الأمطار. يجب حل بيليه الحمض النووي في nuclease خالية من الماء منزوع الأيونات. تخزين الحمض النووي في 10-20 مكل في -20 درجة مئوية. (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة من ناقلات المتاحة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل طبق الحقن باستخدام الاغاروز لبناء حوض لعقد الأجنة في 100 × 15 مم طبق بتري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المجهر الشريحة 75 × 50 الزجاج إلى 100 × 15 مم طبق بتري في زاوية. صب حوالي 50 مل من 2٪ الاغاروز ذاب في حيدرة المتوسطة 24 في طبق بيتري. بدلا من ذلك، صب الاغاروز في طبق أولا وتعويم &quot;القالب حقن مكروي الأسماك&quot; على القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن عززت agarose، إزالة شريحة زجاجية أو القالب. إذا تم استخدام شريحة زجاجية، وقطع بعيدا الاغاروز الزائد مع بلوخ الحلاقةدي لتشكيل الجدار. صب هيدرا المتوسطة في طبق واستخدامه فورا أو تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. يمكن إعادة استخدام الأطباق حقن إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات: مذكرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط على مجتذب micropipette باستخدام الشروط التالية: حرارة 525، وسحب 75، سرعة 100، والوقت 50. مخزن الإبر عن طريق الضغط عليها في شريط ضيق من الطين في طبق بتري بحيث أنها الموازية التي عقدت في قاع الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير محلول الحقن، والجمع بين 3 ميكرولتر من 2.5 ملغ / مل حل DNA البلازميد مع 2 ميكرولتر من 10٪ الفينول الأحمر. دوامة الحل لفترة قصيرة ثم تدور لمدة 10 دقيقة في السرعة القصوى في microcentrifuge لإزالة أي الجزيئات التي قد تسد إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، مقطع الإبرة بضعة ملليمترات من غيض مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة. ملاحظة: هناك بعض المرونة في الحجم المناسب للمفتوحاجي لأن الضغط يمكن تعديلها في الخطوة 3.3 لاستيعاب هذا الاختلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري بحيث انها تحتجز الإبرة في وضع عمودي مع أسفل الحافة. تحميل إبرة مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن بواسطة pipetting السائل في نهاية الجزء الخلفي من الإبرة. السماح للعمل شعري لسحب الحل في رأس الإبرة. </li></ol> 2. إعداد الأجنة للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على أساس يومي مسح الثقافة سلالة هيدرا AEP عن الاورام الحميدة إنتاج البيض. جمع هذه الاورام الحميدة وتضعها جانبا في طبق منفصل الثقافة. مراعاة هذه الاورام الحميدة كل بضع ساعات خلال اليوم لرصد التقدم المحرز في تشكيل البيض. عندما كسر البيض من خلال الأديم الظاهر والجلوس على حلقة من خلايا الأدمة تراجع انهم مستعدون للحقن 25. ضع هذه الاورام الحميدة في طبق مع عدة هيدرا التي لها الخصيتين لا يقل عن 1 ساعة قبل حقن للسماح للإخصاب. هيدرا &lt;/ EM&gt; الذكور ستفرج الحيوانات المنوية دون أي تلاعب خاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم العثور على الإناث في مستعمرة AEP مع البيض تشكيلها بالكامل، والتي هي حوالي 400 ميكرون في القطر 25، أو 1- إلى 8 خلايا الأجنة المرحلة، أيضا جمع هذه للحقن. حقن فورا الأجنة التي بدأت الانفطار. ملاحظة: ليس من الممكن ان نقول للفرق بين البيض تشكيلها بالكامل وبيضات ملقحة وحيدة الخلية، وبالتالي يجب حضنت هذه مع الذكور قبل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحقن، وإزالة معظم الأنسجة الأبوية فوق وتحت الجنين باستخدام مشرط بشفرة # 15. ترك فقط الجنين مع قطعة صغيرة من العمود الجسم المرفقة، لاستخدامها لمعالجة الجنين بالملقط إذا لزم الأمر. ملاحظة: الأنسجة التي يتم تشريح بعيدا عن الجنين وتجديد ويجب حفظ لضمان أن الإناث تبقى في مستعمرة هيدرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستور، نقل الأجنة إلى طبق الحقن، وترتيبها موازية لجدارحوض الاغاروز. </li></ol> 3. Microinjection من البلازميد DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب microinjector على الوقوف المغناطيسي الذي يجلس على صفيحة الحديد. جبل حامل الحقن، وهو جزء من microinjector الذي يحمل الإبرة، على micromanipulator عصا التحكم. تركيب مناور عصا التحكم على لوحة الحديد، مع الوقوف المغناطيسي. ضع هذا كله مجموعة المتابعة على الجانب الأيمن من مجهر تشريح ووضع حامل حقن بحيث كان مرئيا في مجال المراقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق مع حقن الأجنة تحت المجهر تشريح، الموجهة مثل أن الجدار الرأسي للحوض الاغاروز هو اليسار. ادخال الإبرة في حامل الحقن وخفض رأس الإبرة في المتوسط ​​هيدرا في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتحول ببطء مقبض من الحقنة في اتجاه عقارب الساعة حتى تملأ الزيوت المعدنية أعلى الإبرة وجود تدفق مستمر من محلول الحقن لوحظ خروج الإبرة في HYDRوسيلة. إذا كان تيار قوي جدا، وانخفاض الضغط من خلال تحويل مقبض عكس عقارب الساعة. ممارسة هذه الخطوة بشكل روتيني للحصول على ضغط مناسب، والذي يعتمد على حجم الفتحة إبرة (أي كيف كان يثقب الإبرة في الخطوة 1.5). ملاحظة: إذا كان تيار قوي جدا، فإن الجنين لم تنج من الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، حرك طبق حقن بحيث الجنين الأول في وسط الميدان. تحريك الإبرة بحيث أنه لمس أن الجنين. استخدام مياداة مجهرية لاختراق الجنين مع الإبرة. ملاحظة: ستكون الجدار الرأسي للحوض الاغاروز حفاظ على الجنين من يتم دفعها جانبا الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل الحقن لتتدفق الجنين 1 أو 2 ثانية ثم قم بإزالة الإبرة بسرعة. إذا كان الجنين لديه أكثر من خلية واحدة، وضخ كل خلية على حدة. استخدام ملقط لإعادة توجيه الجنين لمحاذاة الخلية التالية مع رأس الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد امبري الأوليتم حقن س، نقل الطبق بحيث الجنين القادم في موضع الحقن وكرر الإجراء. تستمر حتى تم حقن جميع الأجنة. </li></ol> 4. التثقيف والتفقيس من الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل من الأجنة المحقونة في صحن مع قليل من هيدرا التي لها الخصيتين (وهذا هو لضمان أن جميع الأجنة المخصبة). احتضان الأجنة في 18 ° C حاضنة في حين أنها لا تزال مرحلة التطور الجنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم الوصول إلى مرحلة بشرة، نقل كل الأجنة لحقن بئر الفردي من 24 لوحة جيدا مليئة هيدرا المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة المحقونة لمدة 2 أسابيع في الظلام في 18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة 2 الاسبوع، والتحقق من كل حقن الجنين تحت المجهر تشريح. ملاحظة أي الحالات التي فصل الجنين مرحلة بشرة من قطعة صغيرة من الأنسجة الأبوية وإعادة إحياء النسيج الأبوية. إزالة هذا سليلة مجدد فورا حتى أنه لا ميstaken لفقس البيض الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طبق من الأجنة المحقونة تحت ضوء حوض السمك في RT. تحقق لوحات كل يوم، وجمع سلحفاة صغيرة. سلحفاة صغيرة جديدة سوف تكون بيضاء لأن اللون الوردي نموذجية من الاورام الحميدة هيدرا يأتي من الأرتيميا يأكلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة سلحفاة صغيرة تحت المجهر مضان للكشف عن التحوير التعبير. </li></ol>

<ol>
	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning.">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li><li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+genome+of+Hydra.">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li><li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra.">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li><li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

هيدرا يستنسخ بشكل روتيني لاجنسيا، ولكنها تتطلب محفزات البيئية للبدء في إنتاج الأمشاج. لا تعرف جيدا هذه المحفزات لمعظم الأنواع وهيدرا قد تختلف من سلالة إلى سلالة. وهناك عقبة كبيرة في إنتاج المعدلة وراثيا هيدرا هو الحصول على الأجنة على أساس منتظم لأنه قد يكون من الصعب في إعداد مختبر للحث هيدرا ليصبح الجنسي. سلالة AEP 25، ومع ذلك، تنتج الأمشاج بسهولة في المختبر وهذه هي السلالة الوحيدة التي استخدمت حتى الآن لصنع خطوط المعدلة وراثيا. الأسلوب الأكثر شيوعا لإحداث إنتاج الأمشاج هو التلاعب من قبل النظام الغذائي. كما هو موضح سابقا، ويجب أن تغذى الحيوانات يوميا لمدة ثلاثة أسابيع والتجويع لمدة 5 أيام، ومن ثم تغذيتها مرتين في الأسبوع، حيث سيتم إنتاج الأمشاج الوقت 1. فقد كان أيضا تجربتنا أن زراعة AEP هيدرا على لوحات رأسية في حوض للماء 26، وربما محاكاة مورالبيئة الطبيعية الإلكترونية، يؤدي إلى إنتاج البيض حتى عندما يتم تغذية الحيوانات على فترات منتظمة. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول عليها من خطوط AEP الصلبان الذاتي تنتج أحيانا الأمشاج بانتظام أكثر من السلالة الأم. وبالتالي إنشاء خط F1 من AEP هي طريقة لآخر ممكن للحصول على مصدر أكثر موثوقية من الأجنة. النسبة المئوية للأجنة التي تعيش الحقن وتطوير للمرحلة بشرة تعتمد على صحة الأجنة، وكمية من محلول يحقن، ومقدار الضرر الناجم عن الحقن. مع التدفق المستمر حقن انشاء الموصوفة في هذا البروتوكول، فإنه من الصعب التحكم في كمية الحل الذي يتم حقنه في جنين. في أيدينا، ما يقرب من نصف الأجنة حقن كما هو موضح هنا مرحلة التطور الجنيني كامل بنجاح وتشكيل بشرة. من هذه، 50-75٪ يفقس وتلك التي يفقس، وحوالي 50٪ يتلقى بعض الأنسجة المعدلة وراثيا على الأقل. ولذلك، 10-20٪ من الأجنة المحقونة في البداية تسفروهيدرا F1 مع الأنسجة المعدلة وراثيا. كمية المحلول المحقون يمكن التحكم بدقة مع معدات أكثر تكلفة مثل microinjector IM-300. وقدمت خطوط المعدلة وراثيا الأصلية مع المعدات من إيبندورف، والذي يسمح قدرا كبيرا من الدقة في معالجة وحقن الجنين. في حين أن هذا المستوى من الدقة قد يعطي معدل البقاء على قيد الحياة أعلى من الأجنة المحقونة، هذه النفقات ليست ضرورية لإنشاء الروتيني للخطوط المعدلة وراثيا. دمج التحوير هو عشوائي ويحتمل أن تحدث في مواقع متعددة في الجينوم أو في مجموعة جنبا إلى جنب في مكان واحد. على أساس تحليل لطخة الجنوبي، وقدرت عدد التكامل في خمسة في خط المعدلة وراثيا الظهارية واحدة تم إنشاؤها مسبقا 1. في خط النسب المعدلة وراثيا الخلالي فيها التحوير يخضع انتقال سلالة الجرثومية، وقد تجلى ذلك من خلال تسلسل الجينوم التي كانت فقط نسخة واحدة من التحوير كثافة العملياتegrated (CE دانا وRE ستيل، والمراقبة غير منشورة). ومع ذلك، وبصرف النظر عن هذين المثالين، لا يوجد المعلومات المتاحة عن مواقع التكامل التحوير وعدد نسخها. لأنه من الممكن أن التحوير يمكن أن يقطع وظيفة الجين بواسطة الطفرات إقحامي، ينبغي بذل خط المعدلة وراثيا أكثر من واحدة عند تحليل الظواهر من بينها، على سبيل المثال، أو overexpression رني بنيات. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن التعبير التحوير هو التأسيسي عندما مدفوعا تستخدم عادة المروج الأكتين الجينات، وبالتالي الجينات المحورة التي تؤدي إلى الظواهر خطيرة أو قاتلة عندما أعرب جوهري لن يتم الحفاظ عليها. في المستقبل، سيكون من المهم وضع نظام محرض من التحوير التعبير للتحايل على هذه المشكلة.

وقد استخدمت هيدرا لدراسة التجديد، وتشكيل نمط، والخلايا الجذعية لحوالي 250 سنة 2 هيدرا لديها خطة هيئة بسيطة تتألف من ثلاثة الأنساب الخلية: الظهارية الأديمي الظاهر، الأديم الباطن الظهارية، وفراغي. يتكون الجسم أنبوبي من الأدمة والأنساب الظهارية الأديم الباطن، كل منها عبارة عن طبقة خلية واحدة. كافة الخلايا الظهارية في عمود الجسم هي الإنقسامية. عندما نزحوا الخلايا الظهارية في الأطراف 3، ورئيس (الفم ومخالب) في نهاية شفوية أو القدم (القرص القاعدية) في نهاية مجافي الفم، فإنها تعتقل في المرحلة G2 من دورة الخلية وتغيير مصير الخلايا 4. خلايا النسب الخلالي يقيمون داخل الفجوات بين الخلايا الظهارية. ويدعم هذا النسب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الموجودة في طبقة الأدمة الظهارية العمود الجسم 5. الخلايا الجذعية الخلالي تؤدي إلى ثلاثة سل الجسديةأنواع ل (الأعصاب، وخلايا الغدة، وnematocytes) والخلايا الجرثومية 6،7. كعضو في بعائلة القراصات، مجموعة شقيقة لجميع bilaterians، يمكن هيدرا تسليط الضوء على العمليات البيولوجية الأساسية المشتركة بين الحيوانات المتعددة الخلايا. حتى وقت قريب، تم عرقلة هذه الجهود من خلال عدم وجود طرق موثوقة لاضطراب في وظيفة الجين. ومع ذلك، مع تطوير منهجية المعدلة وراثيا 1، ونحن الآن قادرون على الاستفادة الكاملة من هيدرا للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المشتركة بين الحيوانات متعددة الخلايا، مثل وظيفة الخلايا الجذعية، تجديد، والزخرفة. يتم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا هيدرا عن طريق الحقن من DNA البلازميد إلى الأجنة، الأمر الذي يؤدي إلى تكامل عشوائي والتعبير خيالية في تردد كبير من سلحفاة صغيرة. يمكن إنشاء خط مع التعبير موحد في نسب معين عن طريق الإكثار اللاجنسي. القدرة على نشر clonally transgشبكة naric هيدرا خطوط هي ميزة على معظم النماذج الحيوانية، والتي يمكن نشرها إلا عن طريق التكاثر الجنسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع الخلايا المعدلة وراثيا بسهولة في الجسم الحي بسبب شفافية الحيوان وغياب البروتينات الفلورية الذاتية 8. في سبع سنوات منذ أول خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تم إجراؤها 1، وقد تم استخدام هذه الخطوط لمجموعة متنوعة من التطبيقات. جعلت التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع مختلفة من الخلايا من الممكن لتتبع حركة الخلية، ومراقبة التغيرات في شكل الخلية، وتتبع مصائر خلية في كل الظروف نوع البرية وبعد اضطراب كيميائي 1،5،9-12. بالإضافة إلى ذلك، التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة في مختلف الأنساب يسمح لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزل السكان خلية معينة. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل من mRNAs محددة الخلايا الجذعية ونسب محددة الرنا 13،14 صغيرة. بينما مروجيواحد من اثنين هيدرا الجينات الأكتين وقد استخدم على نطاق واسع، وقد تم تحديد عدد قليل خلية من نوع المروجين محددة وتستخدم لدفع التعبير عن GFP المعدلة وراثيا في هيدرا 9،11،15،16. في المستقبل، سوف المروجين الخلية من نوع معين يسمح لمراقبة وجمع أي نوع من الخلايا المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نهج المعدلة وراثيا بنجاح لتحديد العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة تعمل من المروج Wnt3 17. يوفر تطوير أساليب المعدلة وراثيا في هيدرا نهج قوي لاختبار وظيفة الجينات التي التعبير خارج الرحم، overexpression، وضربة قاضية. وقد بذلت الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الموسومة fluorescently، من أجل دراسة كل وظيفة وتوطين الخلوية 18-20. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن دبابيس الشعر RNA في 3&#39;UTR من التحوير GFP يؤدي الى ضربة قاضية من الجينات المستهدفة 21،22. في هذه النهج مطلوب لتحديد GFPوتتبع أنسجة معدلة وراثيا أثناء إنشاء خط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فمن المرجح أن جزيء GFP أن تتدخل في بعض الحالات مع وظيفة البروتين الموسومة. توضح دراسة حديثة أن الجينات هيدرا يمكن ترتيب في تكوين الاوبرون، أي مصنوعة النصوص متعدد المقارين، والتي يتم فصلها بواسطة المهدرجة تقسم بالإضافة زعيم وترجمتها على حدة 23. عن طريق وضع الجينات ترميز البروتين أو دبوس RNA في موقف المنبع من الاوبرون والجين ببروتين في موقف المصب، يمكن للمرء أن تتبع الأنسجة المعدلة وراثيا دون الحاجة لوضع علامة على الجينات التي تشفر البروتين أو RNA القاسي. وقد استخدم هذا الأسلوب لإبداء دبوس RNA في تكوين الاوبرون مع DsRed2 من أجل تحقيق ضربة قاضية الجين 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AEP Hydra Strain</td>
			<td style="width:112px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:576px;">Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Speed Maxi Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:112px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection Fish Mold</td>
			<td style="width:112px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FM-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Borosilicate Glass with Filament</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-50-10</td>
			<td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers Forceps, Durmont #5</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Blade #15</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-822-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron Plate</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

إنشاء خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تغذية سلحفاة صغيرة المعدلة وراثيا كل 2-3 أيام مع يرقات الأرتيميا. سلحفاة صغيرة أحيانا لا تأكل لمدة يوم أو اثنين بعد الفقس. فإن بعض سلحفاة صغيرة جديدة تأكل أبدا، وبالتالي لن البقاء على قيد الحياة. إذا فقس البيض غير المعدلة وراثيا إما في الأدمة (الشكل 1A) أو الأنسجة الظهارية الأديم الباطن، والسماح للحيوان لبرعم وجمع البراعم التي تحتوي على الأنسجة الأكثر المعدلة وراثيا (الشكل 1B، C). مواصلة القيام بذلك مع براعم جديدة حتى يتم تأسيس خط المعدلة وراثيا مع التعبير الموحد للالتحوير سواء في الأدمة (الشكل 1D) أو النسب الظهارية الأديم الباطن. في نفس الوقت، يمكن إنشاء الخط الثاني الذي لا يحتوي على التحوير ولكن غير متطابقة وراثيا غير ذلك (الشكل 1B). يخدم هذا الخط كعنصر تحكم السلبية للتجارب المستقبلية. إذا لم الأنسجة المعدلة وراثيا ينتقل طn لبرعم، فمن الممكن في بعض الأحيان أن يقطع الحيوان والسماح لها لتجديد بحيث الأنسجة المعدلة وراثيا ستكون في منطقة جديدة في مهدها. ومع ذلك، إذا الأنسجة المعدلة وراثيا هي قريبة جدا من الحدود القصوى من المرجح أن تضيع عليه كما هو النازحين أثناء النمو الطبيعي للحيوان. غالبا ليس هناك ما يمكن القيام به في هذه الحالة. في أيدينا، إذا كان التحوير محايد (أي لا يوجد لديه تأثير على الوظيفة البيولوجية) ونحن قادرون على إنشاء خط الظهارية موحد من حوالي 30٪ من هيدرا أن يفقس مع الأنسجة الظهارية المعدلة وراثيا. 70٪ الباقية إما يموت أو يتم فقدان الأنسجة المعدلة وراثيا. خط الأديم الباطن ما يقرب من 2-3 أضعاف المشتركة باعتبارها خط الأدمة. إذا كان يتم استخدام التحوير الذي يعطل وظيفة بيولوجية، وهذا قد يكون لها تأثير على جدوى إنشاء خط موحد. في مثل هذه الحالات، سوف يكون المروجين محرض الإضافات الضرورية للأدوات. إذا فقس البيض غير المعدلة وراثيافي النسب الخلالي، والسماح للحيوان لبرعم وجمع سلحفاة صغيرة مع زيادة عدد الخلايا المعدلة وراثيا في النسب الخلالي. أن ندرك أنه في بعض الأحيان ليس من الواضح على الفور أن وجود حيوان المعدلة وراثيا في النسب الخلالي، لا سيما إذا كان هو أيضا المعدلة وراثيا في النسب الظهارية. فمن المستبعد جدا أن خط المعدلة وراثيا تماما في النسب الخلالي سيتم إنشاء ببساطة عن طريق مهدها. إذا كان المطلوب أن يكون النسب الخلالي تماما المعدلة وراثيا، وهذا يمكن أن يتحقق عن طريق الاستنساخ في المجاميع الجذعية من خلالي الحيوانات المنضب الخلية بحيث يتم تأسيس سلالة كامل من الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا واحدة 7. في الحالات التي يتم استخدام نوع معين المروج نسيجيا أو خلية لدفع التعبير عن بروتين فلوري، قد لا تكون الحيوانات المعدلة وراثيا واضحا في البداية. على سبيل المثال إذا تم استخدام المروج التي تنشط فقط في مخالب والتصحيح الأولي المعدلة وراثياهو في عمود الجسم، سوف ينظر أي خلايا الأنسجة الفلورسنت في فقس البيض. لذلك تحتاج كل سلحفاة صغيرة ليتم نشرها للسماح الأنسجة المعدلة وراثيا إلى أن نزوح إلى مخالب وأصبح واضحا. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51888/51888fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. إنشاء خط المعدلة وراثيا مع التعبير موحد الظهارية الأديمي الظاهر من DsRed2. (A) لفقس البيض مع التعبير خيالية من التحوير DsRed2 تحت السيطرة على المروج الأكتين في رقعة من الخلايا الظهارية الأدمة. (B) والجيل الأول من برعم من فقس البيض في لوحة وتنتج الآن اثنين من البراعم الجديدة. المهد المسمى مع علامة النجمة ليس لديه الأنسجة المعدلة وراثيا، وكان يستخدم كما الحيوان المؤسسين لخط السيطرة مطابق وراثيا إلى خط المعدلة وراثيا، باستثناء وجود التحوير. (C) والجيل الثاني من برعمالمنتجة من هيدرا في لوحة B. (D) مثال على سليلة من خط المعدلة وراثيا التي تأسست مع DsRed2 التعبير في جميع أنحاء الأديم الظاهر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51888/51888fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection at JoVE.com

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

13.9K Views.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Video: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.