Diese Arbeit wurde durch ein G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Award an HL und einer NIH (R24 GM080527) zu RESCEJ unterstützt wurde, war ein NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) und wird derzeit von einem Mentored Research Scientist Development Award von der National unterstützt Institute on Aging (K01AG04435). Wir möchten die Gutachter für hilfreiche Kommentare.

1. Herstellung von Plasmid-DNA, Nadeln und Injektions Geschirr <ol><li> Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit einem High-Speed-Maxi oder Midi-Kit und konzentrieren die DNA auf 2,5 mg / ml mit Ethanol-Fällung. Das DNA-Pellet sollte in Nuklease-freiem deionisiertem Wasser gelöst werden. Speichern die DNA in 10-20 ul-Aliquots bei -20 ° C. (Siehe Zusatz Tabelle 1 für eine Liste der verfügbaren Vektoren) </li><li> Machen Sie eine Spritz Gericht unter Verwendung von Agarose, eine Mulde zur Aufnahme Embryonen in einem 100 x 15 mm Petrischale konstruieren. <ol><li> Legen Sie ein 75 x 50 Glasobjektträger in einen 100 x 15 mm Petrischale in einem Winkel. Pour ca. 50 ml 2% Agarose in Hydra Medium 24 in die Petrischale aufgeschmolzen. Alternativ gießen Sie die Agarose in die Schüssel erste und Schwimmer eine &quot;Mikroinjektion Fisch Mold&quot; an der Spitze. </li><li> Nach Erstarren der Agarose, entfernen Sie den Glasobjektträger oder der Form. Wenn ein Glasobjektträger verwendet wurde, schneiden Sie das überschüssige Agarose mit einem Rasiermesser blade, um eine Wand zu bilden. Gießen Hydra Medium in die Schüssel und verwenden Sie es sofort oder lagern Sie es bei 4 ° C, bis sie benötigt. Hinweis: Injektions Geschirr kann wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C zwischen den Verwendungen gespeichert. </li></ol></li><li> Ziehen Nadeln aus Borosilikatglas Kapillaren mit einem Faden auf der Mikropipette Puller mit den folgenden Bedingungen: Hitze 525, ziehen 75, Geschwindigkeit 100, Zeit 50. Speichern Sie die Nadeln durch Drücken sie in einem schmalen Streifen von Ton in einer Petrischale, so dass sie Hand parallel zum Boden der Schale. </li><li> Zur Herstellung der Injektionslösung, kombiniert 3 ul 2,5 mg / ml Plasmid-DNA-Lösung mit 2 ul 10% Phenolrot. Vortex die Lösung kurz und dann drehen Sie es für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikro um alle Partikel, die die Nadel verstopfen könnten, zu entfernen. </li><li> Unter einem Binokular, Clip der Nadel ein paar Millimeter von der Spitze mit einer Pinzette, eine kleine Öffnung zu schaffen. Anmerkung: Es ist eine gewisse Flexibilität in der geeigneten Größe der offenening, weil der Druck in Schritt 3.3 eingestellt, um diese Variation zu berücksichtigen. </li><li> Legen Sie die Petrischale, so dass es hält die Nadel in einer vertikalen Position mit der Spitze nach unten. Laden der Nadel mit etwa 0,5 ul Injektionslösung durch Pipettieren der Flüssigkeit in das hintere Ende der Nadel. Ermöglichen Kapillarwirkung, um die Lösung in die Spitze der Nadel zu ziehen. </li></ol> 2. Herstellung von Embryonen zur Injektion <ol><li> Täglich scannen die Hydra AEP Stammkultur für Polypen, deren Eier. Sammeln Sie diese Polypen und legen Sie sie beiseite in einem separaten Kulturschale. Alle paar Stunden zu beobachten diese Polypen im Laufe des Tages, um den Fortschritt des Eierbildung zu überwachen. Wenn Eier durchbrechen die Ektoderm und sitzen auf einem Ring aus eingefahrenen ektodermalen Zellen sind sie bereit für die Injektion 25. Legen Sie diese Polypen in einer Schale mit mehreren Hydra, die Hoden für mindestens 1 Stunde vor der Injektion, um die Befruchtung zu ermöglichen. Hydra &lt;/ Em&gt; Männchen Spermien ohne besondere Manipulation freizugeben. </li><li> Wenn Frauen sind in der AEP-Kolonie mit voll gebildet Eier, die etwa 400 um im Durchmesser 25, oder 1 bis 8-Zell-Stadium Embryonen gefunden werden, sammeln diese auch zur Injektion. Sofort injizieren Embryonen, die Spaltung begonnen haben. Anmerkung: Es ist nicht möglich, die Differenz zwischen den vollständig geformten Eiern und Zygoten Einzeller sagen, so sollten diese bei Männern vor der Injektion inkubiert. </li><li> Vor der Injektion verringert sich die Eltern Gewebe oberhalb und unterhalb des Embryos unter Verwendung eines Skalpells mit einer # 15 Klinge. Lassen Sie nur den Embryo mit einem kleinen Stück von Körpersäule befestigt ist, zu verwenden, um den Embryo mit einer Pinzette ggf. zu manipulieren. Hinweis: Das Gewebe, aus dem Embryo zerlegt wird regeneriert und sollte gespeichert, um sicherzustellen, dass Frauen in der Hydra-Kolonie verbleiben. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, bewegen Embryonen zur Einspritz Gericht, ordnet sie parallel zur Wand desAgarose Trog. </li></ol> 3. Mikroinjektion von Plasmid-DNA <ol><li> Montieren Sie die Mikroinjektor auf einem Magnetständer, die auf einer Eisenplatte sitzt. Montieren der Einspritzhalterung, die den Teil der Mikroinjektor, dass die Nadel hält, an einer Joystick-Mikromanipulator ist. Montieren Sie den Joystick Manipulator an der Eisenplatte, mit einem Magnetständer. Dieses gesamte Set-up auf der rechten Seite von einem Binokular und Positionierung des Injektionshalters, so dass er im Beobachtungsfeld sichtbar ist. </li><li> Platzieren des Einspritzform mit Embryonen unter dem Präpariermikroskop ausgerichtet, daß die vertikale Wand der Agarose Trog nach links. Legen Sie die Nadel in die Injektionshalter und senken Sie die Spitze der Nadel in die Hydra Medium in der Schale. </li><li> Drehen Sie den Knopf der Spritze im Uhrzeigersinn, bis Mineralöl die Spitze der Nadel und einem stetigen Strom von Injektionslösung füllt beobachtet Verlassen der Nadel in die Hydrein Medium. Wenn der Strom zu stark ist, senken Sie den Druck durch Drehen des Knopfes gegen den Uhrzeigersinn. Praxis dieser Schritt auf einen geeigneten Druck, der auf die Größe der Nadelöffnung (dh wie die Nadel in Schritt 1.5 abgeschnitten) hängt routinemßig erhalten. Hinweis: Wenn der Strom zu stark ist, wird der Embryo die Injektion nicht überleben. </li><li> Schauen Sie durch den Binokular, bewegen Sie den Einspritzschale, so dass der erste Embryo ist in der Mitte des Feldes. Bewegen Sie die Nadel, so dass es zu berühren, dass die Embryos. Verwenden Sie den Mikromanipulator, den Embryo mit der Nadel zu durchstechen. Anmerkung: Die senkrechte Wand der Rinne Agarose wird der Embryo ist von der Nadel beiseite gedrückt halten. </li><li> Ermöglichen die Injektionslösung in den Embryo 1 oder 2 s fließen und dann schnell die Nadel entfernen. Wenn der Embryo mehr als eine Zelle, wobei jede Zelle individuell zu injizieren. Zange verwenden, um den Embryo neu auszurichten, um die nächste Zelle mit der Spitze der Nadel auszurichten. </li><li> Nach dem ersten embryo eingespritzt wird, bewegen Sie den Spiegel so, dass die nächste Embryo ist in der Einspritzposition und wiederholen Sie den Vorgang; fortgesetzt, bis alle Embryonen injiziert wurden. </li></ol> 4. Die Züchtung von Embryonen und Brut <ol><li> Bewegen aller injizierten Embryonen in eine Schale mit einigen Hydra, die Hoden haben (dies ist zu gewährleisten, dass alle Embryonen befruchtet). Die Embryonen inkubieren in einer 18 ° C-Inkubator der Embryogenese, während sie weiter. </li><li> Sobald die Nagelhaut Stadium erreicht ist, bewegen jeden Embryo injiziert, um eine individuelle Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hydra Medium gefüllt ist. </li><li> Die injizierten Embryonen für 2 Wochen im Dunkeln inkubieren bei 18 ° C. </li><li> Nach der 2 Wochen Inkubationszeit, überprüfen Sie jeden Embryo injiziert unter dem Binokular. Beachten Sie alle Fälle, in denen die Nagelhaut-Stufen-Embryo aus dem kleinen Stück der elterlichen Gewebe abgelöst und das Eltern Gewebe regeneriert hat. Entfernen Sie diese regeneriert Polypen sofort, so dass es nicht miStaken für ein neues Jungtier. </li><li> Bewegen Sie den Teller des injizierten Embryonen unter einem Aquarium Licht bei RT. Überprüfen Sie die Platten jeden Tag und sammeln Jungtiere. Neue Jungtiere werden weiß, weil die typische rosa Farbe der Hydra-Polypen kommt von der Artemia sie essen. </li><li> Beachten Sie die Jungtiere unter einem Fluoreszenzmikroskop zu Transgen-Expression zu erkennen. </li></ol>

<ol>
	<li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis.">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li><li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra.">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra.">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li><li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra.">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li><li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation.">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li><li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells.">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li><li>David, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra.">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li><li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation.">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li><li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals:+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra.">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li><li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity.">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li><li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells.">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li><li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra.">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li><li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type.">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8 (2009).</li><li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer.">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li><li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra.">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li><li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+an+early+branching+metazoan,+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides.">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li><li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris.">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686 (2010).</li><li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra.">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li><li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers.">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li><li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution.">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643 (2012).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells.">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li><li>Lenhoff, H. M., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra: Research Methods. , 53-62 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hydra routinemäßig reproduziert ungeschlechtlich, erfordert aber Umweltreize zu produzieren Gameten zu beginnen. Diese Stimuli werden für die meisten Arten Hydra gut definiert und kann von Stamm zu Stamm unterscheiden. Ein wesentliches Hindernis für die Herstellung von transgenen Hydra Erhalten Embryonen regelmäßig, weil es schwierig im Labor zu induzieren Hydra sexuelle geworden sein kann. Der AEP-Stamm 25 erzeugt jedoch Gameten leicht im Labor und dies ist der einzi...

Hydra ist verwendet worden, um die Regeneration, Musterbildung zu studieren, und Stammzellen für etwa 250 Jahre 2 Hydra hat eine einfache Körperplan, bestehend aus drei Zelllinien. Ektodermalen Epithelzellen, endodermalen Epithelzellen und interstitiellen. Der rohrförmige Körper wird von der ektodermalen und endodermalen Epithelzellen Abstammungslinien, von denen jede eine einzelne Zellschicht ausgebildet ist. Alle epithelialen Zellen im Körper Spalte mitotischen. Wenn Epithelzellen in den Extremitäten 3 verschoben wird, der Kopf (Mund und Tentakeln) in der mündlichen Ende oder dem Fuß (basal Scheibe) an der aboralen Ende, sie in der G2-Phase des Zellzyklus zu arretieren, und ändern Sie das Schicksal der Zelle 4. Die Zellen der Zwischenlinie liegen in den Zwischenräumen zwischen den Epithelzellen. Diese Linie wird von multipotenten Stammzellen, die in der ektodermalen Epithelschicht des Körpers Spalte 5 angeordnet werden unterstützt. Die interstitielle Stammzellen führen zu drei somatische cell Typen (Nerven, Drüsenzellen, und nematocytes) und die Keimzellen 6,7. Als Mitglied des Stammes Cnidaria, die Schwestergruppe zu allen Bilateria, Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse unter vielzelligen Tiere geteilt vergießen. Bis vor kurzem waren diese Bemühungen durch das Fehlen zuverlässiger Verfahren zur Störung der Gen-Funktion behindert. Doch mit der Entwicklung transgener Methodik 1, sind wir jetzt in der Lage, alle Vorteile der Hydra zu ergreifen, um ein besseres Verständnis der grundlegenden Mechanismen gemeinsam vielzelligen Tiere, wie der Stammzellfunktion, Regeneration und Strukturierung zu gewinnen. Transgene Hydra Linien werden durch Injektion von Plasmid-DNA in Embryonen, die in zufälliger Integration und chimären Ausdruck in einem wesentlichen Häufigkeit der Jungtiere führt gegründet. Eine Linie mit gleichmäßiger Expression in einem bestimmten Abstammungslinie kann durch asexuelle Vermehrung festgestellt werden. Die Fähigkeit, klonal transg propagierenENIC Hydra Linien ist ein Vorteil gegenüber der Mehrzahl von Tiermodellen, die nur durch sexuelle Reproduktion vermehrt werden können. Darüber hinaus können transgene Zellen in vivo leicht aufgrund der Transparenz des Tieres und der Abwesenheit von endogener Fluoreszenzproteine ​​8 verfolgt werden. In den sieben Jahren seit der ersten transgenen Hydra Linien wurden 1 wie Linien für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Expression von fluoreszierenden Proteinen in verschiedenen Zelltypen hat es möglich gemacht, um die Zellbewegung zu verfolgen, Änderungen in der Zellform zu beobachten und zu verfolgen Zellschicksale sowohl in Wildtyp-Bedingungen und nach der chemischen Störung 1,5,9-12. Darüber hinaus ermöglicht die FACS Isolierung von spezifischen Zellpopulationen, die Expression von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen in den verschiedenen Linien. Diese Technik wurde für die Sequenzierung von Stammzell-spezifischen mRNAs und linienspezifische kleinen RNAs 13,14 eingesetzt. Während der Promotoreiner der beiden Hydra Aktin Gene wurde am häufigsten verwendet wird, eine spezifische Promo wenige Zelltyp wurden identifiziert und verwendet, um die Expression von GFP bei transgenen Hydra 9,11,15,16 fahren. In Zukunft werden Zelltyp-spezifische Promotoren für die Beobachtung und Erfassung von spezifischen Zelltyp ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine transgene Ansatz erfolgreich verwendet, um die cis-wirkenden regulatorischen Elemente des Promotors Wnt3 17 definieren. Die Entwicklung transgener Methoden in Hydra bietet eine robuste Ansatz zum Testen der Funktion von Genen durch ektopische Expression, Überexpression und Knockdown. Transgenen Tieren vorgenommen wurden, die fluoreszenzmarkierte Proteine, um die Funktion und zelluläre Lokalisation 18-20 untersuchen auszudrücken. Zusätzlich wurde die Expression von RNA-Haarnadeln in der 3&#39;UTR des GFP-Transgens führt zu Knockdown von Zielgenen 21,22. In diesen Ansätzen GFP ist erforderlich, um zu ermittelnund verfolgen die transgene Gewebe während der Erstellung der transgenen Linie. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass in einigen Fällen das GFP-Molekül würde mit der Funktion des markierten Proteins stören. Eine neuere Untersuchung zeigt, dass Hydra-Gene in einem Operon-Konfiguration angeordnet, das heißt, polycistronische Transkripte hergestellt, die dann durch Transspleißprodukte Führer zusätzlich getrennt und separat 23 übersetzt werden. Mit der Abgabe eines Gens, das ein Protein oder eine RNA-Haarnadel in die Position stromaufwärts von einem Operon und ein fluoreszierendes Protein-Gen in der stromabwärtigen Position kodiert, kann eine transgene Gewebe, ohne den das Protein-oder RNA-Haarnadel-kodierende Gen Schiene. Diese Methode wurde verwendet, um eine RNA-Haarnadel in einem Operon Konfiguration mit DsRed2 um zu erreichen Gen-Knockdown 14 auszudrücken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AEP Hydra Strain</td>
			<td style="width:112px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:576px;">Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High Speed Maxi Kit</td>
			<td style="width:112px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:112px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>CLS294775X50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjection Fish Mold</td>
			<td style="width:112px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FM-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Borosilicate Glass with Filament</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-50-10</td>
			<td>O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:112px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers Forceps, Durmont #5</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scalpel Blade #15</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-822-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron Plate</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:112px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
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generation of transgenic hydra by embryo microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Gründung transgenen Linien Hydra Jungtiere ernähren transgenen alle 2-3 Tage mit Artemia-Nauplien. Jungtiere manchmal nicht für ein oder zwei Tage zu essen nach dem Schlüpfen. Einige neue Jungtiere nie zu essen, und damit wird nicht überleben. Wenn das Jungtier ist entweder in der transgenen ektodermalen (Abbildung 1A) oder endodermalen Epithel, damit das Tier zu knospen und sammeln die Knospen, die den meisten transgenen Gewebe (Abbildung 1B, C)....

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Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

13.9K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi. 

Serie: Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...